2021 Vol.40 No.4
• 26 • Serial No.350
China Brewing
Rearch Report
盐分对新平酸腌菜主发酵期细菌多样性的影响
周艺萍.,熊 智8,李选文韩 龙
(1.西南林业大学 生命科学学院西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室,云南 昆明650224;
2.西南林业大学 继续教育学院,云南 昆明650224)
摘 要:基于Illumina NovaSeq 测序平台,选取无盐和有盐(盐度10%)腌制的新平酸腌菜,对主发酵期(前30 d)理化指标(pH 、总酸、亚
硝酸盐含量)变化明显的三个时间点的样品 16SrRNA 的卩-匕区 ,解 细菌群落结构差异。结果表明,盐
和有盐腌
的6个酸菜品共鉴定出22门、339属、902个操作分类单元(OTU );在门分类水上两个盐浓腌的酸菜品菌群结构组成相似, 变形菌门(Proteobacteria )所占比例均T 40%,处优势地位;在属分类水平上各酸菜样品中共有相对丰度较高的细菌为未分类的蓝细 菌属(unidentified-Cyanobacteria) (30.02%)、水生杆菌属 Aquabact^erium) (17.65%)、明串珠菌属(Leuconostoc ) (19.56%);有盐腌制组的 特异菌属种类较无盐腌制组多;理化指标对菌群
小依次为总酸Y 亚硝酸盐含ZpH 值。总体而言,无盐与有盐腌的酸菜细
结构存在差异,盐分的存在主要 势细属和特异属的差异,进而
酸菜的风味口感与贮存时间。
关键词:新平酸腌菜
通 细菌多 性
性分析
中图分类号:TS255.53 文章编号:0254-5071 (2021)04-0026-07 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.04.006
引文格式: ,熊智,李选文,等•盐分对新平酸腌菜主发酵期细菌多样性的影响[J] •中国酿造,2021,40(4):26-32.
Effects of salinity on bacterial diversity in the main fermentation stage ofXinping pickle
ZHOU Yiping 1, XIONG Zhi 2, LI Xuanwen 1, HAN Long 1*
收稿日期:2020-10-22
experiment是什么意思
修回日期:2020-12-08
基金项目:云南省重大科技专项(202002AA100007)国家自然科学基金(31660029)
作者简介:周艺萍(1995-),女,硕士研究生,研究方向为食品微生物。
*通讯作者:韩 龙(1987-),男,助理研究员,博士,研究方向为微生物生态。
(l.Key Laboratory of N ational Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conrva
tion in Southwest China,
College of L ife Science, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. College of S cience Continuing Education,
Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)
Abstract : Bad on Illumina Novaq quencing platform, using salt-free and salt-cured (salinity 10%) Xinping pickle as raw material, the samples at three
time points with obvious physicochemical indexes (pH value, total acid, nitrite content) changes during the main fermentation period (first 30 d) was
quenced by V 3-V 4 region of 16S rRNA, and the difference of bacterial community structure was analyzed. The results showed that 22 phyla, 339 genera and 902 operational taxonomic units (OTUs) were identified from the 6 pickle samples. On the level of phylum classification, the components of bacterial com
munity structure in the two salinity of the samples were similar, and Proteobacteria accounted for more than 40% and in a dominant position. At the
level of genus classification, unidentified-Cyanobacteria (30.02%), Aquabacterium (17.65%) and Leuconostoc (19.56%) were found to have relatively
high abundance in all samples. There were more specific bacteria in the salt-cured group than in the salt-free group. The effect of physicochemical indexes on the bacterial flora in order was total acidSnitrite contenttpH value. In general, there were diiferences in the bacterial structure between pickle without
salt and pickle with salt. The prence of salt mainly affected the difference between dominant and specific bacterial genera, and then affected the flavor
and taste of pickle as well as the storage time.
Key words : Xingping pickle; physicochemical index; high-throughput quencing; bacterial diversity; correlation analysis
新平酸腌菜是以当地称为青菜的叶用芥菜(Brassica
juncea )加盐及各种调料经多种微生物发酵而成,滋味酸
爽、香气浓郁,是我国云南极具地方特色的一种传统发酵 蔬菜冋。可直接食用,也可作为酸味调味品,风味独特,具 有开胃、促食欲等功能问。目前,针对酸菜的主要研究集中
在微生物的分离与鉴定、发酵过程中亚硝酸盐的控制、发 酵 的 以及酸菜中有物
等方,而生产中,生
经验性地添加食盐以保证酸菜的顺利发
酵,但对盐分如 中的微生物 研究 对数据分析培训课程
冋。, 食盐与酸菜发酵微生物的 有
生 、 品 定性以及
,也有 地利用和发酸菜种 。研究酸
菜中的微生物多 性主要有传统 [传统方 能对分离的 种 鉴定 分 多 性,
、 , 分离 分 可 的微生物
及灵敏度不高,还易受到环境因素的影响,无法
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研究报告
全面分析酸菜中微生物群落多样性河%。非培养法不依赖培 养过程,大大缩短了样品的分析时间,而且还能显示环境 样品中不可培养的微生物的遗传信息,有助于快速、准确 地对复杂微生物区系菌群结构演替和多样性进行分析叫
近年来,高通量测序以其速率快、准确定量、实时检测等
特,
境样 的微生物 样性分析中。
实
通量测序 盐和有盐(盐度10%)腌制的平酸腌菜 期 大的时间的样品菌样性进行测序分析,研究盐分对新平
chong酸腌菜菌菌群构 的 ,时对无盐和有盐(盐 度10%)腌制的新平酸腌菜理化指标进行测定,建立理化
菌群落 间的 性, 酸菜制
进
提供一定
,并为深入机理研究奠定一定基础。
1材料与方法1.1材料与试剂
菜
平平 菜
盐等(
区
:(5L ,容量
试剂公司;食品中亚硝酸盐含量测定试剂盒:苏州科铭生 物 有限公样品脱氧核糖核酸(deo x yribonucleic acid ,
DNA )提取,16S rRNA V (-V c 区引物合成 测序建库:委托 北京诺禾致源 股份有限公完成。
1.2仪器与设备
PHS-25型雷磁pE 计:上海梅颖浦仪器仪表制造有限 公司;UV-1000紫外可见分光光度计:上海跃进医疗器械有
限公 YXQ-75G 立式压力蒸汽灭菌器:上海博讯实业有 限公 HH-2数显电恒温水浴锅:金坛市丹瑞电器厂;
universial 32R 高速冷冻离心机:华粤企业集团有限公司; CP64C 电子天平:上海志荣电
有限公
1.3实验方法1.3.1酸菜的制备
实的酸菜样品取于
传方法自制的平
酸腌菜 方法如下:挑选实饱满,腐烂及病虫害 的叶用芥菜,将其在通风且阳光充足的室外晾晒2 d 后,去 ,将其 , , 盐、
有盐(盐度10%)分别处理,反复揉搓,按同等体积比(1:3)
5 L 的玻
, 盐度32罐,于室
温30 d 1天 取样, 2 d 取样,进行pH 、总酸、
酸盐(nitrite ,NT 量 检测”15%。通过 指
的数 计 分析, 酸盐 量 酸菜的全性, 盐度腌制的酸菜系样品中,于pH
,总酸 量 快速 高的 期,分 选
取 酸盐 量上 、 、 显 时间 的样品,进行 菌多样性分析。1.3.2发酵酸菜的指标测定
发酵酸菜罐的多方位置混合取样25 g ,加250 mL 无菌 蒸憎水
, 成 过,分
进行测定问pH 计测定 样品的pH
GB/T
12456 2016 品中总酸的测定 酸菜样品的总酸进行 测定 酸盐 量测定 GB 500".33 2016 品 全 准 品中 酸盐和 酸盐的测定 中的盐酸
法,
品中 酸盐 量测 测定,其 准
曲线回归方程为:y =0.234x +0.000 2,相关系数R ?=0.999。 1.3.3细菌总DNA 提取及多样性分析
选取 显的3 时间 的 盐和有盐
(盐度10%)酸菜样品各25 g ,于250 mL 装有7〜8 mm 的玻 璃珠的无菌水中摇床(180 r/min )振荡1 h ,用灭菌后的纱布 进行过 处 , 其中 杂 , 高速冷冻离心
后4 "、10 000x g
下离心5 min 集菌体沉淀,盐腌制
的酸菜样品 SCL1、SCL2、 SCL3(SCL1
酸盐
六级各项分数量上 时间 , SCL2 酸盐 量高 , SCL3
酸盐量明显 时间 有盐(盐度10%)腌制
的酸菜样品
SCG1、SCG2、SCG3(SCG1 酸盐
量上 时间 , SCG2 酸盐 量高 , SCG3
酸盐 量 显 时间 ,冷 16S rRNA
基因的 V 3-V 4 区!1切引物对 338F (5LACTCCTACGGGAGGC-
AGCAG-30,806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3O 委
托京诺禾致源 股份有限公进行样品DNA 提取及
Illumina NovaSeq 测序平台进行测序,并使用Novomagic V2.0 云平进行多样性分析。1.3.4数据处理
数 平行测定3
, SPSS 22.0数据进行统计学处理,所有数据以平均值土标准差(!±SD )
示 Cutadapt 高通量
数据进行处理冋;然
Uarch 软件和Uchime 进行序的质量筛选和优冋,
的 数
Upar
有样品的
有效序列以97%的一致性进行
分类单元(operational
taxonomic unit , OTU )聚类的;用Mothur 结合SILVA 的 SSUr-
RNA 数库进行物 释分析严261,获分 信息分
分类水平统计各样本的群落组成
Qiime
计算 S hannon 、Simpson 、Chao 1、Goods-coverage 扌旨数,以及计
算UnifTac 距离、构UPGMA 样本聚类树
R
绘制
kevingarnett稀释曲线,进行Alpha 和Beta 多样性数组间 分析以及
境
联分析。
2结果与分析
2.1酸菜基本理化指标
如1示,盐和有盐(盐度10%)酸菜样品理化指
显的起
和平缓点时间一致,高 出现时间稍微不 盐度处的酸菜pH 介于5-6之间,reject
有一定的
趋势,盐腌制的酸菜pH
有盐腌制的
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降低得更快,而有盐腌制的酸菜pH 值起始就比无盐的低; 而无盐腌制的酸菜总酸含量相对于有盐腌制增加得更 快;酸腌菜属于发酵蔬菜制品,其亚硝酸盐含量应符合国 标限量(以NaN0&计)为20 mg/kg -17-182,无盐处理组的亚硝酸
盐含量高峰点(20.264 mg/kg )稍微超出国标限量,而有盐
(盐度10%)处理组整个发酵期间亚硝酸盐含量均符合国标 限量。总酸是酸菜酸味的主要体现者,亚硝酸盐含量多少 影响着酸菜食用安全性,于pH 值持续降低,总酸含量持续 快速升高的主发酵期,分别选取亚硝酸盐含量上升、顶峰、 明降低三个间点的品对续分其 多样性有要 。
表1无盐与有盐腌制酸菜的理化性质
Table 1 Physical and chemical properties of salt-free and salt-treated
pickle
品发酵时间
pH 值
总酸含量/(g ・L-)亚硝酸盐含量/(mg* kg'1)SCL1第1天 6.23±0.02 1.19±0.0110.528±0.024SCL2
第7天 5.93±0.01 2.04±0.0320.264±0.033SCL3
第21天 5.13±0.04 4.17±0.02
4.647±0.029SCG1第1天
5.98±0.020.50±0.02 4.113±0.019
SCG2
第9天 5.64±0.010.86±0.01
10.194±0.014SCG3第21天 5.22±0.01
1.61±0.02
4.946±0.022
注:无盐腌制的酸菜 品对应编号为SCL1、SCL2、SCL3 ;有盐腌制的酸
菜样品对应编号为SCG1、SCG2、SCG3。下同。
2.2细菌多样性
2.2.1样本16S rRNA 基因序列质量评估
可直接反映测序据量的合理性,间接反
映 的 度-2=272。 1 , 序列数达到30 000条左右后趋向平坦,再增加测序量对于发 现 的 。明测序据量合理,含
多,现有测序量 可以反映品 度 。
1000
g 300
畀200
5004000
20 000 40 000
公务员考试常识判断60 000
列数
图1酸菜样品的细菌稀释曲线图
Fig. 1 Rarefaction curves for bacteria in pickle samples
2.2.2 Alpha 多样性分析
Alpha 多性用于分 品 微
的物种丰
富度-27]。对Illumina NovaSeq 测序得到的下机数据(Raw PE )
接 ,得 Clean Tags ,再进行嵌合体 ,得可用于后续分 的有 据(Effective Tags )。对 有样品的Effective Tags ,以97%的一致性序
为操作分类单元(operational taxonomic units ,OTU ),基于 OTU 对6个酸菜品 的Alpha 多性 分 ,其Shannon 反映 的 均度, 高,分 均 Simpson 反映 的多 性, ,多 性 高 Chao1 用 计 总 ,反映度。Alpha 多样性 2。
表2酸菜样品中细菌Alpha 多样性
Table 2 Alpha diversity of bacteria in pickle samples
品
有
OTU Shannon Simpson Chao1覆盖率序量/个指数指数指数
SCL1
67 280347 3.870.86
349.760.999 6SCL262 612460 4.20
0.87
460.44
0.999 8SCL364 947
483 4.670.91487.050.999 4SCG167 830413
3.620.78415.20
0.999 6SCG2
68 787399 3.480.76404.45
0.999 5SCG365 836
288
3.73
0.84
291.12
0.999 6
2 可知, 得
3
、22 、36 、87 、
玛丽亚凯莉演唱会166科、339属,902个O T U 。 高 量测序,从6个酸菜样
得397 292条有 序,其 SCL3 得的OTU
多,SCG3获得的OTU 少,而SCG1获得的OTU 数高 于SCL1,SCL2和SCL3获得的OTU 数贝lj 相对高于SCG2和 SCG3;无盐腌制组的 品发酵 期均 度高,而有盐腌制 均 度相对 , 无盐腌制组的均 度高于有盐腌
制组;无盐 有盐(盐度10%)腌制的 品发酵 期 多性均高于 期,且有盐(盐度10%)腌制组的 多 性均高于无盐腌制组 无盐腌制组的 品发酵 期 度高,有盐(盐度10%)腌制组的样品发酵 期 度高,SCG1 度高于SCL1,SCL3 度 高,SCG3
度低。明盐分的 制些 ,而导 度降低。 有 品的覆盖率(Coverage )均〉0.9,明品文库序的覆盖率高,可反映样 品测序的真实情况。
2.2.3 Venn 图分析
Venn 分 可以展 多 品(或分组)共有和各自特有
OTU ,直观的现环境本间(或分组)的组相似性
及 叠情况-27282,于OTU 的花瓣 Venn 2。
2a 可,6个酸菜品产 了 902个OTU ,6个酸菜品共同拥有的OTU 152个,约占 品OTU 量的 28.82%〜33.19%,说明 品间有 多相似 ,而各样 品又含独有OTU , SCL3独有OTU 量 多,100个,SCG3少,只有22个。 2b 可知,无盐处理的酸菜 品与有盐处理组 有的OTU 487个,约占总 的54.00%,明
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研究报告选择题答题技巧
两组酸菜样品微生物群落组成结构相似,而无盐处理组独 有的OTU 数262个,有盐处理组独有OTU 数133个,说明加 盐坏境会造成独特的微生物群落。
无盐腌制的酸菜样品组为LYZ ;有盐腌制的酸菜样品组为GYZ 。下同。
图2 基于OTU 的花瓣图(a )和Venn 图(b )
Fig. 2 Petal graph (a) and Venn graph (b) bad on OTU
2.2.4酸菜样品的优势菌群分析
如图3a 所示,酸菜样品中细菌群落在门分类水平上具
有较高的多样性,其中平均相对丰度占比排名前10的依次 为变形菌门(Proteobacteria , 57.46%)、蓝细菌门(Cyanobac
teria , 29.70%)、厚壁菌门(Firmicutes , 10.27%)、拟杆菌门
(Aacteroidetes , 1.56%)、放线细菌门(Actinobacteria , 0.54%)、 酸杆菌门(Acidobacteria , 0.38%)、梭杆菌门(Fusobacteria ,
0.13%)、绿弯菌门(Chloroflexi , 0.03%)、疣微菌门(Verru- comicrobia , 0.02%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae , 0.01%)。本
相对丰度>10%的为
菌群。
,变形菌门
占绝对 ,相对丰度占各样品比 为44.39%〜79.05%,
低到高依次为 SCG1、SCG2、SCL2、SCG3、SCL3、SCL1。说明
在门水平下,两个盐浓度处理的酸菜样品中细菌群落结构 组成相近,仅组成比 存在一 异。
如图3b 所示,在 水平下,6个酸菜样品共检测出339个 细菌,相对丰度前10的物种分 分类的蓝细菌属(unidentified-Cyanobacteria , 30.02%)、水杆菌属(Aquabacteri-
um , 17.65%)、未分类的根瘤菌属(unidentified-Rhizobiaceae ,
11.44%)、未分类的立克氏体属
2.41%)、明串珠菌属(Leuconostoc ^ 19.56%)、代尔夫特菌属
(UeF/tia , 6.34%)、假单胞菌属(Pudomonas 7 3.06%) > 甲基
杆菌属(Methylobacterium , 2.44%) >假红育菌属(Pudo.hod
o/erax ,3.19%)、魏斯氏菌属(Weislla , 1.16%)。本实验定义
相对丰>10%的为 菌群。其中无盐 组的 细
菌为分类的蓝细菌、明 菌、水杆菌、分类 的根瘤菌属,分别占15.13%、16.17%、21.05%、14.26%;有盐
组的 细菌 为 分类的蓝细菌 、水杆菌 、明 串珠菌属,分别占46.20%、14.25%、11.62%。说明在属水平下
两个盐浓度 的酸菜样品中细菌群落结构组比例
存在差异,盐分的存在会 细菌
%、翌<;友r
SCL1 SCL2 SCL3 SCG1 SCG2 SCG3
样品名称
SCL1 SCL2 SCL3 SCG1 SCG2 SCG3
样品名称
unidentified_Rickettsiales ■ D elftia
■ unldentlfied_Rhlzobiaceae ■ A quabacterium ■ Leuconostoc ■ unldentifled.Cyanobacteria
Others ■ W elslla ■ Pud o rhodoferax ■ Methylobdcterlum 图3酸菜样品在门(a )和属(b )分类水平的细菌群落结构构成
Fig. 3 Bacterial community structure at phylum (a) and genus (b) level
in pickle samples
2.3组间群落差异分析
2.3.1 UPGMA 分析
为
样
的相似性, 对样
类分,构样的聚类。在环境生物学中,加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean , UPGMA ) 一较为 的类分析方法[28■叫由图4a ' 知,在
物有无丰度,有盐处理组SCG1
SCG2细菌物相似,SCG3细菌物类相似性相对发生
了变化,说明有盐(盐度10%) 会 期的细菌
群落结构 无盐处理组的 个样品细菌物 类 均在 生
变,说明无盐处理细菌群落结构变化 明 图4b 可
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知,在同时考察物种数量和丰度时,无盐腌制组与有盐(盐度10%)腌制组的样品能各自聚为一类,无盐腌制组内SCL2和SCL3聚为一类,有盐(盐度10%)腌制组内SCG1和SCG2聚为一类,但样品物
种类型及丰度依然有差异。说明盐分的存在会明显影响细菌群落的差异,且在发酵后期会抑制某些细菌物种。
图4酸菜样品非加权组(a)与加权组(b)的U PGMA聚类树Fig.4UPGMA cluster tree of unweighted group(a)and weighted group(b)in pickle samples
2.3.2Anosim分析
Anosim分析国是一种非参数检验,用来检验组间的差异是否显著大于组内差异,从而判断分组是否有意义。基于Bray-Curtis距离值的秩次组间差异显著检验,对Anosim的分析,基于样间的距离值
的秩(组间的为between,组内的为within),样一
组的可以三个分类的数据,并箱图的
(若两个箱的,明的数有显著差异),图5。
纵坐标为样本间距的秩,Between为两组之间的结果,
个各自组内的。
图5Anosim组间差异分析
Fig.5Differenee analysis of Anosim group
结果表明,无盐组和有盐(盐度10%)组细菌群落结构差异显著(P V0.05),且R值为0.852G0,分析有意义。
男生什么发型好看图5可知,无盐腌制组与有盐腌制组各自组内和
的箱图有且,说明盐分的有无会影响细菌群,的差异显著(P V0.05)。
2.4组间差异物种分析
241物种丰度聚类热图分析
据OTU的丰度数据,丰度35的,从物种和样个聚类,制图,并据
度同样品细菌群落差异及物种聚类
[26-27]0图6可知,样品有于样品量的菌,且各个样品菌各同。无盐
组SCL3细菌,且三个样品是时间的
而盐度10%组三个样品细菌属数
,种类于无盐组,说明盐会
的细菌明显组差异0
Streptococcus
Xanthomonas
Devosia
Weislla
Brevun d imonas
Methylobacterium
Sphin g obacterium
Achromobacter
Acidovorax
Sphingobium
Aureimonas
Aquabacterium
Delftia
unidentified_Rhizobiaceae
Variovorax
Pudorhodoferax
Haemophilus
Verticia
Leuconostoc
Comamonas
Pudomonas
Stenotropho m onas
Sphingomonas
Lactobacillus
Actinomyces
Abiotrophia
Acinetobacter
Chryobacterium
Romboutsia
Duganella
unidentified_Rickettsiales
Pantoea
unidentified_Enterobacteriaceae
unidentified_Cyanobacteria
Neisria
图6酸菜样品属水平物种丰度聚类热图
Fig.6Heat map of species richness of pickle samples at the genus level
Actinobacteria
Bacteroidetes
Cyanobacteria
Firmicutes
Proteobacteria
2.4.2组间差异物种检验
LEfSe(linear discriminant analysis Effect Size)法适合物种丰度差异检验,LDA值丰度图可同组中丰度差异的物种,图的度差异物种的影响大小222-234。由图7可知,有盐(盐度10%)腌制组的样品中,硫碱螺旋菌属(Thioalkalispira)、unidentified-Rickettsiales、