（ＡＳ），ｓｏａｓｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＡＳａｎｄｍａｘｉｍｉｚｅｔｈｅｉｒｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔ．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＧＳＰｓｏｎｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｐｒｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓａｎｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓｏｆＡ１ＡＳｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＮＦ α，ＩＬ １αａｎｄＣ１ｑｗｅｒｅｉｎｖｅｓ ｔｉｇａｔｅｄｂｙＲＴ ＰＣＲ，ＥｌｉｓａａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｖｉｔｒｏ．ＡｎｄＪＮＫｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇＷｅｓｔ ｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＧＳＰｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ３ｄａｎｄＣ１ｑｏｆＡ１ＡＳｍａｒｋｅｒｓａｎｄｉｎｈｉｂｉ ｔｅｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＪＮＫ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ＧＳＰｓｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｏｆｐｒｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓＩＬ ６，ＩＬ １α，ＩＬ １７ａｎｄＨ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ；ＧＳＰｓ；Ａ１；ＪＮＫ；ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ；ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓ
网络出版时间：２０２２－１２－０９１８：３２：０１ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．Ｒ．２０２２１２０９．１４２８．０１８．ｈｔｍｌ黄芩苷通过ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ κＢ通路抑制链脲佐菌素
色拉英语乐园诱导的阿尔茨海默病大鼠模型神经炎症反应
于文静，杨 苗，贺春香，金怡杰，李 泽，李 平，邓思思，成绍武，宋祯彦
（湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南长沙 ４１０２０８）
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０４０２１
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－００８３－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４ １；Ｒ３２２ ８１；Ｒ３９２ １２；Ｒ７４５ ７摘要：目的 探究黄芩苷对链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）侧脑室注射诱导阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）大鼠模型的脑内炎症和Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４，ＴＬＲ４）／髓样分化因子（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８８，ＭｙＤ８８）／核因子 κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ，ＮＦ κＢ）通路的影响。方法 大鼠侧脑室注射ＳＴＺ构建ＡＤ模型，分假手术组、模型组、黄芩苷低剂量（６０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）、高剂量组（１２０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）、米诺环素组（３６ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）。Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验检测大鼠学习和记忆能力；ｑＰＣＲ检测ＴＮＦ α、ＩＬ ６、ＩＬ １βｍＲＮＡ表达；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ κＢｐ６５、ｐ ＮＦ κＢｐ６５以及胞核／胞质ＮＦ κＢｐ６５蛋白表达水平；免疫荧光检测ＮＦ κＢ入核及小胶质细胞活化情况。结果 与假手术组比较，模型组动物学习记
收稿日期：２０２２－０８－１０，修回日期：２０２２－１１－１５
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ８２０７４０４６，８２００４１８４）；湖南省自然科学基金项目（Ｎｏ２０２１ＪＪ４０３９７）；湖南省教育厅科研
基金重点项目（Ｎｏ２１Ａ０２４１）；湖南省卫生健康委科研项
目（Ｎｏ２０２１０２０４２２５１）
作者简介：于文静（１９９６－），女，硕士，研究方向：中西医结合神经退行性疾病防治研究，Ｅ ｍａｉｌ：１７８６４１９０３４９＠１６３．ｃｏｍ；
成绍武（１９７６－），男，博士，教授，研究方向：中西医结合
神经退行性疾病防治研究，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｓｃｈｅｎｇ＠
ｈｎｕｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ；
宋祯彦（１９８８－），男，硕士，高级实验师，研究方向：中西
医结合神经退行性疾病防治研究，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｓｏｎｇ
ｚｈｅｎｙａｎ２０１３＠ｈｎｕｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ忆能力下降，ＴＮＦ α、ＩＬ ６、ＩＬ １βｍＲＮＡ表达升高，ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８蛋白表达，ｐ ＮＦ κＢｐ６５／ＮＦ κＢｐ６５比值和ＮＦ κＢｐ６５的胞核／胞质比升高，ＮＦ κＢ入核增多，小胶质细胞活化增加。与模型组比较，黄芩苷和
米诺环素干预后动物学习记忆能力明显提高，ＴＮＦ α、ＩＬ ６、ＩＬ １βｍＲＮＡ表达降低，ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８蛋白表达，ｐ ＮＦ κＢｐ６５／ＮＦ κＢｐ６５比值和ＮＦ κＢｐ６５的胞核／胞质比降低，ＮＦ κＢ入核减少，小胶质细胞活化减少。结论 黄芩苷可能通过抑制脑内小胶质细胞活化和ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ κＢ信号通路激活，减轻ＡＤ脑内神经炎症发挥神经保护作用。
关键词：黄芩苷；阿尔茨海默病；链脲佐菌素；ＴＬＲ４；ＭｙＤ８８；ＮＦ κＢ；神经炎症
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
阿尔茨海默病（ＡＤ）是一种以进行性认知功能障碍、记忆功能减退、生活能力下降并伴有精神行为异常为主的神经退行性疾病。我国现有约１０００万痴呆患者，随着中国及全世界老龄化水平的增加，ＡＤ对全世界的经济负担将持续加重，据统计，到２０３０年将达到２ ５４万亿美元，到２０５０年将达到９ １２万亿美元［１］。脑内的慢性炎症是ＡＤ的重要标志，小胶质细胞作为脑内重要的免疫细胞被活化及肿瘤坏死因子 α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α，ＴＮＦ α）、白细胞介素 ６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ ６）、白细胞介素 １β
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １β，ＩＬ １β）等促炎细胞因子被大量释放，使神经细胞凋亡或死亡，最终导致ＡＤ相关的行为［２］。ＴＬＲ４大量表达于小胶质细胞上，通过髓样分化因子（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８８，ＭｙＤ８８）衔接诱导核因子 κＢ（ｎ
ｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ，ＮＦ κＢ）磷酸化和促炎细胞因子产生［３］。
目前证据表明，传统的非甾体类抗炎药虽然能在一定程度上减轻炎症，延缓ＡＤ的进展，降低认知功能的损害，但是其胃肠道并发症等副作用限制了长期作为临床药物使用的可能性，副作用小、性能更安全的天然产品作为ＡＤ患者的临床长期用药是更好的选择，大量研究证明，天然产品对于缓解ＡＤ脑内神经炎症发挥着重要作用［４］。黄芩作为传统中药之一，有清热燥湿、泻火解毒之效，研究表明，黄芩及茎叶具有抗神经炎症、抗氧化应激、缓解兴奋性神经毒性及抑制神经细胞凋亡的作用，可能对ＡＤ的治疗有效。黄芩苷是从黄芩中提取出来的一种黄酮类化合物，已被证明具有抗炎和神经保护作用［５］。课题组前期研究表明，黄芩苷可以通过抑制ＴＬＲ４／ＮＦ κＢ信号通路减轻脂多糖／干扰素γ诱导的ＢＶ２细胞的炎症反应［６］，但是，黄芩苷是否对动物模型有作用还尚不明确。本实验采用大鼠侧脑室注射ＳＴＺ构建ＡＤ大鼠模型，从ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ κＢ信号通路探讨黄芩苷对ＡＤ大鼠脑内炎症反应的作用及神经保护机制。
１ 材料
１．１ 实验动物 ＳＰＦ级ＳＤ♂大鼠５０只，体质量（１５０±２０）ｇ，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：ＳＣＸＫ（湘）２０１９ ０００４，大鼠饲养在湖南中医药大学动物实验中心ＳＰＦ级动物屏障系统中，分笼喂养（每笼３只），使用标准动物饲料和水喂养，恒温（２５±dtd
２）℃，室内明暗周期设置为１２ｈ一循环，实验过程均符合动物伦理学要求（ＬＬＢＨ２０２１０５１００００１）。
１．２ 药物与试剂 黄芩苷（１１０７１５，中国食品药品检定研究院）；ＳＴＺ、米诺环素、山羊抗兔二抗（Ｓ０１３０、Ｈ１９２８０５６、ＡＰ１３２Ｐ，美国Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；β ａｃｔｉｎ、ＩＬ １β、ＩＬ ６、ＴＮＦ α引物由上海生工生物工程有限公司合成；ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（１５５９６０１８，美国Ｔｈｅｒ ｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；逆转录试剂盒（０５２１７５１，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司）；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ预混液（ＭＱ００４０１，上海莫纳生物）；ＮＦ κＢｐ６５／ＲｅｌＡ和ｐｈｏｓｐｈｏ ＮＦ κＢｐ６５／ＲｅｌＡ ｓ２７６抗体（Ａ２５４７和ＡＰ０１２３，武汉ＡＢｃｌｏｎａｌ）；β ａｃｔｉｎ（ＡＦ７０１８，中国Ａｆ ｆｉｎｉｔｙＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＴＬＲ４抗体（Ｄ２２０１０２，生工生物工程（上海）股份有限公司）；ＭｙＤ８８抗体（ＡＨ１０１６３３１１，北京Ｂｉｏｓｓ公司）；ＨｉｓｔｏｎｅＨ３抗体（＃４４９９，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；Ｉｂａ１抗体（０１１ ２７９９１，日本ＷＡＫＯ和光纯药株式会社）；细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒和ＰＭＳＦ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１）（Ｐ００２７和ＳＴ５０６，碧云天生物科技有限公司）；ＲＩＰＡ蛋白裂解液（ｃｗ２３３３ｓ，北京康为世纪生物科技有限公司）；ＢＣＡ试剂盒（Ａ００４４５，杭州联科生物科技股份有限公司）；ＴｒｉｔｏｎＸ １００和抗荧光衰减
封片剂（含ＤＡＰＩ）（Ｔ８２００和Ｓ２１１０，北京索莱宝）；Ｄｏｎ ｋｅｙａｎｔｉ ＧｏａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨｉｇｈｌｙＣｒｏｓｓ ＡｄｓｏｒｂｅｄＳｅｃ ｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ａ３２８４９，美国Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）；通用二步法检测试剂盒（小鼠／兔增强聚合物法检测系统）（ＰＶ ９０００，北京中杉金桥）。１．３ 仪器 石蜡切片机（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，美国）；ＡＩ＋共聚焦激光显微镜（Ｎｉｋｏｎ，日本）；ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳＰｌｕｓ全景组织扫描成像系统（ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ，奥地利）；ＳｏｒｖａｌｌＴＭＬｅｇｅｎｄＴＭＭｉｃｒｏ１７Ｒ微量离心机（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，美国）；Ｃｙｔａｔｉｏｎ３型多功能酶标仪（Ｂｉｏ Ｔｅｋ，美国）；Ｔ１００ＴＭＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ型实时荧光定量聚合酶链式反应扩增仪、Ｍｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮＴｅｔｒａ型电泳槽、ＭｉｎｉＴｒａｎｓ Ｂｌｏｔ型转印槽、ＧｅｌＤｏｃＸＲ＋凝胶成像系统（Ｂｉｏ Ｒａｄ，美国）。
２ 方法
２．１ ＳＴＺ侧脑室注射构建ＡＤ大鼠模型 将２１ ６ｍｇＳＴＺ溶于３００μＬ柠檬酸缓冲液中配置成７２μｇ·μＬ－１的注射液。ＳＤ大鼠禁食１２ｈ后造模，麻醉给予３％戊巴比妥钠，大鼠头部固定于脑固定装置，以《大鼠脑立体定位图谱》的第六版作为参照，以前囟为基准，距离前囟向后０ ８ｍｍ；距颅骨正中线左右各１ ５ｍｍ；距颅骨表面进针３ ７ｍｍ，往除假手术组外大鼠双侧侧脑
室各注５μＬＳＴＺ（２ ４ｍｇ·ｋｇ－１）［７］，假手术组注射５μＬ生理盐水，控制速度１μＬ·ｍｉｎ－１，结束后留针５ｍｉｎ。缓慢出针，伤口及时止血并涂碘伏，最后对伤口手术缝合，将动物放回饲养笼观察，等待自然苏醒。
２．２ 分组与黄芩苷干预 适应性饲养１周后，将５０只大鼠随机分为假手术组、模型组、黄芩苷干预低剂量组（６０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）、高剂量组（１２０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）［２］、米诺环素组（３６ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）［８］５组。造模２ｄ后，进行药物干预治疗１４ｄ，每天给药分为２次，固定时间在早晨９点和晚６点，药物干预组按上述剂量灌胃，其余两组以等体积生理盐水灌胃。
２．３ Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验 药物干预１４ｄ后，进行
水迷宫实验，用Ｓｍａｒｔ３ ０软件记录大鼠的行动轨迹及时间路程数据。（１）定位航行实验：实验前５ｄ，每天固定时间，从４个象限分别将大鼠放进水池中，头面向筒壁，软件设置大鼠寻找平台时间（逃避潜伏期）为１ｍｉｎ。若１ｍｉｎ内爬上平台且停留＞２ｓ，测试结束，记录所需时间；若未爬上平台，则逃避潜伏期记录时间６０ｓ，然后需由实验者将大鼠引导至平台，停留１０ｓ左右进行学习记忆。（２）空间探索实验：实验ｄ６取出平台，再从４个象限位置将大鼠放入水池，记录６０ｓ内大鼠穿梭原平台区域的次数及在第一象限即平台象限停留的时间。freetube
mutualfund
２．４ 取材及保存 行为学测试结束，麻醉大鼠给予３％戊巴比妥钠，固定大鼠四肢暴露腹部，消毒并打开腹腔，注射器吸取提前预冷生理盐水，左心室进针，剪右心耳行心脏灌注，至内脏发白，断头取脑。提前准备冰盒放置取出的脑组织，分离左脑保存固定在４
％多聚甲醛中，右脑海马放入冻存管置于液氮中速冻，后放入－８０℃冰箱保存。
２．５ 免疫荧光检测ＮＦ κＢ核转移情况和小胶质细胞活化情况 石蜡切片，于６５℃烘烤１ｈ，脱蜡后，３％Ｈ２Ｏ２灭活１０ｍｉｎ后，使用０ ３％ＴｒｉｔｏｎＸ １００（ＰＢＳ配制）透膜５ｍｉｎ，然后５％正常驴血清封闭１ｈ，分别使用ＮＦ κＢｐ６５（１∶２００）、Ｉｂａ１（１∶５０）４℃孵育过夜，次日荧光二抗ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（红色，１∶５００）避光室温１ ５ｈ，ＰＢＳ洗３次，每次１０ｍｉｎ，最后滴加抗荧光淬灭剂（含ＤＡＰＩ），加盖盖玻片，使用全景组织扫描成像系统分析。
２．６ ＰＣＲ法检测细胞表型标志物和炎性因子表达 取一半海马组织，加入１ｍＬＴＲＩｚｏｌ研磨，加入氯仿２００μＬ，离心取上清加入５００μＬ异丙醇，离心弃上清加７５％乙醇１ｍＬ，离心晾干乙醇，加ＤＥＰＣ水５０μＬ溶解ＲＮＡ，测定ＲＮＡ浓度，计算调整ＲＮＡ量为每２０μＬ体系１μｇ，逆转录成ｃＤＮＡ，采用ＳＹＢＲ染料法使用Ｂｉｏ ＲｅｄＣＦＸ９６ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ仪进行扩增检测。ＰＣＲ扩增体系为２０μＬ，ｃＤＮＡ２μＬ，上下游引物各１μＬ；程序：９５℃５ｍｉｎ，１循环；９５℃５ｓ，
stefanie什么意思５８℃３０ｓ，４０循环；采用２－ΔΔＣｔ法分析各目的基因
的ｍＲＮＡ相对表达水平，引物序列见Ｔａｂ１。
２．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ κＢ信号通路相关蛋白的表达 另一半海马组织破碎仪破碎后取一部分加入ＲＩＰＡ裂解液（内含磷酸蛋白酶抑制剂），离心，上清即为海马细胞总蛋白；另一部分按照胞核与胞质蛋白抽提试剂盒说明书分别提取出细胞核和细胞质蛋白。使用Ｂ
ＣＡ试剂盒于酶标仪上测定各部分蛋白浓度，标曲Ｒ２
＞０ ９９，计算并配置浓度为２ｇ·Ｌ－１的上样缓冲液，－２０℃保
存。电泳８０Ｖ，３０ｍｉｎ；１００Ｖ，９０ｍｉｎ；２００ｍＡ湿转９０ｍｉｎ至０ ４５μｍ或０ ２２μｍ的ＰＶＤＦ膜；５％脱脂牛奶或５％ＢＳＡ（磷酸蛋白）（ＴＢＳＴ配制）室温摇床封闭１ｈ后孵育一抗（ＴＬＲ４１∶１０００、ＭｙＤ８８１∶１０００、ｐｈｏｓｐｈｏ ＮＦ κＢｐ６５１∶１０００、ＮＦ κＢｐ６５１∶１０００、β ａｃｔｉｎ１∶１００００、ＨｉｓｔｏｎｅＨ３１∶８０００）４℃过夜；次日二抗（１∶８０００）３７℃恒温１ｈ，凝胶成像系统显影成像；全细胞以β ａｃｔｉｎ作为参照，胞核以ＨｉｓｔｏｎｅＨ３为参照，使用ＩｍａｇｅＪ软件对条带进行分析。
２．８ 统计学方法 使用ＳＰＳＳ２６ ０软件进行数据的统计分析，计量资料均以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（ＯｎｅＷａｙＡＮＯＶＡ）及ｔ检验；统计图使用ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈｐａｄ８ ０软件制作。３ 结果
３．１ 黄芩苷对ＡＤ大鼠模型学习记忆能力的影响 大鼠双侧侧脑室注射ＳＴＺ诱导ＡＤ大鼠模型，造
模后连续１４ｄ给予不同浓度黄芩苷（６０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１，１２０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）和米诺环素组（３６ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）灌胃治疗。Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫结
果显示，与假手术组相比，ＡＤ大鼠学习记忆能力有一定程度下降，寻找平台时间增加（Ｐ＜０ ０１）；与模型组相比，黄芩苷低（Ｐ＜０ ０５）、高剂量和米诺环素（Ｐ＜０ ０１）治疗后能明显减少ＡＤ大鼠寻找平台时间，行动目标明确。在空间探索实验中，与假手术组相比，ＡＤ大鼠第一象限停留的时间减少（Ｐ＜０ ０１），且救生平台穿梭的次数明显减少（Ｐ＜０ ０１）；与模型组比较，黄芩苷低（Ｐ＜０ ０５）、高剂量（Ｐ＜０ ０１）和米诺环素（Ｐ＜０ ０５）治疗后ＡＤ大鼠穿梭平台次数和第一象限停留时间增加（Ｆｉｇ１）。
Ｔａｂ１ ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰＣＲ
ＧｅｎｅＦｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（５’ ３’）宕机时间
Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（５’ ３’）Ｌｅｎｇｔｈ／ｂｐmark twain
ＩＬ １βＧＴＧＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧ９１ＩＬ ６ＣＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴ１４２ＴＮＦ αＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣ１１３β
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ＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧ
１４６
cut out
Ｆｉｇ１ ＥｆｆｅｃｔｏｆｂａｉｃａｌｉｎｏｎｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙｏｆＡＤｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
ａ：Ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ；ｂ：Ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；ｃ：Ｌｏｗ ｄｏｓｅ（６０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｄ：Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ（１２０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｅ：Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅｇｒｏｕｐ．Ａ：ＲａｔｔｒａｊｅｃｔｏｒｙｉｎＭｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔ；Ｂ：Ｍｅａｎｅｓｃａｐｅｌａｔｅｎｃｙｏｎｄａｙ５；Ｃ：Ｔｉｍｅｓｐｅｎｔｉｎｔｈｅｔａｒｇｅｔｑｕａｄｒａｎｔｄｕｒｉｎｇｔｈｅｔｅｓｔ；Ｄ：Ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｐａｓｓｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｐｌａｔｆｏｒｍ．＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ
３．２ 黄芩苷对ＡＤ大鼠模型海马区小胶质细胞活化的影响 通过免疫荧光结果显示，假手术组小胶质细胞少有活化，模型组中小胶质细胞活化数量较假手术组明显增多（Ｐ＜０ ０１），且呈现聚集性，多分布在海马ＣＡ２和ＣＡ３区；与模型组比较，在不同剂量的黄芩苷和米诺环素干预后均能抑制小胶质细胞活化（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ２）。
３．３ 黄芩苷对ＡＤ大鼠模型海马区炎症因子表达的影响 采用ｑＰＣＲ检测各组大鼠海马区炎症因子的ｍＲＮＡ表达水平，与假手术组比较，模型组的ＴＮＦ α、ＩＬ ６的表达升高（Ｐ＜０ ０５），ＩＬ １β的表达明显上升（Ｐ＜０ ０１），差异有统计学意义；与模型组比较，黄芩苷低、高剂量和米诺环素处理能有效抑制ＴＮＦ α、ＩＬ ６（Ｐ＜０ ０５）、ＩＬ １β（Ｐ＜０ ０１）的表达，
差异有统计学意义（Ｆｉｇ３）。
３．４ 黄芩苷对ＡＤ大鼠模型海马区ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ κＢ信号通路的影响 ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ κＢ信号通路调控促炎因子的产生，是经典的炎症通路。通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组大鼠海马区ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ κＢｐ６５、ｐ ＮＦ κＢｐ６５的蛋白表达情况，提取各组大鼠海马区全蛋白，与假手术组相比，模型组ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８的蛋白表达量（Ｐ＜０ ０１）及ｐ ＮＦ κＢｐ６５／ＮＦ κＢｐ６５比值明显上升（Ｐ＜０ ０５）。不同浓度的黄芩苷及米诺环素处理能有效抑制ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８的表达量，减少ＮＦ κＢｐ６５活化（Ｐ＜０ ０１），差异有统计学意义。
提取各组大鼠海马区胞质和胞核蛋白，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＮＦ κＢ蛋白表达情况，结果见Ｆｉｇ４。与假手术组相比，模型组ＮＦ κＢｐ６５胞核／胞质比增加（Ｐ＜０ ０５），说明ＮＦ κＢｐ６５入核增加，差异有统计学意义。不同浓度黄芩苷处理可降低ＮＦ κＢｐ６５胞核／胞质比，减少ＮＦ κＢｐ６５入核，米诺环素处理后与黄芩苷高剂量组干预结果一致（Ｐ＜０ ０１）（Ｆｉｇ４）。
３．５ 黄芩苷对ＡＤ大鼠模型海马区ＮＦ κＢ核转移的影响 免疫荧光结果显示，假手术组组织中ＮＦ κＢｐ６５主要位于胞质，而在模型组中ＮＦ κＢｐ６５出现散点状入核的细胞数量增多，在不
同剂量的黄芩苷或米诺环素干预下，一定程度上抑制ＮＦ κＢｐ６５进入细胞核，与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果一致（Ｆｉｇ５）。
４ 讨论
ＡＤ是以进行性认知功能障碍和记忆功能减退为主的神经退行性疾病，多种证据表明脑内炎症是ＡＤ的重要病理学特征。ＳＴＺ是一种亚硝基脲衍生物，会优先破坏胰岛β细胞，通常用作糖尿病实验动物模型。研究表明，侧脑室注射低剂量ＳＴＺ可引起脑胰岛素信号稳态的破坏及脑内葡萄糖代谢障碍但不会诱发全身性糖尿病，这与散发型阿尔茨海默病（ＳＡＤ）的病理学变化类似，其主要病理改变包括突触功能障碍、ｔａｕ过度磷酸化、神经炎症、大脑中Ａβ沉积、氧化应激和胰岛素抵抗等引起脑内神经元损失，最终导致学习记忆能力进行性缺失及认知行为改变［９］，目前已成为较为成熟的ＡＤ动物模型。相较于ＡＰＰ／ＰＳ１小鼠，从基因层面促进Ａβ生成模
Ｆｉｇ２ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｂａｉｃａｌｉｎｏｎｍｉｃｒｏｇｌｉａａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｏｆＡＤｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
ａ：Ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ；ｂ：Ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；ｃ：Ｌｏｗ ｄｏｓｅ（
６０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｄ：Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ（１２０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａ ｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｅ：Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅｇｒｏｕｐ．Ａ：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｇｌｉａｍａｒｋｅｒＩｂａ１（ｒｅｄ）ｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ＮｕｃｌｅｉｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｂｙＤＡＰＩ（ｂｌｕｅ）．Ｂ：ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｉｎＣＡ２／ＣＡ３ｒｅｇｉｏｎｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０ ０１ｖｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ
拟ＡＤ发病过程，本模型模拟的是在ＡＤ发病类型中占比约为９０％的ＳＡＤ，更具有代表性。ＳＴＺ侧脑室注射的ＡＤ模型已被证明脑内ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６等促炎因子升高［１０］及ＮＦ κＢ的上调［１１］，说明神经炎症在此ＡＤ模型中是关键性病理特征。本研究探索了黄芩苷对ＳＴＺ侧脑室注射损伤的ＡＤ大鼠模型的脑内炎症的抗神经炎症作用，发现黄芩苷可以对ＡＤ大鼠起到神经保护作用，在水迷宫实验中，模型组大鼠找到平台的时间明显较正常组、药物组及阳性对照组延长，说明ＳＴＺ侧脑室注射损伤了大鼠的学习记忆能力，而给与黄芩苷的ＡＤ
大鼠的逃避潜
Ｆｉｇ３ ＥｆｆｅｃｔｏｆｂａｉｃａｌｉｎｏｎＴＮＦ α，ＩＬ ６ａｎｄＩＬ １βｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｏｆＡＤｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）ａ：Ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ；ｂ：Ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；ｃ：Ｌｏｗ ｄｏｓｅ（６０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｄ：Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ（１２０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａ ｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｅ：Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅｇｒｏｕｐ．＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓｓｈａｍｏｐｅｒａ ｔｉｏｎｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕ
课外活动英语
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Ｆｉｇ４ ＥｆｆｅｃｔｏｆｂａｉｃａｌｉｎｏｎＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ κＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｏｆＡＤｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）ａ：Ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ；ｂ：Ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；ｃ：Ｌｏｗ ｄｏｓｅ（６０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｄ：Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ（１２０ｍｇ－１·ｋｇ－１·ｄ－１）ｂａ ｉｃａｌｉｎｇｒｏｕｐ；ｅ：Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅｇｒｏｕｐ．Ａ，Ｂ：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＴＬＲ４，ＭｙＤ８８，ｐ ＮＦ κＢｐ６５，ＮＦ κＢｐ６５，ｎｕｃｌｅｕｓＮＦ κＢｐ６５，ｃｙｔｏｐｌａｓｍＮＦ κＢｐ６５ｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０
１ｖｓｓｈａｍｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ
