ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｏｄｏｃｙｔｅｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙＨＧａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＥｄＵｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅｔｈｅｒａ ｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅｏｎｐｏｄｏｃｙｔｅｄａｍａｇｅｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙＣＣＫ ８，ａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎＨＧ ｉｎｄｕｃｅｄｐｏｄｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＧＳＨａｎｄＧＳＳＧｋｉｔｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉ ｃｒｏｓｃｏｐｙｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｏｄｏｃｙｔｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｏｄｏｃｉｎａｎｄＧＰＸ４ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄａｔ２４ｈ，ａｎｄｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＡＣＳＬ４ａｎｄＰＴＧＳ２ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ．ＢｅｒｂｅｒｉｎｅｃｏｕｌｄｎｏｔａｂｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮｒｆ２，ＨＯ １，ＧＰＸ４ａｎｄｐｏｄｏｃｉｎ，ａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＰＴＧＳ２ａｎｄＡＣＳＬ４．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｂｅｒｂｅｒｉｎｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍ ｐｒｏｖｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＲＯＳａｎｄＧＳＨｉｎｐｏｄｏｃｙｔｅｓｕｎｄｅｒＨＧｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｒｅｂｙａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｂｌｉｓｔｅｒ ｉｎｇ，
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｈｒｉｎｋａｇｅａｎｄｏｔｈｅｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆＨＧ ｉｎｄｕｃｅｄｐｏｄｏｃｙｔｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｄｏｃｙｔｅｓｄｅｃｒｅａｓｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓａｄｅａｔｈｍｏｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄａｐｏｐｔｏ ｓｉｓ，ｔｈａｔｉｓ，ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅｃａｎａｌｌｅｖｉａｔｅｔｈｅｏｃ ｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｔｈｉｓｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｂｙｍｅｄｉａｔｉｎｇｔｈｅＮｒｆ２／ＨＯ １／ＧＰＸ４．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ；ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ；ｐｏｄｏ ｃｙｔｅｓ；ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ；ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ
网络出版时间：２０２１－２－２５１６：５６ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２１０２２５．１５３５．０３６．ｈｔｍｌ
ＹＡＰ ｃ Ｍｙｃ信号通路抑制涉及冬凌草甲素抗神经胶质瘤作用
王 宸，陈 爽，马晓娇，校 欢，邱红梅
（重庆医科大学药理学教研室，重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 ４０００１６）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０３．０１９
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０３－０４０３－０６中国图书分类号：Ｒ２８４．１；Ｒ３２９．２５；Ｒ７３０．２６４；Ｒ７３９．４１；Ｒ９７７．６
摘要：目的 探讨冬凌草甲素对神经胶质瘤Ｕ８７细胞增殖、迁移和凋亡影响及其作用机制是否涉及抑制ＹＡＰ ｃ Ｍｙｃ信号通路。方法 采用ＭＴＴ法检测冬凌草甲素对Ｕ８７细胞活力的影响；划痕试验检测细胞迁移能力；流式细胞术检测细胞凋亡率；实时荧光定量ＰＣＲ检测ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｂｃｌ ２、Ｂａｘ、ＹＡＰ、ｃ ＭｙｃｍＲＮＡ的表达；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｂｃｌ ２、Ｂａｘ、ＹＡＰ、ｐ ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７）、ｃ Ｍｙｃ蛋白的表达。结果 冬凌草甲素呈剂量依赖性抑制神经胶质瘤Ｕ８７细胞增殖（Ｐ＜０ ０５）及迁移（Ｐ＜０ ０１）；流式细胞术分析细胞凋亡率明显增加（Ｐ＜０ ０１）；ｃａｓｐａｓｅ ３ｍＲＮＡ和蛋白表达均增高（Ｐ＜０ ０５），Ｂｃｌ ２／ＢａｘｍＲＮＡ和蛋白表达均明显降低（Ｐ＜０ ０５），ＹＡＰ、ｃ Ｍｙｃ的ｍＲＮＡ和蛋白表达均明显降低（Ｐ＜０ ０５），ｐ ＹＡＰ的蛋白表达增高（Ｐ＜０ ０５）。结论 冬凌草甲素可促进神经胶质瘤Ｕ８７细胞增殖、迁移并促进胶质瘤细胞凋亡，
alteration
收稿日期：２０２０－１０－１７，修回日期：２０２０－１２－２５
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ３１４００８８１）；重庆市自然科学基金资助项目（
Ｎｏｃｓｔｃ２０１７ｊｃｙｊＡＸ０２１１）；重庆医科大
学药学院科研资助项目（ＮｏＹＸＹ２０１９ＳＤＴＲ０１）
英语六级成绩查询入口作者简介：王 宸（１９９６－），女，硕士生，研究方向：神经药理学，Ｅ ｍａｉｌ：ｘｃｈｅｎ１９９６＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ；
邱红梅（１９７８－），女，博士，副教授，研究方向：神经药理
学，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｑｉｕｈｏｎｇｍｅｉ＠ｃｑｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ其机制可能与抑制ＹＡＰ信号通路相关。
关键词：冬凌草甲素；神经胶质瘤Ｕ８７细胞；增殖；迁移；凋亡；ＹＡＰ；ｃ Ｍｙｃ
big city开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
胶质瘤（ｇｌｉｏｍａ）是一种起始于大脑或脊柱神经胶质细胞的常见肿瘤，由于其发病位置的特殊性，具有较高的发病率和死亡率等特点［１］。胶质瘤通常采用的治疗方法为手术切除、放疗和化疗，但尽管采取了这些干预措施，高级别肿瘤患者平均总生存期不到１５个月，治疗现状与手术预后仍不乐观［２］。中药药物治疗具有巨大的应用前景，研究证明部分中药单体成分对恶性肿瘤能产生
一定的治疗效果［３］，因此研究有效中药单体成分是否具有抗胶质瘤作用可为其治疗提供新的药物治疗思路。
冬凌草甲素（ｏｒｉｄｏｎｉｎ，ＯＲＩ）是冬凌草的主要活性成分，是一种有生物活性的贝壳杉烷型四环二萜类天然有机化合物，具有抗感染、抗炎等作用，研究报道其还对多种癌症具有抗癌活性［４］，被认为是一种有前景的肿瘤治疗药物。研究证明，ＯＲＩ可通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞来抑制神经母细胞瘤
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）：４０３－９
细胞的生长［５］。目前，关于ＯＲＩ抗肿瘤的分子机制研究逐渐进入研究者的视野，已有研究证明ＯＲＩ可以通过调控ＡＭＰＫ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ、Ｗｎｔ／β ｃａｔｅｎｉｎ［６］、Ｂｃｌ ２［７］等信号通路发挥抗恶性肿瘤作用。Ｙｅｓ相关蛋白（Ｙｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，ＹＡＰ）是Ｈｉｐｐｏ通路中最核心的转录共激活因子，有研究发现其在胶质瘤中高表达，下调ＹＡＰ可以抑制胶质瘤增殖、侵袭和迁移［８］，而ＯＲＩ是否可以作用于ＹＡＰ Ｈｉｐｐｏ通路而抑制胶质瘤尚未见报道。因此，本研究采用神经胶质瘤Ｕ８７细胞研究ＯＲＩ抗神经胶质瘤作用并探讨其可能机制是否涉及抑制ＹＡＰ ｃ Ｍｙｃ信号通路。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 细胞株 神经胶质瘤Ｕ８７细胞购自Ａｍｅｒｉ ｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）。
１．１．２ 药物与试剂 ＯＲＩ（ＴａｒｇｅｔＭｏｌ，批号Ｔ２７９０ １，纯度９９ ５％）；二甲基亚砜ＤＭＳＯ（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号９９Ｇ００１１００）；ＤＭＥＭ培养基（重庆塞米克生物科技有限公司，批号２０１９１９０７）；胎牛血清（重庆塞米克生物科技有限公司，批号２０１９０６０２）；ＭＴＴ（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号０３２６
０１０１６０）；ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号０１０２２０２００７１３）；ａｌｐｈａＴｕｂｕｌｉｎ兔多克隆抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，批号０００６８５１０）；ＹＡＰ兔多克隆抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，批号０００７６５７７）；ｐ ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７）兔多克隆抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ，批号３６ｚ２５３９）；ｃ Ｍｙｃ兔多克隆抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，批号０００８１１８８）；ｃａｓｐａｓｅ ３／Ｐ１７／Ｐ１９兔多克隆抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，批号０００８１８０１）；Ｂａｘ兔多克隆抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，批号０００８２３６３）；Ｂｃｌ ２兔多克隆抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，批号ＧＴ１０００６４）；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＴａＫａＲａ，批号ＡＩＦ２３６８Ａ）；Ｂａｘ、Ｂｃｌ ２、ｃａｓｐａｓｅ ３、ＹＡＰ、ｃ ＭｙｃｍＲ ＮＡ引物（ＴａＫａＲａ，批号ＣＩＰＸ２８１）；ＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓ ｔｅｒＭｉｘ（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号７Ｅ４８１Ｂ９）。
１．１．３ 仪器 细胞培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ）；细胞培养超净台（安泰技术有限公司）；倒置荧光显微镜（Ｎｉ ｋｏｎ）；低温离心机（Ｔｈｅｒｍｏ）；湿式转膜仪（Ｂｉｏ Ｒａｄ）；垂直电泳槽（Ｂｉｏ Ｒａｄ）；酶标仪（Ｔｈｅｒｍｏ）；凝胶成像系统（Ｂｉｏ Ｒａｄ）；扩增仪（Ｂｉｏ ＲａｄＳ１０００ＴＭＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）；定量ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ ＲａｄＣＦＸＣｏｎ ｎｅｃｔＴＭＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ）。
１．２ 方法
１．２．１ 细胞培养 神经胶质瘤Ｕ８７细胞用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基培养（含１００ｋＵ·Ｌ－１青霉素
和０ １ｇ·Ｌ－１链霉素）。孵箱内条件为：恒温３７℃，ＣＯ
２
浓度为５％。全部实验均采用对数生长期的细胞进行实验。
１．２．２ ＯＲＩ的配制 取ＯＲＩ干粉溶解于ＤＭＳＯ中，配制成浓度０ １ｍｏｌ·Ｌ－１的药物用０ ２２μｍｏｌ·Ｌ－１微孔滤膜过滤除菌后，避光储存于－２０℃低温保存。
１．２．３ ＭＴＴ检测细胞增殖情况 取对数生长期的Ｕ８７细胞悬液（６×１０７·Ｌ－１）接种于９６孔细胞培养板中，每孔１００μＬ（６×１０３个／孔）。置３７℃、５％
ＣＯ
２
细胞培养箱中１２ｈ后，换用含不同浓度ＯＲＩ的ＤＭＥＭ培养基继续培养，每个药物浓度设置６个复孔。分别继续培养２４ｈ、４８ｈ后，弃培养基，每孔加入２０μＬＭＴＴ，置孵箱中孵育４ｈ后，加１５０μＬＤＭ ＳＯ并剧烈震荡１０ｍｉｎ，用酶标仪检测４９０ｎｍ波长处各孔的ＯＤ值。药物对Ｕ８７细胞生长的抑制率／％＝［１－（实验给药组－空白组）／（阴性对照组－空白组）］×１００％。
１．２．４ 划痕试验检测细胞侵袭变化 消化对数生长期的Ｕ８７细胞制成单细胞悬液，均匀接种于６孔板中，观察细胞融合７０％－８０％时，使用无菌枪头垂直于板面均匀竖直划线，吸取旧培养液用ＰＢＳ清洗２次。空白组加入无血清ＤＭＥＭ培养基，实验组加入含不同浓度ＯＲＩ的无血清ＤＭＥＭ培养基，对细胞进行拍照记录此时状态。放入细胞培养箱培养，于给药１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ后拍照记录划痕修复情况，使用ＩｍａｇｅＪ计算细胞迁移率。细胞迁移率／％＝［（刚划痕后划痕面积－培养不同时间点后划痕面积）／刚划痕后划痕面积］×１００％。１．２．５ 流式细胞术检测凋亡 取对数生长的神经胶质瘤Ｕ８７细胞，接种于６孔板中，待细胞贴壁后，每孔分别加入２ｍＬ用ＤＭＥＭ完全培养基稀释的ＯＲＩ（终浓度０、５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１）。药物作用４８ｈ后，收集细胞，使用ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ双重染色法检测细胞凋亡情况。其中以０μｍｏｌ·Ｌ－１处理的Ｕ８７细胞作为对照组。
１．２．６ 荧光实时定量ＰＣＲ（ｑＲＴ ＰＣＲ） 取对数生长期的神经胶质瘤Ｕ８７细胞，接种
于６孔板中，待细胞贴壁后，每孔分别加入２ｍＬ用ＤＭＥＭ完全培养基稀释的ＯＲＩ（终浓度０、５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１）。药物作用４８ｈ后，使用ＴＲＩｚｏｌ提取细胞总ＲＮＡ，用Ｔｈｅｒｍｏ微量核酸测定仪检测ＲＮＡ浓度后置于－８０℃保存。用试剂盒逆转录ＲＮＡ以合成ｃＤＮＡ，用ＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ进行荧光定量ＰＣＲ反应。实验结果通过
瘦的英语怎么读·
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相对定量方法分析，计算２－ΔΔＣｔ值，比较组间基因表达水平是否具有统计学意义。
Ｔａｂ１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓ（５＇ｔｏ３＇）
ＧｅｎｅｎａｍｅＦｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒＲｅｖｅｒｓｅｄｐｒｉｍｅｒ
β ａｃｔｉｎＣＣＡＣＧＡＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴ
ｃａｓｐａｓｅ ３ＧＡＡＧＣＧＡＡＴＣＡＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＴ
ＢａｘＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＧＧＣＡＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣ
Ｂｃｌ ２ＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴ
ＹＡＰＣＣＧＴＴＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＣＴＴＴＴＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＣ
ｃ ＭｙｃＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＴＧＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴ
１．２．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 取对数生长期的神经胶质瘤Ｕ８７细胞，接种于１０ｃｍ培养皿中，待其长到８０％－９０％左右，每瓶分别加入用ＤＭＥＭ完全培养基稀释的ＯＲＩ（终浓度０、５、１０μｍｏｌ·Ｌ－１）７ｍＬ。药物作用４８ｈ后，弃掉培养液，用ＰＢＳ冲洗两次并消化，加细胞裂解液（ＲＩＰＡ∶ＰＭＳＦ∶磷酸蛋白酶抑制剂＝１００∶１∶２）于冰上裂解１５ｍｉｎ，４℃、１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ。取上清液用ＢＣＡ法测定蛋白浓度后，加上样缓存液煮沸变性１０ｍｉｎ。蛋白样品进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳，蛋白转移至ＰＶＤＦ膜上，ＴＢＳ
Ｔ洗膜３次，５％ＢＳＡ室温封闭２ｈ，一抗４℃孵育过夜，ＨＲＰ标记山羊抗兔二抗（１∶７０００）室温孵育２ｈ，ＴＢＳＴ洗膜３次每次１０ｍｉｎ，加ＥＣＬ发光试剂显影，采用ＩｍａｇｅＬａｂ４ １进行图像分析。以目的蛋白与α Ｔｕｂｕｌｉｎ或ＧＡＰＤＨ条带灰度比值表示目的蛋白的相对表达水平。
１．２．８ 数据处理 实验数据均以珋ｘ±ｓ表示，使用ＳＰＳＳ２０ ０软件进行统计分析。实验数据进行单因素方差分析（Ｏｎｅ ｗａｙＡＶＯＮＡ）。组间比较用ｔ检验。使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８软件作图。
２ 结果
２．１ ＯＲＩ对神经胶质瘤Ｕ８７细胞增殖作用的影响 ＯＲＩ（结构式如Ｆｉｇ１Ａ）２．５μｍｏｌ·Ｌ－１、５μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１和２０μｍｏｌ·Ｌ－１处理Ｕ８７细胞２４ｈ和４８ｈ后，对细胞的增殖能力进行检测，结果如Ｆｉｇ１显示，ＯＲＩ浓度在１０μｍｏｌ·Ｌ－１作用２４ｈ、４８ｈ对Ｕ８７增殖均有明显抑制作用（Ｐ＜０ ０１）。利用ＳＰＳＳ２０ ０计算ＯＲＩ作用Ｕ８７细胞２４ｈ后ＩＣ
５０
值为
１２ ０５μｍｏｌ·Ｌ－１，ＯＲＩ作用Ｕ８７细胞４８ｈ后ＩＣ
５０
值为１０ １７μｍｏｌ·Ｌ－１，根据上述结果，选用５μｍｏｌ·Ｌ－１和１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＯＲＩ处理Ｕ８７细胞４８ｈ作为实验组，以０μｍｏｌ·Ｌ－１处理的Ｕ８７细胞作为对照
怎样用英语介绍自己
组。
Ｆｉｇ１ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＯＲＩｏｎｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＵ８７
ｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
Ａ：ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＯＲＩ；Ｂ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＯＲＩｏｎｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＵ８７
ｃｅｌｌｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜
０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（０μｍｏｌ·Ｌ－１）
２．２ ＯＲＩ对神经胶质瘤Ｕ８７细胞迁移作用的影响
如Ｆｉｇ２所示，ＯＲＩ浓度在５μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ
·Ｌ－１时可明显抑制Ｕ８７细胞迁移。随着ＯＲＩ浓度
的增高，Ｕ８７细胞的迁移速度明显下降，且作用时间
越长，迁移速度下降越明显（Ｐ＜０ ０１）。
中级口译２．３ ＯＲＩ对神经胶质瘤Ｕ８７细胞凋亡的影响 流
式细胞仪检测细胞凋亡结果如Ｆｉｇ３Ａ、Ｂ所示，与对
照组相比，５μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＯＲＩ处理
组的总凋亡率明显增加（Ｐ＜０ ０１）。
２．４ ＯＲＩ对神经胶质瘤Ｕ８７细胞ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｂｃｌ
２／Ｂａｘ的ｍＲＮＡ及蛋白表达的影响 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、
ｑＰＣＲ结果如Ｆｉｇ４所示，与对照组相比，５μｍｏｌ·
Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＯＲＩ处理组ｃａｓｐａｓｅ ３ｍＲＮＡ
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）
Ｆｉｇ２ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＯＲＩｏｎｍｉｇｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＵ８７ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ａ：ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＯＲＩｏｎｍｉｇｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＵ８７ａｔｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ（１００×）；Ｂ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｒａｔｅ． Ｐ＜
０ ０５
，
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（０μｍｏｌ·Ｌ－１
）Ｆｉｇ３ ＥｆｆｅｃｔｏｆＯＲＩｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇｌｉｏｍａＵ８７ｃｅｌｌｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
hipp Ａ：ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＯＲＩｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；Ｂ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅ．宠物狗掉进粪坑
及蛋白表达均增加（Ｐ＜０ ０５），Ｂｃｌ ２／ＢａｘｍＲＮＡ及蛋白表达均降低（Ｐ＜０ ０５）。
２．５ ＯＲＩ对神经胶质瘤Ｕ８７细胞ＹＡＰ ｃ Ｍｙｃ通路的影响 如Ｆ
ｉｇ５所示，与对照组相比，５μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＯＲＩ处理组ＹＡＰ、ｃ ＭｙｃｍＲＮＡ
及蛋白表达均降低（Ｐ＜０ ０５）；磷酸化ＹＡＰ蛋白表达增加（Ｐ＜０ ０５）。３ 讨论
胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，ＷＨＯ将胶质瘤分为Ｉ至ＩＶ级，其中高级别胶质瘤具有侵袭性更强，发展更为迅速，致死率高的特点，目前尚无确
切可靠且不易复发的治疗手段［９］
target
。ＯＲＩ作为唇形科
冬凌草所提取的二萜类活性成分，可以对小细胞肺癌、胃癌等多种肿瘤产生抑制作用。研究显示ＯＲＩ可以使胶质瘤细胞周期停滞于Ｓ期，也可以诱导结
肠癌细胞自噬产生凋亡［１０］
，但其是否可以通过
ＹＡＰ Ｈｉｐｐｏ通路抑制神经胶质瘤增殖并促进其凋亡尚未见报道。本研究采用神经胶质瘤Ｕ８７细胞研究ＯＲＩ的抗胶质瘤作用，并对其涉及的相关通路进行探索。
Ｈｉｐｐｏ信号通路在调节细胞增殖和调控组织器官功能中起着至关重要的作用，可参与癌症、心血管
疾病等多种疾病的发生、发展［１１］
。高密度Ｇ蛋白偶
联受体被磷酸化的ＭＳＴ１／２刺激后可激活Ｈｉｐｐｏ信
号通路［１２］。在Ｈｉｐｐｏ信号通路中，磷酸化的ＭＳＴ１／
２可将Ｌ
ＡＴＳ１／２磷酸化，被磷酸化的ＬＡＴＳ通过在１４ ３ ３蛋白上形成结合位点来促进ｐ ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７）、ｐ ＴＡＺ（Ｓｅｒ８９）在胞质聚集，减少细胞核内
转录发生［
１３］
。ＹＡＰ残基Ｓ１２７磷酸化后的ｐ ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７）不能进入细胞核内，因此研究ＹＡＰ磷酸化的水平可以作为检测Ｈｉｐｐｏ通路活化状态一种途径。大量的临床证据表明，ＹＡＰ在多种类型的恶性肿瘤中均过表达或高度活化，明显促进其增殖、迁移，减少凋亡，在治疗人类癌症中已经成为一种有吸
引力潜在的药物治疗靶点［１４］
。ｃ Ｍｙｃ是ＹＡＰ的转
录靶标，ＹＡＰ在进入细胞核后，ＹＡＰ／ＴＥＡＤ复合物在细胞核内通过与ｃ Ｍｙｃ的启动子和第一内含子相
关联而直接调节ｃ Ｍｙｃ的转录［１５］
。已有研究证实，
ｃ Ｍｙｃ作为一个典型的促癌基因可参与调控细胞周期进程，与细胞生长、分化、代谢和凋亡有关，它的过
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６０４·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）
Ｆｉｇ４ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＯＲＩｏｎｃａｓｐａｓｅ ３，Ｂｃｌ ２／ＢａｘｍＲＮＡａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＵ８７ｃｅｌｌｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
Ａ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＯＲＩｏｎｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ ３ａｎｄＢｃｌ ２／ＢａｘｉｎＵ８７ｃｅｌｌｓ
；Ｂ，Ｃ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＯＲＩｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｃａｓｐａｓｅ ３ａｎｄＢｃｌ ２／ＢａｘｉｎＵ８７ｃｅｌｌｓ． Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（０μ
ｍｏｌ·Ｌ－１）表达与多种肿瘤的发生和转移有密切关系
［１６］
。但
ＹＡＰ Ｈｉｐｐｏ通路过度活化是否与神经胶质瘤发生具有相关性，且ＯＲＩ是否具有可以通过干预该通路发挥抗胶质瘤作用尚未见报道。本研究结果显示将ＯＲＩ作用于Ｕ８７细胞后，细胞生存率呈浓度依赖性降低，细胞迁移被抑制；流式细胞术显示细胞凋亡率增加；
ｃａｓｐａｓｅ ３凋亡信号通路中ｃａｓｐａｓｅ ３ｍＲＮＡ和蛋白表达水平增加，Ｂｃｌ ２／ＢａｘｍＲＮＡ及蛋白表达水平降低，提示Ｏ
ＲＩ对Ｕ８７
细胞产生了促凋亡作用；Ｆｉｇ５ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＯＲＩｏｎＹＡＰａｎｄｃ ＭｙｃｍＲＮＡａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＵ８７ｃｅｌｌｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
Ａ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＯＲＩｏｎＹＡＰａｎｄｃ ＭｙｃｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎＵ８７ｃｅｌｌｓ；Ｂ，Ｃ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＯＲＩｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＵ８７ｃｅｌｌｓ． Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（０μｍｏｌ·Ｌ－１
）
拜师学艺的意思Ｈｉｐｐｏ信号通路中总ＹＡＰ和下游ｃ Ｍｙｃ的ｍＲＮＡ表达水平均降低，ＹＡＰ、ｐ ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７）、ｃ Ｍｙｃ蛋白检测显示，ＹＡＰ总蛋白和ｃ Ｍｙｃ蛋白表达水平降低，ＹＡＰ的Ｓ１２７位点磷酸化水平增高，提示ＯＲＩ可能通过促进ＹＡＰ蛋白磷酸化使其停留在胞质内与１
４ ３ ３结合形成复合物，发生泛素化使其水解，从而抑制其通路的活性，使进入细胞核的ＹＡＰ减少，因此也减少了下游ｃ Ｍｙｃ的表达，提示ＯＲＩ促神经胶
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０４·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｍａｒ；３７（３）
