单细胞测序--Seurat标准流程
单细胞测序--Seurat（上）--创建对象和数据预处理
需要这三个⽂件：
1）barcodes.tsv：样本中所有的细胞的条码。这⽂件会按照 matrix.tsv 的顺序来排列
[图⽚上传失败...(image-b39475-1621137785277)]新视野大学英语4答案
2）genes.tsv：参照 (reference name)会按照Enmbl、NCBI、UCSC⽹站⽽有所不同， gene symbol会与 matrix.tsv 的顺序⼀致。
image.png
3）：包含 count matrix，⾏名与gene.tsv上的⾏名对应，列名与barcodes.tsv相对应。ntec
image.png
Seurat 内的【Read10X()】函数可以将上述三⽂件 raw data整合为⼀个稀疏矩阵 (spar matrix) ，
1、加载数据 Load the PBMC datat
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
dim(pbmc.data)
[1] 32738 2700
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", lls = 3, min.features = 200)
参数 ：
counts: 未标准化的数据，如原始计数或TPMs
project: 设置Seurat对象的项⽬名称；默认为"SeuratProject"
assay： 与初始输⼊数据对应的分析名称。
meta.data: 添加到Seurat对象的其他细胞⽔平（cell-level）数据。⼀个matrix，其中⾏是cell name，列是附加的元数据字段。lls --该feature⾄少在n个细胞内被覆盖； 该基因（feature）⾄少在3个细胞中被检测到
min.features--规定了⾄少检测到这些feature的细胞。即检测到的基因⾄少有200个细胞才被⽤于分析
看看 pbmc ⾥⾯有啥
pbmc
An object of class Seurat
13714 features across 2700 samples within 1 assay
Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)zey
dim(pbmc) #⾏，列
[1] 13714 2700
head(pbmc@assays))
$RNA
blessing
[4] "AAACCGTGCTTCCG-1" "AAACCGTGTATGCG-1" "AAACGCACTGGTAC-1"
2、标准的预处理流程 Standard pre-processing workflow
1）基于质量控制指标（QC metrics）和删除不需要的细胞作进⼀步分析：
Seurat允许根据任何⽤户定义的标准过滤单元格（cells）。
通常使⽤的QC指标：
1. 每个细胞内被检测到特有的基因（****unique genes****）的数⽬，unique feature会因为数据质量⽽调整。
▲低质量的细胞或空的液滴⼀般含有较少的基因；
繁体中文转换▲细胞双重态或多重态可能呈现异常⾼的基因count值
2. 细胞内被监测到的分⼦的总数⽬（与unique genes⾼度相关）
3. 匹配到线粒体基因组的read的百分⽐
▲低质量/将要死去的细胞经常呈现过度的线粒体污染情况；
▲使⽤function计算线粒体QC metrics, 此function可以计算源于feature集的count值的百分⽐
▲使⽤所有以【MT-】为起始的基因集合，作为线粒体基因集
数据质控
topsage
质控的参数主要有两个：
1.每个细胞测到的unique feature数⽬（unique feature代表⼀个细胞检测到的基因的数⽬，可以根据数据的质量进⾏调整）
2.每个细胞检测到的线粒体基因的⽐例，理论上线粒体基因组与核基因组相⽐，只占很⼩⼀部分。所以线粒体基因表达⽐例过⾼的细胞会被过滤。pbmc[[""]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
"[[" 操作符可以向对象元数据添加列
维持会QC metrics 在 Seurat ：head(pbmc@meta.data)) QC指标存储▲过滤掉拥有 feature count>2500, or < 200 的细胞；
▲过滤掉含有> 5% 的线粒体 count值的细胞
使⽤ VlnPlot（）进⾏可视化****(基因表达、指标、PC分数等)
nFeature RNA: 每个细胞所检测到的基因数⽬，也就是以前版本的nGene；
nCount RNA: 每个细胞测到所有基因的表达量之和，即这些基因数⽬⼀共测到的count数⽬，也就是以前版本的UMI数⽬；
<: 每个细胞所检测到的线粒体基因，即测到的线粒体基因的⽐例。
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", ""), ncol = 3)
image.png
FeatureScatter ⼀般⽤于可视化 feature-feature 关系，使⽤点图查看两个数据之间的相关性，也可以⽤于计算对象的任何东西，i.e. 对象数据中的列，PC分数等。
spillplot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
unique什么意思plot1 + plot2
deity
image.png
选择 200< gene 数⽬ <2500（根据vio lin图1） & 线粒体数⽬ <5%的细胞（根据vio lin 图2）
