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Effects of Gardeniae and Sojae Praeparati Decoction（栀子豉汤）on the expression
of AT1receptor mRNA of spontaneously hypertensive rats
balLi Chen，Zhao Jing，Feng Wei，Wang Xinguo，Tian Yilong
（College of Traditional Chine Medicine，Hebei Medical University，Hebei Key Lab of Laboratory
Animal Science，Shijiazhuang050091）
Objectives：To obrve the effects of Gardeniae and Sojae Praeparati Decoction（GSPD）on blood pressure（BP）and the expression of AngiotensinⅡtype1receptor（AT1R）mRNA of spontaneously hypertensive rats（SHR）and to preliminarily explore its possible mechanism of preventing diabetic cardiovascular dia．Methods：50SHR were randomly divided into model group，GSPD4g crude drug/kg，8g crude drug/kg，16g crude drug/kg group and captopril group（2mg/kg）according to BP．The indirect tail-artery blood pressure measure-ment was ud to measure BP，the expression of AT1R mRNA in aortic and myocardium tissue was detected by rever transcription polymer-a chain reaction（RT-PCR）method．Results：After GSPD8g crud
e drug/kg and16g crude drug/kg group treated for4weeks，the BP of SHR was decread significantly，the expression of AT1R mRNA in aortic and myocardium was down-regulated．Conclusions：GSPD can de-crea BP，down-regulate the expression of AT1R mRNA in aortic and myocardium tissue，thus GSPD may have potentially clinical values in the prevention and treatment of diabetic cardiovascular dia．
Key words Gardeniae and Sojae Praeparati Decoction（栀子豉汤）；spontaneously hypertensive rats（SHR）；angiotensinⅡtype1receptor （AT1R）
左归丸对谷氨酸盐诱导小鼠神经毒性的保护作用
张永平，于立坚，马润娣，房娟芝
（广东海洋大学食品科技学院海洋药物研究与开发重点实验室，湛江524025）
摘要目的：研究左归丸对谷氨酸（Glutamic acid）诱导的小鼠神经毒性的可能保护作用。方法：除对照组外，其他组小鼠接受谷氨酸单钠（monosodium glutamate，MSG，4．0g/kg）灌胃，每日一次，连续给药10日。第11天起，治疗组分别接受左归丸（1．0，2．0，4．0g/kg，ig），之后通过小鼠的行为学实验、脑海马组织病理学和脑组织抗氧化指标检测，分析MSG所引起的功能和形态学上的
变化以及左归丸的可能的保护作用。结果：左归丸显著修复MSG对小鼠行为、脑海马组织病理的不良影响，明显升高小鼠脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）水平，而显著降低丙二醛（MDA）。结论：左归丸对MSG诱导的小鼠神经毒性有一定的保护作用，其保护作用机制可能与其改善小鼠抗氧化指标水平，增强机体的抗氧化能力有关。
旅游 英语关键词左归丸；兴奋性神经毒性；神经保护作用
基于兴奋性氨基酸（主要是谷氨酸）释放而产生的兴奋性毒性是一个谷氨酸或其他兴奋性氨基酸引起中枢神经系统神经细胞死亡的过程［1，2］，这一过程涉及到多种急、慢性退行性疾病，如局部或全脑缺血缺氧、机械性脑损伤、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏舞蹈症、脊髓小脑变性和肌萎缩侧索硬化等［3，4］。而中医学认为上述多种神经退行性疾病是一种全身性疾病，其主要病理基础是肾虚，以肾中精气不足，髓海空虚为本，治疗强调固本清源，以补肾填精法治其本，补肾为先，精气并重。左归丸源自《景岳全书》，由熟地、山茱萸、枸杞子、山药、川牛膝、鹿角胶、龟板胶、菟丝子组成。左归丸方为真阴不足、精髓内
亏所致诸证而设，具有滋肾填精之功。其加减方临床上多用于老年性痴呆、糖尿病视网膜变性等疾病的治疗。已有研究显示左归丸对小鼠阿尔茨海默症模型的症状有明显改善作用［5］，能够改善高浓度皮质酮所致的海马神经细胞内学习记忆相关信号转导蛋白的异常表达［6］。因此，研究左归丸对谷氨酸盐诱导的小鼠神经兴奋性毒性的可能的保护作用，应该是很有意义的。
1材料与方法
1．1试验药物左归丸购自河南省宛西制药股份有限公司，国药准字z41020696，批号：090406。
1．2动物SPF级KM小鼠，19 21g体质量，购自湖南长沙市开福区东创实验动物科技服务部，生产许可证号：SCXK（湘）2009-0012，室温23ʃ1ħ，12h照明，12h黑暗。实验中严格遵守中华人民共和国科学技术部2006年颁发的实验动物福利和使用原则［7］。
1．3试剂L-谷氨酸单钠（monosodium glutamate，MSG，上海伯奥生物技术有限公司，批号：09008）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程有限公司，批号：A001-1）；丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程有限公司，批号：20091020）；戊巴比妥钠（上海化学试剂有限公司）；甲醛（分析纯，广州化学试剂厂）。
1．4仪器Y迷宫刺激器（江苏省张家港市生物医学仪器厂，型号：MG-3）；倒置显微镜（德国Leica公司，型号DMIRB 110）。
1．5方法除对照组外，小鼠接受MSG（4．0g/kg，ig），连续10天。从第11天起，左归丸低、中、高剂量治疗组分别灌胃左归丸1、2、4g/kg体重，正常组与模型组均灌胃同体积蒸馏水，共持续30天。然后进行行为学实验、病理组织学检查和脑组织抗氧化指标检测。
1．5．1爬绳试验爬绳实验用来检测动物的高空协调运动能力［8］。在末次左归丸处理后第10d分别将小鼠逐一置于一条长2m，距地面高1．5m的绳子中间，观察3min内小鼠的握绳爬行情况。能握住且能爬绳者，记为会爬；握不住绳或能握住但不能爬绳者，记为不会爬。同时记录每鼠爬行长度及掉下次数。toll
1．5．2Y-迷宫试验末次左归丸处理后第5天开始Y-迷宫实验。Y-迷宫分辨学习记忆实验按许氏提供的方法进行［9］。每日同一时间段进行，实验时房间保持安静、黑暗，连续7日，第41日再重复1次。结果记录20次反应中的正确反应次数。1．5．3病理组织形态学检查实验结束时（末次左归丸处理后第42d），每组任取4只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg （5mg/ml）进行麻醉，10%中性福尔马林溶液心脏灌流牺牲动物。取脑，置10%中性福尔马林溶液中固定2 3天。通过海马区全脑冠状面切片，片厚4μm，常规HE染色。光镜下检查海马区组织病理学变化。
1．5．4脑组织抗氧化指标检测末次左归丸处理后第2天，每组任取3只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg（5mg/ml）进行麻醉，10%中性福尔马林溶液心脏灌流牺牲动物，取脑、匀浆、低温离心，制备成10%的匀浆液，采集的试验样品置于-80ħ保存待检。按试剂盒使用说明分别检测样品中的SOD和MDA含量。
1．6统计学分析实验结果以均数ʃ标准差（xʃSD）表示，采用SPSS13．0软件进行组间方差分析，爬绳实验结果用卡方检验进行统计分析。P＜0．05被视为差异有统计学意义。
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2结果
2．1左归丸对MSG诱导的小鼠高空协调运动能力的影响模型组小鼠仅能抓住绳而不能在绳上爬行者，或者不能抓牢绳而掉下地者及掉下次数较对照组明显增多，差异显著（分别为P＜0．01和P＜0．05），而爬行长度则明显减少（P＜0．01）。MSG （4．0g/kgˑ10）+左归丸（4．0g/kgˑ30）组能自如爬绳的小鼠较MSG组明显增多（P＜0．05），接近对照组，见表1。
表1左归丸对MSG诱导的小鼠高空协调运动能力损害的修复作用（珋
xʃs）
组别
鼠数
cu（只）
剂量
（g/kg）
能爬动物
（只）
爬行长度
（cm）
掉下次数
（次）
对照1111＊＊72．26ʃ27．610
模型12521．32ʃ17．17＊＊0．69ʃ0．66*
左归丸121．0528．35ʃ15．020．52ʃ0．60
左归丸112．0736．29ʃ21．630．49ʃ0．73
左归丸124．09*33．36ʃ14．480．37ʃ0．37与模型组比较*P＜0．05，＊＊P＜0．01（下同）
2．2左归丸对MSG诱导的小鼠Y-迷宫分辨学习记忆能力损伤的影响如表2所示，小鼠给予MSG（4．0g/kgˑ10，ig）对其Y-迷宫分辨学习记忆能力有明显的损伤。在末次左归丸处理后第5 11天，以及第41天，模型组小鼠的Y-迷宫分辨学习记忆能力明显低于对照组。然而，左归丸（4．0g/kg）组小鼠的Y-迷宫分辨学习记忆能力明显高于模型组，与对照组接近。结果显示，左归丸对MSG诱导的小鼠Y-迷宫分辨学习记忆能力损伤有一定的修复作用。
表2左归丸对MSG诱导的小鼠Y-迷宫分辨学习记忆能力下降的保护作用（珋
xʃs）
组别
剂量
（g/kg）
瓶子的英语正确反应次数（次）
电话会议英文第5天第6天第7天第8天第9天第10天第11天第41天
对照10．38ʃ1．9012．69ʃ1．2014．30ʃ1．45*16．76ʃ1．6817．46ʃ1．1718．23ʃ1．0418．54ʃ1．0118．46ʃ1．23
模型10．41ʃ1．9111．43ʃ1．7412．57ʃ1．5513．00ʃ1．17＊＊13．91ʃ1．33＊＊14．66ʃ1．42＊＊14．66ʃ1．42＊＊15．50ʃ1．74＊＊左归丸1．010．09ʃ1．9311．36ʃ1．6412．91ʃ1．7113．55ʃ1．8713．91ʃ2．1214．73ʃ1．7415．00ʃ1．6815．09ʃ1．35
左归丸2．010．36ʃ1．6412．54ʃ2．3112．82ʃ2．5013．91ʃ1．49*14．55ʃ1．49*15．27ʃ1．9015．36ʃ1．8315．82ʃ1．20
左归丸4．011．10ʃ2．6612．30ʃ1．7414．50ʃ3．07*14．80ʃ2．37*15．90ʃ1．93＊＊16．00ʃ1．26＊＊16．40ʃ2．21＊＊16．40ʃ1．42＊＊
2．3左归丸对MSG诱导的脑病理组织损伤的保护作用众所周知，脑组织中对损伤最敏感的区域是海马，海马在学习记忆中起着重要的作用。结果显示，MSG能诱导小鼠海马损伤，引起细胞水肿、神经元变性坏死和组织增生（图1B）。然而随着左
归丸剂量的增加，左归丸治疗组小鼠海马的神经元损伤逐渐减轻（图1C、D、E）
。
图1左归丸对MSG诱导的小鼠脑海马区病理组织损伤的保护作用（ˑ50）
A：对照组；B：模型组；C：左归丸（1．0g/kg）；D：左归丸（2．0g/kg）；E：左归丸（4．0g/kg）。变性和坏死：←
英语6级查询2．4左归丸对MSG诱导的小鼠脑组织SOD和MDA水平异常
的影响与对照组比较，在末次左归丸处理后第2天模型组小
鼠脑组织中SOD活性降低，MDA含量增加（P＜0．01）；与MSG
组比较，左归丸组高、中剂量组SOD活性明显升高，MDA含量
显著降低（P＜005或P＜0．01），提示左归丸具有明显的抗氧
化作用，改善自由基在体内的过量代谢，见表3。
表3左归丸对MSG诱导的小鼠脑组织SOD和MDA水平异常的
影响（珋
xʃs）
组别
剂量
（g/kg）
SOD含量
（U/mg）
MDA含量
（mol/mg）
对照165．13ʃ14．6118．13ʃ1．67
模型84．36ʃ14．35＊＊27．03ʃ1．23＊＊左归丸1．0105．19ʃ6．5625．19ʃ3．76
左归丸2．0146．50ʃ22．68*20．17ʃ1．56*
左归丸4．0172．03ʃ20．31＊＊19．36ʃ3．01*
英语小对话
3讨论
兴奋性氨基酸（主要是谷氨酸）外源性引入或内源性释放而产生的兴奋性中毒是谷氨酸或其他兴奋性氨基酸引起中枢神经系统神经细胞死亡的过程［2］。兴奋性毒性涉及各种神经退行性疾病以及中风损伤的缺血半影。在诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化、艾滋病病毒（HIV）相关痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、青光眼这些疾病中，通常假定神经元慢性暴露于中等浓度谷氨酸，进而引发较长时间的谷氨酸受体兴奋性增高，最终造成在正常发育中也出现的细胞凋亡［10，11］。脑组织细胞的异常损伤或凋亡引起机体相应功能的下降。众所周知，脑组织中对损伤最敏感的区域是海马，海马在学习记忆中起着重要的作用，其神经细胞的损伤往往导致学习记忆能力的下降；而运动神经区域细胞的损伤引起机体运动失调等。本研究结果发现过量外源性谷氨酸盐的摄入能够引起小鼠的学习记忆能力下降等多种行为紊乱以及脑海马组织病理损伤等兴奋性神经毒性，产生各种与脑损伤和
神经退行性疾病相似的病理变化，这与本课题组以往的研究结果一致［8，12］；而左归丸的应用能有效修复MSG对小鼠运动能力、学习记忆能力的不良影响，修复脑海马组织的病理损伤。
各种急性和退行性疾病的细胞学终点是神经元死亡。尽管很多独立的机制能启动神经元损伤，但有令人的信服的证据表明造成细胞内钙离子浓度增加的谷氨酸受体（GluRs）的过度刺激和氧化自由基损伤这两个事件起着决定性的作用［10］。事实上这两个事件是相互紧密联系的［10，11］。
SOD是是生物体内最有效的氧自由基清除系统，保护组织免受超氧自由基的攻击［13］。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要的调节作用，它能清除氧自由基，来维持细胞的完整与
正常功能。SOD首先将超氧自由基转化为H
2
O
2
，再与其他酶系
统协同作用最终转化为O
2
［13］。本实验结果显示，在脑组织中匀浆中，治疗组随着左归丸剂量的升高，SOD含量出现了显著性提升，因此左归丸显示出了抗氧化效能。
MDA是体内重要的脂质氧自由基，为未饱和脂肪代谢产物，强毒性，可与蛋白质和核酸结构上氨基、巯基等发生交联作用，从而破坏蛋白质和核酸的正常结构，并使之丧失原有功能。MDA含量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度以及细胞受损程度。本研究以检测MDA含量来作为反映左归丸抗氧化功能的一个重要佐证，发现MDA含量在脑组织匀浆中均出现了明显的降低，推测可能随着左归丸治疗促使脑组织中SOD水平上升之后，导致体内的氧自由基逐渐减少，因此体内MDA的产生量出现降低的趋势，从而减弱了MDA对细胞的损伤，以致产生抗氧化效果，保护脑组织神经细胞免受氧化损伤。本文报告的结果表明，左归丸能改善MSG诱导的小鼠兴奋性神经毒性引发的行为学障碍，修复MSG对学习记忆的关键部位-海马区的损伤作用。因此，左归丸有明显的抗兴奋性毒性效果，这种效果可能与其改善小鼠抗氧化指标水平，增强机体的抗氧化能力有关。
中医学认为AD等多种神经退行性疾病是一种全身性疾病，其主要病理基础是肾虚，以肾中精气不足。髓海空虚为本，治疗强调固本清源，以补肾填精法治其本，补肾为先，精气并重。左归丸方为真阴不足、精髓内亏所致诸证而设，具有滋肾填精之功。其加减方临床上多用于老年性痴呆、糖尿病视网膜
变性等疾病的治疗［14］；再者，左归丸方中枸杞、川牛膝、菟丝子、龟板胶等单药在大鼠试验中均有不同程度的改善脑血供、保护神经细胞之功能［15］，本文报告的结果也证实了左归丸可缓解MSG诱发的小鼠多种神经行为上的不良影响。这些结果与我们先前及李美珍等的研究结果是一致的［8，18，19］。
本课题下一步需要探究的是，进一步分析左归丸方剂中药物成分，并试图从中确定是哪一种或多种药物成分的协同作用从而起到保护动物的兴奋性毒性，使中药药效与中药成分的研究更能协调一致，为今后中医药开发神经保护剂方面研究奠定一定的理论基础。
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Protective effects of Zuogui Pill on glutamate-induced neurotoxicity in mice
Zhang Yongping，Yu Lijian，Ma Rundi，Fang Juanzhi
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang524025）
Objective：To investigate a possible protective effect of Zuogui Pill（ZGW）on glutamate-induced neurotoxicity in adult mice．Methods：Mice，except controls，received intragastric（ig）adminstration of monosodium glutamate（MSG，4．0g/kg/d）for10days，at the11th day，each mou received ig adminstration of ZGW（1．0，2．0，4．0g/kg/d，ig）or physiological saline for30days．The mice in controls received ig administraion of physiological saline instead of ZGW．and then behavioral tests，histopathological examinations of hippocampi of brains were ud，the activity of SOD and the concentration of MDA in cerebral tissue in mice were measured by the method of biochemistry and mo-lecularbiology to analyze glutamate（Glu）-induced functional，morphological，and molecular cell biological changes of the brains and a possi-ble protection of ZGW．Results：The results showed that administration of ZGW obviously facilitated brain repair of glutamate-induced behav-ioral disturbances and histopathological impairs in mice；and the activity of SOD of ZGW groups incread significantly（P＜0．05or P＜0．01）in cerebral tissue，while the concentration of MDA decread significantly（P＜0．05）compared with Model group．Conclusion：ZGW has neuroprotection against glutamate-induced neurotoxicity in mice，and its eff
ectivem echanism may be associated with antioxidant ability enhanced by ZGW in mice．
Key words Zuogui Pill（左归丸）；excitotoxic neurotoxicity；neuroprotection
