土 壤 (Soils), 2021, 53(1): 13–20
mua什么意思①基金项目：国家重点研发计划项目(2018YFC0407604，2016YFD0200302)和国家自然科学基金项目(51779077，91747104)资助。 * 通讯作者作者简介：李文兴 (1993—)，女，山西大同人，硕士研究生，主要从事土壤氮循环微生物研究。DOI: 10.2021.01.003
李文兴, 郑曼曼, 王超, 等. 亚硝化球菌属(Nitrososphaera )可能是酸性土壤硝化作用的重要驱动者. 土壤, 2021, 53(1): 13–20.
亚硝化球菌属(Nitrososphaera )可能是酸性土壤硝化作用的重
要驱动者①
李文兴1,2，郑曼曼1,2，王 超1*，沈仁芳1,2
(1 土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中国科学院大学，北京 100049)
摘 要：选择初始pH 相近的两个酸性土壤 (JX-3和JX-7) 样品进行培养试验，探讨了氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)在酸性土壤硝化过
程中所发挥的作用。结果显示，经过50 d 的培养，JX-7样品硝化速率显著高于JX-3，且明显降低土壤pH 。培养后，两个土壤样品AOB 丰度均增加，但样品间没有显著差异；JX-7土壤AOA 丰度显著增加，而JX-3无显著变化。两个土壤样品AOA 群落组成本身存在分异，但对于同一样品培养前后均无显著分异；AOB 群落组成在两土壤间没有分异，但培养前后分别有分异。培养后，JX-7样品中AOA 优势属Nitrososphaera 和某些未知微生物的个别OTUs 绝对丰度显著增加，而两样品AOB 中Nitrosospira 属的一些OTUs 的绝对丰度均显著增加。因此，所研究的酸性土壤样品中AOA 是硝化作用的主要贡献者，而且AOA 主要通过提高Nitrososphaera 属中个别OTUs 的丰度，而不是整个群落来调控硝化作用。 关键词：Nitrososphaera ；氨氧化古菌；绝对丰度；硝化速率；酸性土壤 中图分类号：S154.3 文献标志码：A
Nitrososphaera May Be A Major Driver of Nitrification in Acidic Soils
LI Wenxing 1,2, ZHENG Manman 1,2, WANG Chao 1*, SHEN Renfang 1,2
(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture , Institute of Soil Science , Chine Academy of Sciences , Nanjing 210008, China ; 2 University of Chine Academy of Sciences , Beijing 100049, China )
Abstract: In this study, samples of two acidic soils (JX-3 and JX-7) with similar initial pH were lecte
d for incubation
experiments to study the roles of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxidizing bacteria (AOB) in the nitrification of acidic soils. The results showed that after 50 d incubation, the nitrification rate of JX-7 sample was significantly higher than that of JX-3, and soil pH was significantly reduced. After incubation, AOB abundances of two soil samples incread, but there was no significant difference between two soil samples; AOA abundance of JX-7 significantly incread, while JX-3 changed insignificantly. AOA community structures of two soil samples were different, but there was no significant difference between incubation time; AOB community structures of two soil samples had the similar community structure, but they were different between incubation time. After incubation, the absolute abundances of dominant AOA (e.g., Nitrososphaera and some unknown microbes) in JX-7 sample significantly incread; the absolute abundances of some AOB such as Nitrosospira in both two samples significantly incread. Therefore, AOA played an important role in nitrification of acidic soil studied; and AOA mainly regulated nitrification by increasing the abundances of individual OTUs such as Nitrososphaera rather than the entire community.
Key words: Nitrososphaera ; Ammonia-oxidizing archaea; Absolute abundance; Nitrification rate; Acidic soils
我国酸性土壤 (pH<5.5) 面积为217.96万km 2，占全国土地面积的22.7%，主要分布在南方热带和亚热带地区，具有丰富的光、热、水、土和生物资源[1]。近年来，由于氨态氮肥过量施用和工业化导致的酸沉
降等人为活动强度的不断增加，土壤酸化程度在加
breast massage剧，酸化面积在不断扩大[2]，严重限制了土壤的生产潜力，并对生态环境造成严重危害。
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，主导的硝化作用不仅是元素生物地球化学循环的重要组成部分[3-5]，也是土壤酸化的重要驱动者[2]，因此
14 土壤第53卷
越来越受到研究人员的重视。经典硝化作用分为两步，第一步是氨氧化过程，即将氨(NH3)氧化为亚硝酸根(NO– 2)；第二步是亚硝酸盐氧化过程，即将NO– 2氧化为硝酸根NO– 3)；其中氨氧化过程是硝化作用的限速步骤，在氮循环中扮演着重要角色[6]。上百年来，氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)一直被认为是土壤氨氧化过程的主要驱动者[7]。但是，2005年Könneke等人[8]在海洋中分离出一株可以进行氨氧化过程的泉古菌，其属于化能无机自养代谢氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)。进一步研究证实，AOB和AOA都参与氨氧化过程，其贡献能力取决于特定
的环境和微生物类群组成[9-10]。例如，AOA和AOB对土壤pH和底物NH3的敏感性不同[11]。Wang等[12]研究发现，由于AOA和AOB在4种环境(稻田、河口、浅滩和湿地)中群落组成明显不同，它们的氨氧化活性差异较大。基于目前对土壤酸化的高度重视，研究认为AOA，尤其是奇古菌和泉古菌，是酸性土壤氨氧化过程主要驱动者，原因在于其能够较好地适应酸性土壤的环境特点，特别是较低土壤pH[11]。然而，一些研究发现，酸性土壤中AOB的某些种属类群(如Neutrophilic bacteria和Nitrosospira cluster 8a等)也可能发挥重要作用[13-14]。即使在相似的土壤pH下，一些特定的AOA或AOB类群也表现较大差异的功能。例如，AOA中Group 1.1a的古菌微生物类群在酸性水稻土壤(pH = 4.8)和森林土壤(pH = 4.2)氨氧化过程中发挥重要的作用，而AOB中Nitrosospira cluster 3-like的微生物类群主要参与酸性旱作土壤(pH = 4.7)中的氨氧化过程[15]。可见，由于受多种因素的影响，AOB和AOA对酸性土壤氨氧化过程的相对贡献仍存在较大争议，发挥作用机理需要进一步阐明。
早期研究认为酸性土壤硝化作用很弱，但是目前很多证据证明了在某些特定的酸性土壤中，其硝化作用也很强烈。基于本实验室前期对我国南方酸性红壤区采集的51个土壤样品[16]，发现样品间硝化作用潜能存在较大差异，本研究选择其中两个pH相近且硝化能力差异较大的土壤样品，期望通过测定氨氧化微生物的丰度和群落组成，分析AOA和AOB在酸性土壤硝化过程中所扮演的角色，并探索发挥作用的机制。
1 材料与方法
1.1 土壤样品
培养试验所用酸性土壤样品分别采自江西鹰潭柑桔园和旱地农田，根据我们前期研究，依次命名为JX-3和JX-7[16]。两个土壤样品起始基本理化性质见表1。
表 1 供试土壤基本理化性质
Table 1 Physicochemical properties of tested soil
土样pH 硝态氮(mg/kg) 铵态氮(mg/kg) 有效磷(mg/kg)速效钾(mg/kg)全碳(g/kg)全氮(g/kg) 全磷(g/kg) 全钾(g/kg)
JX-3
有么说么
4.49 0.10 3.35 49.47 101.44 8.86 0.91 0.50 1.97 JX-7
4.33 0.75 3.15 36.80 237.59 9.53 1.03 0.47 2.28
belly是什么意思
1.2 土壤硝化作用测定
称取50 g过2 mm筛的风干土放于250 ml培养瓶中，加去离子水至最大持水量的40%，用塑料膜将培养
留学生学历认证瓶封口。于28 °C环境中恒温黑暗预培养7 d后，按照N 250 mg/kg干土加入硫酸铵，最后将土壤水分含量调至最大持水量的60%，用塑料膜将培养瓶封口，于28 °C环境中恒温黑暗培养。培养期间每隔1 d 采用称重法补水1次，使土壤水分保持基本不变。培养开始后的0 d和50 d分别取样。
土壤pH采用风干土测定，用pH计(Mettler Toledo FE20, 上海, 中国)在土水比为1︰2.5的条件下测定；土壤铵态氮和硝态氮采用鲜土测定，2 mol/L氯化钾浸提后，用流动分析仪(San++, Skalar, Holland)测定。
1.3 土壤DNA提取和基因丰度测定
称取0.50 g新鲜土壤样品，采用Fast®DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, CA, USA)提取土壤DNA，并采用PowerClean®DNA Clean-up Kit (MoBio, CA, USA)纯化土壤DNA，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。每个土壤样品连续提取两次DNA，将其混合在一起作为一个土壤样品DNA。
在LightCycler 480 Real-Time定量PCR仪(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)上进行实时荧光定量PCR，测定与氨氧化过程相关基因(古菌amoA和细菌amoA)的丰度。氨氧化微生物功能基因古菌amoA和细菌amoA扩增引物分别为Arch-amoA-F (5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′)/Arch-amoA-R (5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′)[8]和Bac-amoA- F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) / Bac-amoA-R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[17]。定量PCR 反应体系为10 μl，包括5 μl TB Gree
nTM Premix Ex
第1期 李文兴等：亚硝化球菌属(Nitrososphaera )可能是酸性土壤硝化作用的重要驱动者 15
Taq™ (2x)，上下引物各0.4 μl ，2 μl DNA 模板(稀释20倍)，2.2 μl 超纯无菌水。定量PCR 反应条件如下：95 °C 预变性30 s ，95 °C 变性30 s ，55 °C 退火30 s ，72 °C 延伸30 s ，40个循环。每个土壤DNA 样品扩增3次。对含有目的基因的质粒进行10倍梯度稀释，于同一条件下进行qPCR ，得到标准曲线。古菌amoA 和细菌amoA 的qPCR 扩增效率分别为94.0%(R 2 = 0.999)和102.5% (R 2 = 0.991)。
1.4 AOA 和AOB 中amoA 基因高通量测序
以提取的土壤DNA 为模板，采用Arch-amoA- F/R 和Bac-amoA-F/R 引物对目的片段进行PCR 扩增。获得PCR 产物后，对其进行纯化、建立文库和文库质检，最后利用454 GS FLX + 仪器进行测序。所有原始下机数据首先运用QIIME 软件识别疑问序列并去除[18]；随后通过QIIME 软件调用USEARCH 检查并剔除嵌合体序列。剩余的高质量序列利用UCLUST 序列比对工具按照97% 的相似度划分操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)，每个OTU 中数量最多的序列被选为该OTU 的代表序列[19]。最后将所有代表序列与NCBI GenBank 中具有分类信息的序列相比对，获得每个OTU 所对应的分类学信息。 1.5 数据处理与统计分析
土壤pH 变化量是培养开始后50 d 的土壤pH 减去0 d 的pH 。土壤硝化速率是单位时间内土壤硝态氮含量的增加量，即培养开始后50 d 的土壤硝态氮含量与0 d 土壤硝态氮含量的差值除以50 d [20]。
AOA 和AOB 前20位OTUs 的绝对丰度是高通
量测序数据中相对丰度前20位OTUs 的相对丰度乘以对应基因的总丰度。
数据处理采用Microsoft Excel 2019，并采用SPSS 22.0进行统计分析。采用单因素方差分析检验AOA 和AOB 中amoA 基因丰度的差异显著性。多重比较采用邓肯(Ducan)法，差异显著性水平为0.05。采用独立样本t -检验分析供试土壤之间土壤pH 变化量、硝化速率，同一供试土壤下培养开始后0 d 和50 d 之间微生物前20位OTUs 绝对丰度差异显著性。应用R 语言vegan 包对微生物群落结构进行主成分分析(principal component analysis, PCA)。作图使用Origin 2019软件。
2 结果厉害的英文
2.1 土壤pH 变化量和硝化速率
培养50 d 后，JX-3土壤pH 基本稳定不变，而JX-7土壤pH 显著下降(图1A)。两个土壤硝化速率存在显著差异，即JX-7 (0.78 mg/(kg·d)) > JX-3 (0.11 mg/ (kg·d)) (图1B)。可见，土壤硝化作用越强，土壤酸化越明显，但不同土壤间存在较大差异。
2.2 土壤AOA 和AOB 的amoA 基因丰度
两个土壤本身AOB 的amoA 基因丰度存在显著差异，但AOA 并没有显著差异(图2)。培养50 d 后，JX-7土壤AOA 的amoA 基因丰度显著增加(图2A)，但是JX-3无显著增加。两个土壤AOB 的amoA 基因丰度也均显著增加，但样品间无明显差异(图2B)。可以推测，AOA 可能是硝化作用的主要驱动者。
(** 表示土壤pH 变化量或硝化速率在不同供试土壤间差异达P <0.01显著水平)
图1 培养50 d 后土壤pH 变化量(A)和硝化速率(B)
Fig. 1 Soil pH changes (A) and nitrification rates (B) after 50 d incubation
2.3 土壤AOA 和AOB 群落分析
土壤氨氧化微生物群落组成分析结果(图3)显示，酸性土壤AOA 群落主要的菌属是Nitrososphaera
和Candidatus Nitrosocosmicus ；AOB 群落主要的菌属是Nitrosospira 、Nitrosovibrio 、Nitrosomonas 和Sphin-gopyxis 。这些菌属相对丰度的占比在样品间存在差异。
saif
16 土 壤 第53卷
(图中小写字母不同表示土壤AOA 或AOB 的amoA 基因丰度在不同土壤间差异达显著水平(P <0.05))
图2 土壤AOA (A)和AOB (B)的amoA 基因丰度
lance
Fig. 2 Soil archaeal amoA (A) and bacterial amoA
(B) genes abundances
图3 土壤AOA (A)和AOB (B)微生物群落组成
Fig. 3 Soil AOA (A) and AOB (B) microbial community compositions
土壤AOA 群落结构分析结果(图4A)显示，主成分1和主成分2分别解释变量方差的49.83% 和29.09%；JX-7和JX-3在主成分轴1上有很好的分异，但是这两个土壤中AOA 群落在培养前后(0 d 和50 d)没有显著分异。土壤AOB 群落结构分析结果(图4B)显示，主成分1和主成分2分别解释变量方差的89.55% 和9.13%；AOB
群落在JX-3和JX-7间没有分异，但这两个土壤AOB 群落在培养前后(0 d 和50 d)表现出很好的分异。
2.4 优势OTUs 的绝对丰度
土壤AOA 绝对丰度前20位OTUs 分析结果(表2)显示，JX-7中otu1138和otu563绝对丰度在培养后显著增加，而JX-3中没有显著变化的
图4 土壤AOA(A)和AOB (B)微生物群落结构主成分分析
Fig. 4 Principal component analys (PCA) for soil AOA (A) and AOB (B) microbial communities
第1期李文兴等：亚硝化球菌属(Nitrososphaera)可能是酸性土壤硝化作用的重要驱动者 17
OTUs。土壤AOB绝对丰度前20位OTUs分析结果(表3)显示，JX-3中otu1618、otu487、otu2315、otu1460、otu1552、otu847、otu830和otu388绝对丰度在培养前后(0 d和50 d)存在显著变化；JX- 7土壤中otu1618绝对丰度在培养前后(0 d和50 d)存在显著变化。
chinadaily 英语点津表2 土壤AOA前20位OTUs的绝对丰度(103 copies/g干土)
Table 2 Absolute abundances of top 20 OTUs of soil AOA
JX-3 JX-7 OTU编号
0 d 50 d 0 d 50 d
分类属水平
otu1138 3.54±2.51 9.13±3.98 9.36±0.69 23.5±3.79 Nitrososphaera
otu563 0.18±0.12 0.48±0.33 5.77±1.03 12.8±2.11 None
otu1134 6.51±6.37 9.45±3.17 0.08±0.12 0.05±0.06 Nitrososphaera
otu803 0.20±0.21 0.65±0.22 1.48±0.53 4.90±2.83 Nitrososphaera
otu236 0.05±0.09 0.04±0.06 0.00±0.00 0.00±0.00 Nitrososphaera
otu72 0.01±0.02 0.07±0.12 1.48±1.04 7.38±6.69 Nitrososphaera
otu46 1.73±2.33 1.71±0.48 0.00±0.00 0.00±0.00 None
otu902 0.70±0.46 0.30±0.40 0.02±0.02 0.00±0.00 None
otu330 0.28±0.26 0.07±0.11 0.15±0.16 0.00±0.00 Nitrososphaera
otu792 0.44±0.56 0.15±0.14 0.16±0.26 0.01±0.02 None
otu453 0.00±0.00 0.00±0.00 0.10±0.05 0.11±0.06 None
otu1348 0.22±0.19 0.28±0.25 0.07±0.13 0.14±0.12 Nitrososphaera
otu1313 0.22±0.06 0.24±0.41 0.03±0.05 0.10±0.18 Nitrososphaera
otu547 0.18±0.17 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 Nitrososphaera
otu437 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.10±0.09 Nitrososphaera
otu1396 0.13±0.11 0.35±0.15 0.36±0.06 0.82±0.37 Nitrososphaera
otu523 0.00±0.00 0.00±0.00 0.02±0.02 0.12±0.09 Candidatus Nitrosocosmicus otu173 0.22±0.24 0.37±0.28 0.12±0.22 0.66±0.58 Nitrososphaera
otu52 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 None
打电话英文怎么说
otu1272 0.00±0.00 0.00±0.00 0.08±0.08 0.77±0.56 Candidatus Nitrosocosmicus 注：None表示该OTU在NCBI数据库中没有比对结果；黑体字的数值表明该OTU绝对丰度在培养时间(0 d和50 d)间存在显著差异(P<0.05)，下表同。
表3 土壤AOB前20位OTUs的绝对丰度(103 copies/g干土)
Table 3 Absolute abundances of top 20 OTUs of soil AOB
JX-3 JX-7 OTU编号
0 d 50 d 0 d 50 d
分类属水平
otu1618 0.00±0.00 62.2±7.30 1.69±1.45 58.0±5.67 Nitrosospira otu487 1.62±0.11 0.06±0.11 1.24±2.14 0.01±0.02 Nitrosospira otu122 0.00±0.00 0.05±0.08 2.69±2.31 2.89±1.68 Nitrosospira otu1975 0.34±0.25 0.00±0.00 0.29±0.51 0.00±0.00 Nitrosospira otu2315 0.37±0.20 0.03±0.05 0.30±0.51 0.00±0.00 Nitrosospira otu1460 0.25±0.06 0.00±0.00 0.30±0.52 0.00±0.00 Nitrosospira otu604 0.06±0.05 0.00±0.00 0.08±0.15 0.00±0.00 Nitrosovibrio otu1552 0.14±0.05 0.00±0.00 0.09±0.16 0.00±0.00 Nitrosospira otu847 0.15±0.03 0.00±0.00 0.09±0.16 0.00±0.00 Nitrosospira otu830 0.10±0.05 0.00±0.00 0.11±0.19 0.00±0.00 Nitrosospira otu846 0.00±0.00 0.01±0.02 0.10±0.08 0.00±0.00 Nitrosospira
