网络出版时间：２０２２－１２－１２１０：２６：２４ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．Ｒ．２０２２１２０９．１４２７．０１３．ｈｔｍｌ
酸性鞘磷脂酶对非酒精性脂肪肝病的作用及
ＰＰＡＲα ＰＧＣ １α通路的影响
方伟进１，２，樊志强１，龚 慧１，刘瑞娇１，宋立莹１，２，王春江１，２，刘世坤１
，２
（中南大学湘雅三医院１．药学部、２．临床药理中心，湖南长沙 ４１００１３）
收稿日期：２０２２－０８－０５，修回日期：２０２２－１０－１８
基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ８１９００３４４）；湖南省卫生计生课题
（
Ｎｏ２０１９０９２６）作者简介：方伟进（１９８７－），男，博士，助理研究员，研究方向：心
血
管药理学，Ｅ ｍａｉｌ：ｆａｎｇｗｅｉｊｉｎ０３＠１２６．ｃｏｍ；
刘世坤（
１９６３－），男，博士，教授，研究方向：心血管药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｌ８６１８４９６＠１２６．ｃｏｍ；
王春江（１９８５－），男，硕士，主管药师，研究方向：肝脏药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｗｏｎｇｃｊ＠ｃｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２１１１０３９
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－００５７－０９中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２ ４７；Ｒ３４４ ５３；Ｒ５７５；Ｒ５７５ ２摘要：目的 观察酸性鞘磷脂酶（ａｃｉｄｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ，ＡＳＭａｓｅ）在高脂诱导小鼠非酒精性脂肪肝病中的作用及对ＰＰＡＲα ＰＧＣ １α通路的调控作用。方法 构建基于Ｃ５７ＢＬ／６背景的ＡＳＭａｓｅ敲除小鼠，与野生型小鼠杂交后，获得封闭
群杂合子（
ＡＳＭａｓｅ＋／－
）用于制备ＮＡＦＬＤ模型。实验分４组，野生型正常对照组（ＷＴ＋Ｃｈｏｗ）、野生型高脂组（ＷＴ＋ＨＦＤ）、ＡＳＭａｓｅ杂合子正常对照组（ＡＳＭａｓｅ
德瑞克 韦伯利＋／－
＋Ｃｈｏｗ）、
ＡＳＭａｓｅ杂合子高脂组（ＡＳＭａｓｅ＋／－
＋ＨＦＤ）。对照组给予基英语b级试题
础饲料饲养１２周，高脂组给予高脂饲料饲养１２周。实验结束后，生化法检测血清和肝脏脂质水平及肝功能变化；油红染色、ＨＥ染色、Ｍａｓｓｏｎ染色和天狼星红染色分别观察肝脏
中脂肪堆积和形态学变化；采用Ａ
ｍｐｌｅｘＴＭ
ＲｅｄＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉ ｎａｓｅ试剂盒检测ＡＳＭａｓｅ活性；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测ＡＳＭａｓｅ、ＰＰＡＲα及其辅激活因子ＰＧＣ １α、下游基因ＣＰＴ１的蛋白表达。结果 ＷＴ＋ＨＦＤ组小鼠出现高胆固醇血症和肝功能异常，肝脏甘油三酯（ＴＧ）水平较ＷＴ＋Ｃｈｏｗ组小鼠明显升高（Ｐ＜０ ０５或Ｐ＜０ ０１），肝细胞出现脂肪变性、空泡样变和肝纤维化，同时肝脏ＡＳＭａｓｅ蛋白表达和活性升高（Ｐ＜０ ０１或Ｐ＜０ ００１），但ＣＰＴ１、ＰＰＡＲα和ＰＧＣ １α蛋白表达较ＷＴ
＋Ｃｈｏｗ组无统计学意义；ＡＳＭａｓｅ＋／－
＋ＨＦＤ组小鼠肝脏ＴＧ
含量较ＷＴ＋ＨＦＤ组明显降低，空泡样变和肝纤维化程度改善，并上调ＰＰＡＲα及其靶基因ＰＧＣ １α和ＣＰＴ１的蛋白表达。结论 ＡＳＭａｓｅ促进肝脂肪变性和肝纤维化，可能与其抑制ＰＰＡＲα ＰＧＣ １α通路有关。
关键词：非酒精性脂肪肝；酸性鞘磷脂酶；过氧化物酶体；肝纤维化；脂肪变性；信号通路
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
非酒精性脂肪性肝病（ｎｏｎ ａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ
，ＮＡＦＬＤ）在成年人群中的发病率达３０％，在肥胖和糖尿病人群中达７０％～８０％［１］
。ＮＡＦＬＤ的
病理过程可从初期的肝内脂肪堆积延续至非酒精性脂肪性肝炎，此时，可观察到明显的肝细胞炎症和死亡，进而肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌，其中肝纤维化在决定患者预后方面起重要作用。
肝脏是体内合成脂质的重要组织，不管是血浆中非酯化的游离脂肪酸，还是从头合成的脂肪酸均可在肝脏中用于脂质合成。肝内过量的脂质堆积开启了Ｎ
ＡＦＬＤ进程。各种病理和生理因素导致肝脏脂肪酸氧化或脂质输出能力较低，或合成能力增强，均造成脂质在肝脏中过度堆积，进而诱导肝细胞氧化应激和炎症等。过氧化物酶体增殖体受体α（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ，ＰＰＡＲα）是调控脂质代谢的重要转录因子，它和其辅激活因子ＰＧＣ １α共同参与脂肪酸摄取、转运、β氧化、脂质合成、酮体生成和脂蛋白与胆固醇代谢等过程。大量研究报道，ＮＡＦＬＤ小鼠肝脏中ＰＰＡＲα及其下游靶基因肉毒碱棕榈酰转移酶（ｃａｒｎｉｔｉｎｅｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１，ＣＰＴ１）、脂肪酸结合蛋白（ｆａｔｔｙａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＡＢＰ１）等蛋白表达和活性明显
降低［２］，激动ＰＰＡＲα可减少氧化应激以及白细胞
介素 ６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６）、肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏ
ｓｉｓｆａｃｔｏｒα
）等炎症因子释放，甚至增加脂质自噬（ｌｉｐｏｐｈａｇｙ）以减少肝脏脂肪堆积，改善ＮＡＦＬＤ［３］
。
ＰＧＣ １α也可以通过调控ＲＯＳ生成，激活ＰＰＡＲα和
ＰＰＡＲγ
，以保护肝脏免受缺血／再灌注损伤［４］。最新研究发现，溶酶体可调控ＰＰＡＲα
，并在脂质代谢以及ＮＡＦＬＤ发生发展中起调控作用［５］。使用ＰＰＡＲα
激动剂非诺贝特促进溶酶体生物合成调控因子转录因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）表达，诱导自噬，减少肝脏脂肪堆
·７
５·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３
Ｊａｎ；３９（１）：５７～６５
积［６］。在ＡＭＬ１２肝细胞使用溶酶体抑制剂或敲除ＴＦＥＢ可明显抑制过氧化物酶体的合成，特别是抑制ＰＰＡＲα及其辅激活因子ＰＧＣ １α的蛋白表达，其下游靶点酰基辅酶Ａ氧化酶１（ａｃｏｘ１）和Ｃｐｔ１ａ的基因转录和蛋白表达也明显降低［７］。但溶酶体调控ＰＰＡＲα介导ＮＡＦＬＤ的具体机制尚不清楚。
酸性鞘磷脂酶（ａｃｉｄｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ，ＡＳＭａｓｅ）是一种广泛存在的细胞溶酶体酶，可水解细胞膜的鞘磷脂（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ，ＳＭ）生成磷酸胆碱和神经酰胺，形成富含神经酰胺的脂筏介导信号转导。大量研究已证实，ＡＳＭａｓｅ参与血栓形成、细胞死亡、血管钙化平滑肌增殖等多种病理过程，并与ＮＡＦＬＤ［８］、糖尿病、心肌梗死等密切相关，但ＡＳＭａｓｅ介导ＮＡＦＬＤ的机制尚不清楚。因此，本研究拟在动物实验中观察ＡＳＭａｓｅ是否通过调控ＰＰＡＲα相关通路以促进ＮＡＦＬＤ发生发展，这对明确ＮＡＦＬＤ发病机制及治疗靶点具体有重要意义。圣诞节的由来 英文
proof是什么意思１ 材料与方法
１．１ 动物 构建基于Ｃ５７ＢＬ／６背景的ＡＳＭａｓｅＫＯ小鼠，许可证号：ＳＣＸＫ（苏）２０１８ ０００３。为了扩大种群将获得的ＡＳＭａｓｅＫＯ小鼠与购自中南大学实验动物中心的野
生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ，ＷＴ），许可证号：ＳＣＸＫ（湘）２０１９ ０００４小鼠进行杂交，获得封闭群，经基因测序后，杂合子（ＡＳＭａｓｅ＋／－）以及ＷＴ小鼠用于制备本实验ＮＡＦＬＤ模型。保障饲料和饮水供应，饲养温度恒定为２５℃，相对湿度为５０％左右，实验过程中关于动物的使用符合中南大学动物伦理委员会的相关规定。
１．２ 主要试剂和仪器 兔抗鼠ＡＳＭａｓｅ（＃３６８７）、ＰＧＣ １α（＃２１７８）、ＣＰＴ１Ａ（＃９７３６１）和ＧＡＰＤＨ（＃５１７４）多克隆抗体购自美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ）公司；兔抗鼠ＰＰＡＲα（＃ａｂ２１５２７０）多克隆抗体购自美国Ａｂｃａｍ公司；谷氨酸转氨酶（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ，＃Ｃ００９ ３ １）、天冬氨酸转氨酶（ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＳＴ，Ｃ０１０ ３ １），血清和肝脏组织中甘油三酯（ＴＧ，＃Ａ１１０ ２ １）、总胆固醇（ＴＣ，＃Ａ１１１ ２ １）、低密度脂蛋白（ＬＤＬ Ｃ，＃Ａ１１３ ２２ １）和高密度脂蛋白（ＨＤＬ Ｃ，＃Ａ１１２ ２ １）等血脂相关试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ＲＩＰＡ裂解液（＃Ｐ００１３Ｂ）、ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒（＃Ｐ００１２Ｓ）、超敏ＥＣＬ化学发光试剂盒（＃Ｐ００１８ＦＭ），ＭｎＳＯＤ活性检测试剂盒（ＷＳＴ ８法，＃Ｓ０１０３），脂质氧化（ＭＤＡ，＃Ｓ０１３１Ｓ）检测试剂盒及ＡＴＰ检测试剂盒（＃Ｓ００２６）均购自碧云天生物技术研究所；其余试剂均为国产分析纯。ＯｎｅＴｏｕｃｈ血糖仪购自强生（中国）医疗器材有限公司；Ｏ
ｐｅｒｅｔｔａ高内涵成像系统购自美国ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司；ＢＩＯ ＲＡＤ１６４ ５０５０电泳仪、ＩＭａｒｋ酶标仪购自美国ＢＩＯ ＲＡＤ公司；Ａｘｉｏ生物显微镜购自德国ＣａｒｌＺｅｉｓｓ公司。
１．３ 方法
１．３．１ ＮＡＦＬＤ模型制备及分组 从方法２ １动物中选取封闭群６～８周龄雄性杂合子和ＷＴ小鼠，共分为４组，分别是野生型正常饮食对照组（ＷＴ＋Ｃｈｏｗ，ｎ＝３）：给予正常基础饲料饲养１２周；野生型高脂饮食组（ＷＴ＋ＨＦＤ，ｎ＝３）：给予高脂饲料（猪油１０％，蛋黄粉１０％，胆固醇１％，胆酸盐０ １２５％，基础饲料７９％，购自广东省实验动物中心）饲养１２周；ＡＳＭａｓｅ杂合子正常饮食组（ＡＳＭａｓｅ＋／－＋Ｃｈｏｗ，ｎ＝６）：给予正常基础饲料饲养１２周；ＡＳＭａｓｅ杂合子高脂饮食组（ＡＳＭａｓｅ＋／－＋ＨＦＤ，ｎ＝６）：给予高脂饲料饲养１２周；每周称量体重，实验结束后收集血清和肝脏组织进行生化测定以及病理检测。１．３．２ 肝功能以及血脂水平测定 根据已发表文献［９］中的方法进行实验。反映肝功能的指标ＡＬＴ、ＡＳＴ和各组小鼠血脂含量包括总胆固醇（ｔｏｔａｌｃｈｏ ｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＴＣ）、甘油三酯（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ＴＧ）和低密度脂蛋白（ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ）的测定均参照试剂盒的方法进行。采用固醇氧化酶－过氧化物酶 ４ 氨基安替比林和酚法（ＣＨＯＤ ＰＡＰ法）检测ＴＣ，采用甘油磷酸氧化酶－过氧化物酶 ４ 氨基安
替比林和酚法（ＧＰＯ ＰＡＰ法）检测ＴＧ，采用磷钨酸镁沉淀法（ＰＴＡ Ｍｇ２＋）和聚乙烯硫酸沉淀法（ＰＶＳ法）检测ＬＤＬ，直接法－选择抑制法检测ＨＤＬ Ｃ。１．３．３ 肝脏脂质含量测定 取各组小鼠肝脏３０ｍｇ，依照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书检测肝脏中ＴＧ、ＴＣ的含量。
１．３．４ 肝脏组织ＳＯＤ活性和ＭＤＡ含量测定 各组样本经相应处理后，依据碧云天生物技术研究所提供的试剂盒检测说明书检测超氧化物歧化酶（ｓｕ ｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性及丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌ ｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）的含量。
１．３．５ 油红染色、苏木精－伊红染色（ＨＥ）、Ｍａｓｓｏｎ染色和天狼星红染色 根据已发表文献中的［９］方法进行实验。从甲醛固定液中取出肝脏，先依次放入７０％～９５％等不同浓度梯度的乙醇中脱水，经二甲笨透明３０ｍｉｎ后开始浸蜡、包埋，最后进行厚度３μｍ切片。切片经脱蜡至水后，分别进行肝脏组织的油红染色、ＨＥ染色、Ｍａｓｓｏｎ染色和天狼星红染色。肝脏病理组织学改变参照《非酒精性脂肪性肝病与相关代谢紊乱诊疗共识（第二版）》中推荐的美
·
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５
·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
国国立卫生院ＮＡＳＨ临床研究网病理工作组指南常规进行的ＮＡＦＬＤ活动度积分（ＮＡＳ）评定和肝纤维化评分，其中脂肪变性（０～３分）、肝小叶炎症（０～３分），气球样变性（０～２分），ＮＡＳ总分０～８分。同时采用ＩｍａｇｅＪ软件计算油红染色面积。１．３．６ ＡＳＭａｓｅ活性测定 根据已发表文献［１０］中的方法进行实验。采用ＡｍｐｌｅｘＴＭＲｅｄＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉ ｎａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，美国）试剂盒检测ＡＳＭａｓｅ活性；每组称取５０ｍｇ肝组织，加入１ｍＬ含５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１乙酸钠（ｐＨ５ ０）的裂解液后进行匀浆，４℃，１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心３０ｍｉｎ，留上清；各取１００μＬ上清液至９６孔板中，以裂解液作为阴性对照，以０ ４ｋＵ·Ｌ－１鞘磷脂酶溶液作阳性对照。每孔加入１０μＬ５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的鞘磷脂溶液，３７℃孵育１ｈ。按说明书制备并加入每孔１００μＬ工作液，避光孵育３０ｍｉｎ后，用酶标仪在５３０－５６０ｎｍ内激发，在５９０ｎｍ处发射波长检测荧光值。
１．３．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测肝脏组织蛋白表达 采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测各组小鼠肝脏中蛋白表达情况；取小鼠肝脏组织各３０ｍｇ，剪碎，加入９倍体积ＲＩＰＡ裂解液，冰上机械匀浆，４℃离心１２０００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ，取上清测蛋白含量；每个样本取３０
μｇ蛋白，经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰氨凝胶（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）电泳分离蛋白，电转至聚偏氟乙烯膜（ＰＶＤＦ膜）上，脱脂奶粉室温封闭１ｈ，一抗４°Ｃ摇晃过夜，加辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记二抗室温孵育２ｈ，最后进行ＥＣＬ化学发光法显色，经凝胶成像系统（ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭＸＲＳ＋ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏ ＲＡＤ）扫描后进行图像数据分析。
１．３．８ 统计学分析 用Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ１２ ５统计软件进行分析并作图。数据用珋ｘ±ｓ表示，统计学分析采用方差分析和Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ检验比较组间差异。
２ 结果
美白祛痘面膜２．１ ＡＳＭａｓｅ＋／－小鼠肝脏中ＡＳＭａｓｅ活性明显降低 ＡＳＭａｓｅ杂合子（ＡＳＭａｓｅ＋／－）小鼠的基因测序结果及野生型对照如Ｆｉｇ１Ａ所示。为进一步观察高脂饮食的作用，检测了各组小鼠ＡＳＭａｓｅ蛋白表达及活性的变化情况，结果如Ｆｉｇ１Ｂ～Ｄ所示，高脂饲养１２周明显增加野生型小鼠肝脏中ＡＳＭａｓｅ蛋白表达和活性（Ｆｉｇ１Ｂ，Ｃ，Ｐ＜０ ０１）。有趣的是，ＡＳＭａｓｅ＋／－＋Ｃｈｏｗ组小鼠肝脏ＡＳＭａｓｅ蛋白表达较ＷＴ＋Ｃｈｏｗ组明显增加（Ｐ＝０ ０２３）；ＡＳＭａｓｅ＋／－＋ＨＦＤ组小鼠肝脏蛋白表达较ＷＴ＋ＨＦＤ组小鼠明显降低（Ｐ＜０ ０１）。在活性变化方面，ＡＳＭａｓｅ＋／－＋ＨＦＤ和ＡＳＭａｓｅ＋／－＋Ｃｈｏｗ组小鼠肝脏ＡＳＭａｓｅ活性分别较ＷＴ＋ＨＦＤ和ＷＴ＋Ｃｈｏｗ组明显降低（Ｆ
ｉｇ１Ｂ，Ｐ＜０ ０１），这提示ＡＳＭａｓｅ杂合子在正常饮食状态下，肝脏中存在反馈机制增加ＡＳＭａｓｅ蛋白表达，这种反馈机制在脂代谢紊乱时的影响降低，但是无论正常饮食或高脂饮食下，ＡＳＭａｓｅ杂合子均降低肝脏中ＡＳＭａｓｅ活性。
２．２ ＡＳＭａｓｅ对高脂饲养小鼠脂质代谢的影响 肝
Ｔａｂ１ ＮＡＳｓｃｏｒｅｏｆｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒ
ＧｒｏｕｐｎＨｅｐａｔｉｃｓｔｅａｔｏｓｉｓＩｎｔｒａｌｏｂｕｌａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＢａｌｌｏｏｎｉｎｇｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＴｏｔａｌｓｃｏｒｅＷＴ＋Ｃｈｏｗ３０．１２±０．０３０．１０±０．０６０．０４±０．０００．２５±０．０８ＷＴ＋ＨＦＤ３２．９４±０．１２２．０３±０．１５１．６８±０．１９６．８７±０．４２ ＡＳＭａｓｅ＋／－＋Ｃｈｏｗ６０．１０±０．０４０．０９±０．０４０．０５±０．０１０．２３±０．０９ＡＳＭａｓｅ＋／－＋ＨＦＤ６１．９８±０．１５１．８８±０．２３１．０３±０．２１４．６９±０．５６＃＆＆ Ｄａｔａａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄａｓ珋ｘ±ｓ． Ｐ＜０ ０１ｖｓＷＴ＋Ｃｈｏｗ；＃Ｐ＜０ ０５ｖｓＷＴ＋ＨＦＤ；＆＆Ｐ＜０ ０１ｖｓＡＳＭａｓｅ＋／－＋Ｃｈｏｗ
．
脏内过度的脂质堆积是ＮＡＦＬＤ的重要病理特征，也是导致疾病进展的重要病因。本研究观察了高脂饲养以及ＡＳＭａｓｅ杂合子对小鼠肝脏脂肪堆积以及全身脂质代谢的影响。结果如Ｆｉｇ２所示，与ＷＴ＋Ｃｈｏｗ比较，ＷＴ＋ＨＦＤ组小鼠血清中ＴＧ水平无明显增加（Ｆｉｇ２Ａ），但肝脏中ＴＧ含量明显增加（Ｆｉｇ２Ｂ，Ｐ＜０ ０１）；ＡＳＭａｓｅ＋／－小鼠无论在正常或高脂饲养状态下，对血清ＴＧ水平均无明显影响；但明显降低肝脏中ＴＧ含量（Ｆｉｇ２Ｂ，Ｐ＜０ ０１）。与ＴＧ不同的是，与ＷＴ＋Ｃｈｏｗ比较，ＷＴ＋ＨＦＤ组小鼠血清ＴＣ水平明显增加（Ｆｉｇ２Ｃ，Ｐ＜０ ０１），但肝脏中ＴＣ水平无明显变化。ＡＳＭａｓｅ＋／－小鼠对高脂状态下升高
的血清ＴＣ水平无影响。
为了确证上述结果，进一步采用油红染色观察了肝脏形态，发现高脂饲养小鼠肝脏中脂滴明显增多，ＡＳＭａｓｅ＋／－小鼠呈现减少的脂滴数量（Ｆｉｇ２Ｇ）。此外，本研究还观察了血清中氧化还原相关指标，如ＳＯＤ活性、ＭＤＡ含量和ＧＰｘ含量等，发现各组差异均无显著性（Ｆｉｇ２Ｈ～Ｊ）。以上结果提示高脂饲养１２周可导致肝脏中甘油三酯堆积，首先诱发的是高胆固醇血症；抑制ＡＳＭａｓｅ活性一定程度降低高脂饲养诱导的肝脏脂肪堆积。
２．３ ＡＳＭａｓｅ对高脂饲养小鼠肝功能及肝脏形态的影响 肝功能异常和肝脏纤维化是中期ＮＡＦＬＤ的重要病理表现，也是进行药物干预的重要病理阶段。因此，本部分实验观察了高脂饲养１２周以及ＡＳＭａｓｅ杂合子对小鼠肝功能和形态的影响。结果如Ｆｉｇ３所示，与ＷＴ＋Ｃｈｏｗ组比较，ＷＴ＋ＨＦＤ组小鼠ＡＬＴ水平明显升高（Ｆｉｇ３Ａ，Ｐ＜０ ０５），ＡＳＴ水平无明显变化（Ｆｉｇ３Ｂ）。相似地，与ＡＳＭａｓｅ＋／－＋Ｃｈｏｗ组比较，ＡＳＭａｓｅ＋／－＋ＨＦＤ组小鼠ＡＬＴ水平明显升高（Ｆｉｇ３Ａ，Ｐ＜０ ０５），ＡＳＴ水平无明显变化（Ｆｉｇ３Ｂ）；这一结果提示，抑制ＡＳＭａｓｅ活性不能降低高脂饲养１２周诱导升高的谷丙转氨酶。
随后观察了肝脏形态变化。ＨＥ染色结果显示，ＷＴ＋Ｃｈｏｗ小鼠肝细胞结构完整，肝小叶清晰，未见病理性组织变化，Ｍａｓｓｏｎ和天狼星红染色结果未显示肝纤维化；ＷＴ＋ＨＦＤ小鼠肝细胞
beetle出现明显的脂肪变性，空泡样变明显，Ｍａｓｓｏｎ和天狼星红染色结果显示肝纤维化；ＡＳＭａｓｅ＋／－小鼠表现出较轻的肝脏脂肪变性，缩小肝内脂肪堆积导致的空泡体积，但使数量增多；肝纤维化程度减轻。根据以上指标进一步完成ＮＡＳ评分发现，与ＷＴ＋Ｃｈｏｗ组比较，ＷＴ＋ＨＦＤ组小鼠ＮＡＳ评分明显升高；ＡＳＭａｓｅ＋／－＋ＨＦＤ组小鼠肝脏的ＮＡＳ评分较ＷＴ＋ＨＦＤ明显降低。综合以上结果，表明ＡＳＭａｓｅ杂合子虽不能有效降低高脂饲养１２周导致的肝酶升高，但一定程度减轻了高脂饲养导致的肝脏脂肪变性及结构损伤。
２．４ ＡＳＭａｓｅ对ＮＡＦＬＤ小鼠肝脏溶酶体的作用及对ＰＰＡＲα通路的影响 ＣＰＴ１是位于线粒体内膜的介导脂肪酸进入线粒体进行β氧化的限速酶，其表达上调可促进脂肪分解氧化，本研究检测了各组小鼠肝脏中ＣＰＴ１蛋白表达情况，结果如Ｆｉｇ４所示，与ＷＴ＋Ｃｈｏｗ组比较，ＷＴ＋ＨＦＤ组小鼠肝脏组织中ＣＰＴ１蛋白表达无明显变化（Ｆｉｇ４Ａ）；ＡＳＭａｓｅ＋／－小鼠，无论是正常饲养还是高脂饮食饲养状态下，均可明显增加ＣＰＴ１蛋白表达，表明ＡＳＭａｓｅ抑制了ＣＰＴ１介导的脂肪酸由胞质向线粒体转移以及后续的β氧化。为验证这一过程是否影响线粒体生物合成，本研究进一步观察了调控线粒体生物合成的重要因子ＰＧＣ １α表达变化，发现ＡＳＭａｓｅ＋／－小鼠肝脏中ＰＧＣ １α的蛋白表达明显上调（Ｆｉｇ４Ａ，４Ｃ）。ＰＧＣ １α除了促进线粒体生物合成外，还是ＰＰＡＲα的辅激活因子，ＰＰＡＲα在脂肪酸摄取、转运以及氧化代谢等过程中发挥重要作用，实验结果显示，高脂饲养１２周对小鼠肝脏ＰＰＡＲα蛋白表达无明显
影响；而ＡＳＭａｓｅ杂合子明显提高ＰＰＡＲα蛋白表达（Ｆｉｇ４Ａ，４Ｄ）。以上结果提示，ＡＳＭａｓｅ抑制脂肪酸氧化，并与线粒体功能以及ＰＰＡＲα ＰＧＣ １α通路有关。
３ 讨论
本研究制备了高脂饲养的ＮＡＦＬＤ小鼠模型，并在此基础上观察ＡＳＭａｓｅ对ＮＡＦＬＤ的作用。结果发现，高脂饲养１２周小鼠出现肝功能异常、肝脏脂肪过度堆积、甚至肝纤维化；与此同时，小鼠肝脏ＡＳＭａｓｅ蛋白表达和活性明显增加，表明ＡＳＭａｓｅ参与ＮＡＦＬＤ的发生发展。ＡＳＭａｓｅ杂合子小鼠虽然未明显改善肝功能，但可减少脂肪在肝脏中堆积，并一定程度减轻肝纤维化，这一过程与改善线粒体摄取脂肪以及激活ＰＰＡＲα ＰＧＣ １α通路有关。
本研究发现，高脂饲养１２周使小鼠出现高胆固醇血症，此时血清中甘油三酯水平无明显变化。与此不同的是，高脂不仅导致小鼠肝脏中过度的胆固醇堆积，而且导致过度的肝脏甘油三酯堆积，这一发现与最近的一项研究结果相似，Ｈｅｉｄａ等［１１］发现，持续激活ＮＦ κＢ明显增加肝脏组织中脂肪的从头合成（如棕榈酸Ｃ１６∶１、油酸Ｃ１８∶１，是合成ＴＧ的重要脂肪酸）和胆固醇的生物合成，但反映在血清指标上，胆固醇的合成增加不仅导致肝脏中胆固醇堆南瓜的英文
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６
·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
Ｆｉｇ２ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＡＳＭａｓｅｏｎｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｈｉｇｈ ＨＦＤｆｅｄｍｉｃｅ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｄｅｓｃｒｉｂｅｄａｓｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓｔｏｄｅｔｅｃｔｓｅｒｕｍＴＧ（Ａ），ＴＣ（Ｃ），ＨＤＬ ｃ（Ｅ），ＬＤＬ Ｃ（Ｆ），ＳＯＤａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｉ），ＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔ（Ｊ），ＧＰｘａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｋ）ａｎｄＬＤＨ Ｌ（Ｌ）ｌｅｖｅｌｓ．ＬｉｖｅｒＴＧ（Ｂ）ａｎｄＴＣ（Ｄ）ｗｅｒｅａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄ．（Ｇ）Ｏｉｌｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｐｅｒ ｆｏｒｍｅｄｔｏｅｘａｍｉｎｅｌｉｐｉｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒｆｅｄｂｙＨＦＤｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔＡＳＭａｓｅｋｎｏｃｋｏｕｔ．Ｓｃａｒｂａｒ：５０μｍ．ＴｈｅｅｘｔｅｎｔｏｆＯｉｌｒｅｄＯｓｔａｉｎｉｎｇ（ａｒ ｅａ）ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＩｍａｇｅＪｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈ）． Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＷＴ＋Ｃｈｏｗ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＷＴ＋ＨＦＤ；＆Ｐ＜０ ０５，＆＆Ｐ＜０ ０１ｖｓＡＳＭａｓｅ＋／－＋Ｃｈｏｗ．
积，还导致血清中胆固醇水平明显升高，但脂质的从
头合成增加并未提升血清中甘油三酯水平。还有研
究发现，在血清ＴＧ正常、高胆固醇血症的母系小鼠
子代更易患ＮＡＦＬＤ及糖尿病［１２］，并且这种易感性可
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
