河南农业科学,2020,49(12):69-76Journal of Henan Agricultural Sciences
doi :10.15933/jki.1004-3268.2020.12.010
收稿日期:2020-05-22
基金项目：河南省高等学校重点科研项目(13A610550)
作者简介：栗笑阳(1994-)，女，河南洛阳人，在读硕士研究生，研究方向：固体废弃物处理与资源化㊂
E -mail:dazzle_
通信作者：郭夏丽(1966-)，女，河南新乡人，副教授，博士，主要从事环境微生物技术研究㊂E -mail:
不同施氮水平对小麦根际土壤
氨氧化微生物的影响
栗笑阳，郭夏丽
(郑州大学化工学院生态与环境研究所，河南郑州450000)
摘要：为探究农田种植中氮肥施用量减少对小麦根际土壤微生物的影响，以减少氮素环境污染，增加农业种植效益，为可持续发展农业提供理论依据㊂基于Illumina Miq 高通量测序技术，分析不
同生育时期不同施肥水平对小麦根际土壤氨氧化细菌(AOB )和氨氧化古菌(AOA )多样性的影响，并通过冗余分析(Redundancy analysis ,RDA )探究土壤环境因子与氨氧化微生物群落的关系㊂结果
显示，土壤样品中AOB 和AOA 的主要优势菌门分别为变形菌门(Proteobacteria )和未知类群(Un-classified group )㊂在变形菌门中亚硝化螺菌属(Nitrosospira )的相对丰度在2.78%~3.06%，高于亚
硝化弧菌属(Nitrosovibrio )㊂不同生育时期不同施氮量小麦根际土壤AOA 的Chao 指数(58.00~
69.17)均高于AOB ㊂除起身期减氮施肥处理(NR )AOA 的Chao 指数高于不施氮肥处理(CK )和常规施肥处理(TN )外，不同施氮水平对AOA 和AOB 多样性没有显著影响㊂冗余分析表明,AOB 可能主导着根际的硝化作用㊂研究结果表明，小麦根际土壤中存在较多的AOA ,AOA 和AOB 均参与了小麦根际土壤中的硝化作用，而AOB 起主导作用㊂在小麦生长季中，相对于常规施肥，减氮施肥没有明显减少AOA 和AOB 多样性，同时对潜在硝化速率也没有消减作用㊂关键词：减氮施肥；小麦根际土壤；氨氧化细菌；氨氧化古菌；微生物多样性
618是什么意思
中图分类号:S143.16㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)12-0069-08
发型设计学校Effects of Different Nitrogen Levels on Ammonia Oxidizing Microorganisms in Wheat Rhizosphere Soil
LI Xiaoyang,GUO Xiali
(Institute of Ecology and Environment,College of Chemical Engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China)
Abstract :In order to explore the effects of decreasing the amount of nitrogen application on microbial
传记怎么写populations in wheat rhizosphere soil during farmland planting,thus provide theoretical basis for preven-ting nitrogen environmental pollution and increasing agricultural planting benefits,bad on the high-throughput quencing technology of Illumina Miq,the effects of different fertilization levels on the di-versity of ammonia-oxidizing bacteria(AOB)and ammonia-oxidizing archaea(AOA)in wheat rhizosphere soil were analyzed at different growth stages.Redundancy analysis(RDA)was ud to explore the relation-ship between soil environmental factors and ammonia-oxidizing microbial communities.The results showed that the main dominant phylum of AOB and AOA in soil samples were Proteobacteria and unclassified group,respectively.The relative abundance of Nitrosospira in Proteobacteria was 2.78% 3.06%,which
was higher than that of Nitrosovibrio .The Chao indexes (58.00~69.17)of rhizosphere soil AOA of dif-ferent nitrogen application treatements at different growth stages were higher than tho of AOB.Except
河南农业科学第49卷that the Chao index of AOA of the nitrogen reduction treatment was higher than that of no nitrogen treat-ment and conventional fertilizer application treatment at standing stage of wheat,different nitrogen applica-tion levels had no significant effects on the diversity of AOA and AOB.Redundancy analysis indicated that AOB may dominate the nitrification of the wheat rhizosphere.The results indicated that there were more AOAs in the rhizosphere soil of wheat.Both AOA and AOB were involved in the nitrification of wheat rhi-zosphere soil,but AOB may play a leading role in nitrification.In the wheat growing ason,reduction of nitrogen fertilizer did not significantly decrea the diversity of AOA and AOB compared with conventional fertilization,and did not inhibit the potential nitrification rate.
Key words:Nitrogen reduction fertilization;Wheat rhizosphere soil;Ammonia oxidizing bacteria;Am-monia oxidizing archaea;Microbial diversity
㊀㊀氮素循环是土壤生态系统元素循环之一，包括4个主要过程，均由微生物驱动[1]㊂其中，硝化作
用是连接氧化态和还原态无机氮库的重要环节，在土壤的氮素形态转化过程中起着至关重要的作用[2]㊂氨氧化作用是硝化作用的限速步骤，主要由氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)驱动[3-4]㊂AOA 和AOB的数量和群落结构受多种环境因子和农业管理措施的影响[5-6]㊂研究表明，酸性土壤中长期施肥可改变AOA的丰度和群落结构，而在中性或碱性土壤中AOB比AOA更敏感[7]㊂WU等[8]研究小麦中性土壤发现，长期施肥(22a)显著改变AOB的群落结构，而AOA则保持不变㊂在一些恶劣的环境条件下，例如低pH值㊁低温或高温㊁高盐度㊁低氧和低氨含量，土壤AOA可能是氮循环的主要参与者[9]㊂由于氨氧化作用与氮肥利用率㊁氮素淋失和N2O排放等问题直接相关[10]，为此，作为氨氧化作用的主要承担者,AOA和AOB群落对施肥方式的响应机制一直是农业生态系统研究中的热点问题㊂在我国小麦粮食生产中，化肥尤其是氮肥发挥了重要作用㊂但是随着施用量的不断提高，氮肥对粮食产量的贡献率逐渐降低，同时出现了过量施用带来的一系列农田面源污染问题[11-12]㊂鉴于此，为进一步了解减施氮肥措施对农田氨氧化微生物的影响，采用Illumina Miq高通量测序技术，以河南省许昌市小麦季土壤为研究对象，比较小麦不同生长阶段不同施肥水平下小麦根际AOA和AOB群落结构的差异，同时结合土壤理化性质的分析，探讨小麦根际AOA和AOB对减施氮肥方式的响应机制，为科学施肥㊁维护土壤生物肥力和提高土壤质量提供理论依据㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀试验设计与土壤样品采集
试验区位于河南省许昌市建安区苏桥镇石梁河北岸，该区属于大陆性暖温带季风型气候，年平均气温14.6ħ，年平均降水量728.9mm，土壤类型为褐土中壤，土壤基本理化性质如表1所示㊂小麦播种时间为2017年11月5日，施肥水平分别为不施氮肥(CK)㊁常规施肥N(210kg/hm2,TN)和减氮施肥30%(氮肥减少30%,N147kg/hm2,NR)㊂本研究在玉米秸杆还田的基础上进行，磷肥施加量均为127.5kg/hm2(P2O5)，钾肥施加量均为60kg/hm2 (K2O)，小区面积为42m2，每个处理重复3次，试验小区随机排列㊂
表1㊀土壤基本理化性质
Tab.1㊀Basic physical and chemical properties of soil
处理
Treatment土壤深度/cm
Soil depth土壤类型
Soil type pH 硝态氮含量/(mg/kg)
stone coldNO-3-N Content
铵态氮含量/mg/kg
NH+4-N Content
CK0~20褐土中壤7.5612.29ʃ0.330.23ʃ0.09 TN0~20褐土中壤7.3413.92ʃ0.170.31ʃ0.20 NR0~20褐土中壤7.3814.56ʃ0.070.25ʃ0.12
㊀㊀于2018年3月2日(起身期)㊁2018年4月22日(拔节期)和2018年5月29日(成熟期)分别采集3个处理的小麦根际土壤㊂在每个小区对角线5点采样混合为1个土样，每点选取5株㊂采集时先将小麦根系从土壤中挖出，弃去秸秆等杂质和大颗粒土块，抖掉与根系结合松散的土壤，收集与根系结合紧密的土壤作为根际土壤㊂将采集土壤及时放置于含有冰袋的泡沫箱中，带回实验室分为两部分，一部分保存于4ħ，用于测定潜在硝化速率及铵态氮和硝态氮含量㊂另一部分保存于-80ħ，用于分析
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㊀第12期栗笑阳等：不同施氮水平对小麦根际土壤氨氧化微生物的影响
氨氧化微生物的多样性㊂
1.2㊀土壤理化指标测定
采用电位法测定土壤的pH值(水ʒ土=2.5ʒ1)；用含量为2mol/L的氯化钾溶液浸提鲜土样后，采用分光光度法测定土壤的铵态氮㊁硝态氮含量[13]；潜在硝化速率采用氯酸盐抑制法[14]进行测定㊂
1.3㊀土壤微生物多样性测定
根际土样交由上海美吉生物医药科技有限公司进行氨氧化微生物多样性分析㊂氨氧化细菌amoA 基因的引物序列:bamoA1-F:5ᶄ-GGGGTTTCTACTG-GTGGT-3ᶄ和bamoA2-R:5ᶄ-CCCCTCKGSAAAGC-CTTCTTC-3ᶄ[15]；氨氧化古菌amoA基因的引物序列:amoA-F:5ᶄ-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3ᶄ和amoA-R:5ᶄ-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3ᶄ[16]㊂1.4㊀数据处理
原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用Flash软件进行拼接，使用Upar软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用Uchime软件剔除嵌合体㊂利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对fgr/amoA数据库，设置比对阈值为70%㊂通过冗余分析(RDA)评估环境变量与AOA和AOB群落的相关性㊂
采用SPSS19.0软件对土壤理化性质㊁AOA和AOB群落多样性指数(Shannon和Chao)进行多重比较分析(ANOVN LSD,P<0.05)㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀小麦根际土壤pH值及无机氮含量的变化
在小麦起身期和拔节期，根际土壤硝态氮含量随着施氮水平增加而逐渐增加㊂在所有样品中，起身期常规施肥的硝态氮含量最高㊂在成熟期，减氮施肥处理的硝态氮含量低于常规施肥处理，与不施氮肥处理差异不显著(表2)㊂减氮施肥处理的铵态氮含量在小麦的起身期和拔节期低于常规施肥和不施氮肥处理，成熟期与不施氮肥处理接近，而高于常规施肥处理㊂减氮施肥处理的硝态氮含量在起身期和拔节期均低于常规施肥处理且高于不施氮肥处理，而铵态氮含量在起身期和拔节期均低于常规施肥处理和不施氮肥处理，在成熟期3个处理无显著差异㊂
表2㊀小麦根际土壤pH值及无机氮的变化
Tab.2㊀Changes of pH value and inorganic nitrogen in wheat rhizosphere soil
生育时期Growth period
处理
Treatment pH
铵态氮/(mg/kg)
NH+4-N
硝态氮/(mg/kg)
NO-3-N
潜在硝化速率/
[μg/(g㊃h)]
PNR
起身期Standing stage CK7.28ʃ0.03a10.20ʃ0.61b11.65ʃ1.14c0.41ʃ0.09a NR7.29ʃ0.02a 4.94ʃ0.57c43.21ʃ0.17b0.32ʃ0.00a TN7.31ʃ0.07a12.77ʃ0.74a86.77ʃ0.02a0.40ʃ0.11a
拔节期Jointing stage CK7.17ʃ0.03b 6.06ʃ0.75a23.56ʃ0.31c0.42ʃ0.14a NR7.22ʃ0.03ab 3.93ʃ0.75b31.11ʃ0.79b0.41ʃ0.12a TN7.25ʃ0.01a7.65ʃ0.36a34.28ʃ0.39a0.41ʃ0.12a
成熟期Mature stage CK7.27ʃ0.04a 4.22ʃ0.44a19.72ʃ2.85ab0.23ʃ0.01a NR7.26ʃ0.04a 4.94ʃ0.57a17.69ʃ1.26b0.24ʃ0.01a TN 6.83ʃ0.09b 1.72ʃ0.81b24.24ʃ1.35a0.17ʃ0.04a
2016年12月17日
㊀注：同列数据后不同字母表示处理间在0.05水平差异显著，下同㊂
㊀Note:Different letters after the same column of data indicate a significant difference between treatments at the0.05level,the same below.
2.2㊀AOA和AOB群落多样性分析北京留学
经过最小序列数抽平后，每个土样的AOA OTU 数(26633)高于AOB(20510)，再者，小麦不同生育时期的不同施肥处理的AOA的Chao指数均高于AOB(表3)，表明小麦根际土壤中,AOA的数量高于AOB㊂在小麦起身期，减氮施肥处理的AOA的Chao指数高于其他2个处理，在其他生育时期，不同施肥水平对AOA的Chao指数没有显著影响㊂同样，不同施肥水平对AOB的Chao指数也没有显著影响㊂
除了起身期不施氮肥处理的AOB和AOA的Shannon指数类似外，其余处理的AOA Shannon指数均高于AOB㊂不同施氮量对AOA和AOB的Shannon指数没有显著影响㊂
2.3㊀AOA和AOB群落组成分析
土壤样品中所有的AOA OTU归属于4门㊁5纲㊁5目㊁5科㊁5属㊂在门水平上，不同处理的未知类群(Unclassified group)占优势，占总OTU的21.17%~23.52%㊂其次为泉古菌门(Crenarchae-ota)，占总OTU的8.62%~10.68%㊂奇古菌门(Thaumarchaeota)数量最低，占总OTU的0.11%~ 0.12%㊂在减氮
施肥处理中，未知类群的相对丰度和不施氮肥相似，但相对于常规施肥处理有所减少；泉古菌门类群相对丰度在减氮施肥处理中和不施氮
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河南农业科学第49卷
肥处理相似，略高于常规施肥处理㊂奇古菌门类群相对丰度在3个处理变化不大㊂在属水平，所有处理只检测出1个已知属为亚硝化球菌属(Ni-
trososphaera )(归属于奇古菌门)，其相对丰度为
0.07%~0.08%，不同施氮水平对亚硝化球菌属(Ni-trososphaera )相对丰度没有显著影响㊂
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表3㊀土壤AOB 和AOA 群落的多样性分析Tab.3㊀Diversity analysis of AOB and AOA community
生育时期Growth period 处理Treatment AOA 群落AOA community
Chao 指数Chao index
Shannon 指数Shannon index 覆盖率/%Coverage AOB 群落AOB community
Chao 指数Chao index
Shannon 指数Shannon index 覆盖率/%Coverage 起身期
Standing stage
CK 58.00ʃ0.00b 2.64ʃ0.10a 99.9950.50ʃ4.95a 2.66ʃ0.39a 99.98NR 68.67ʃ3.77a 2.64ʃ0.04a 99.9848.92ʃ10.72a
2.32ʃ0.03a 99.98TN
59.75ʃ3.18ab
2.65ʃ0.01a 99.9948.75ʃ6.72a 2.30ʃ0.09a 99.98拔节期
Jointing stage
CK 64.38ʃ6.19a 2.67ʃ0.12a 99.9947.13ʃ1.94a 2.36ʃ0.18a 99.99NR 69.17ʃ4.01a 2.71ʃ0.04a 99.9853.92ʃ0.59a 2.42ʃ0.04a 99.98TN 65.33ʃ4.24a 2.66ʃ0.10a 99.9949.75ʃ3.89a 2.34ʃ0.15a 99.98成熟期
foreignpolicy
Mature stage
CK 65.88ʃ1.24a 2.58ʃ0.19a 99.9944.42ʃ1.30a 2.27ʃ0.10a 99.99NR 63.75ʃ4.60a 2.54ʃ0.07a 99.9942.75ʃ1.06a 2.31ʃ0.14a 99.99TN
60.48ʃ0.53a 2.56ʃ0.13a
99.99
45.75ʃ0.35a
2.30ʃ0.01a
99.99
㊀㊀所有处理的AOB OTU 归属于4门㊁5纲㊁6目㊁8科㊁12属㊂在门水平上，变形杆菌门(Proteobacteria)为优势门，占总OTU 的17.12%~17.57%㊂其次为未知类群(Unclassified group)，占总OTU 的15.53%~
16.00%㊂不同处理对变形杆菌门和未知类群的相对丰度没有显著影响㊂在属水平，所有处理中检测出
capture的已知属为亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio )和亚硝化螺菌属(Nitrosospira )(归属于变形杆菌门)，亚硝化螺菌属的相对丰度(2.78%~3.06%)远高于亚硝化弧菌属(0.05%~0.07%)㊂亚硝化螺菌属的相对丰度在减氮施肥处理中低于常规施肥处理，但差别不明显㊂亚硝化弧菌属的相对丰度在减氮施肥处理中最高，但差别也不明显㊂
2.4㊀在门和属水平上AOA 和AOB 群落结构的变化
如图1所示，在门水平上，随着小麦生长，各处理AOA 的未知类群相对丰度逐渐增加㊂而泉古菌门和奇古菌门的相对丰度在成熟期处于较低水平㊂在减氮施肥处理中,Nitrososphaera 属的相对丰度随着小麦生长逐渐下降，与不施氮肥处理中Ni-trososphaera 属变化一致；而常规施肥处理中,Ni-trososphaera 属的相对丰度在拔节期达到最高㊂
对于AOB，变形菌门的相对丰度在拔节期达到较高水平㊂而未知类群的相对丰度在拔节期处于最低水平㊂亚硝化螺菌属的相对丰度随着小麦生长逐渐增大，在小麦成熟期达到最大，在不同的施氮水平下，亚硝化螺菌属的相对丰度无明显的差别
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㊀第12期栗笑阳等:
不同施氮水平对小麦根际土壤氨氧化微生物的影响
委托行
图1㊀不同生育时期的不同处理AOA (a ㊁b )及AOB (c ㊁d )在门和属上的群落组成
Fig.1㊀Composition of AOA (a ,b )and AOB (c ,d )on the phylum and genus in different treatments at different growth stages
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