脑缺血和缺血再灌注大鼠皮层神经元自噬的动态变化
陶红苗１△，单小云２，李旭升１，陈浩浩１，毛宇飞１，何忠平３
（１．金华职业技术学院，２．金华市中心医院，３．金华市食品药品检验检测研究院，浙江金华３２１０００）
【摘要】目的：探讨脑缺血和缺血／再灌注不同时间大鼠大脑皮层神经元自噬的变化。方法：健康雄性ＳＤ大鼠６０只，随机分为：假手术（Ｓｈａｍ）组（ｎ＝１０），脑缺血和缺血／再灌注模型组（ｎ＝５０）．模型组分别在缺血３０ｍｉｎ、２ｈ，缺血２ｈ再灌注１ｈ、６ｈ、２４ｈ五个时间点，随机抽取１０只大鼠，测定脑梗死体积和脑含水量，同时采用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法
测定各组大鼠大脑皮层中微管相关蛋白轻链３ Ⅱ（ＬＣ３ Ⅱ）的水平，透射电镜检测大脑皮层神经细胞自噬情况。结
果：脑缺血３０ｍｉｎ时ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰ比值未见明显上升，缺血２ｈ时ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰ比值开始升高，明显高于Ｓｈａｍ组（Ｐ＜０．０１）；缺血／再灌注１ｈ、６ｈ时ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰ比值虽较缺血２ｈ组有所下降，但仍明显高于Ｓｈａｍ组（Ｐ＜０．０５）；缺血／再灌
注２４ｈ时ＬＣ３Ⅱ／Ⅰ比值达高峰，明显高于Ｓｈａｍ组（Ｐ＜０．０１）。透射电镜观察进一步证实
该现象。缺血／再灌注６ｈ和２４ｈ时大鼠脑梗死体积明显增加，与Ｓｈａｍ组比较有统计学差异（Ｐ＜０．０１）。缺血／再灌注２４ｈ大鼠脑组织含水量明显增加，明显高于Ｓｈａｍ组（Ｐ＜０．０５）。ＨＥ染色显示：仅在缺血／再灌注２４ｈ组大鼠皮层见组织水肿、疏松，部分
teach是什么意思delete怎么读细胞变性、凋亡，海马区见大量神经元细胞核皱缩、深染呈变性凋亡状。结论：局灶性脑缺血和缺血／再灌注模型
中大脑皮层缺血２ｈ神经元自噬即明显激活，缺血／再灌注１ｈ、６ｈ自噬均持续增高，缺血／再灌注２４ｈ自噬达高峰。
【关键词】脑；缺血再灌注损伤；ＬＣ３；自噬；皮层神经元；大鼠
【中图分类号】Ｒ７４１【文献标识码】Ａ【文章编号】１０００ ６８３４（２０１８）０３ ２７７ ０６
chang【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５６２７．２０１８．０６５
Ｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＴＡＯＨｏｎｇ ｍｉａｏ１△，ＳＨＡＮＸｉａｏ ｙｕｎ
distinctly
２，ＬＩＸｕ ｓｈｅｎｇ１，ＣＨＥＮＨａｏ ｈａｏ１，ＭＡＯＹｕ ｆｅｉ１，ＨＥＺｈｏｎｇ ｐｉｎｇ３（１．ＪｉｎｈｕａＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ；２．ＪｉｎｈｕａＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ；３．ＪｉｎｈｕａＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｊｉｎｈｕａ３２１０００，Ｃｈｉｎａ）【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘｎｅｕｒｏｎｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓａｆｔｅｒｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｉｓ ｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（Ｉ／Ｒ）ｉｎｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＨｅａｌｔｈｙｍａｌｅＳＤｒａｔｓ（ｎ＝６０）ｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｓｓｉｇｎｅｄｉｎｔｏｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ（ｓｈａｍ，ｎ＝１０），ｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ（Ｉ／Ｒ，ｎ＝５０）．Ｉｎｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，１０ｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｓａｍｐｌｅｄａｔｆｉｖｅｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓ：ｉｓｃｈｅｍｉａ３０ｍｉｎ，２ｈ，ａｎｄｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ１ｈ，６ｈａｎｄ２４ｈａｆｔｅｒｉｓｃｈｅｍｉａ２ｈ．Ｃｅｒｅｂｒａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅａｎｄｃｅｒｅｂｒａｌｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＴＥＭ）．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅ
ｌｓｏｆｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ３ ＩＩ（ＬＣ３ ＩＩ）ｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘｏｆｔｈｅｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰｒａｔｉｏｈａｄｎｏｏｂｖｉｏｕｓｒｉｓｅａｔｉｓｃｈｅｍｉａ３０ｍｉｎ，ａｎｄｉｔｂｅｇａｎｔｏｉｎｃｒｅａｓｅａｔｉｓｃｈｅｍｉａ２ｈｐｏｉｎｔｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｈａｍｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰｒａｔｉｏｗａｓｓｔｉｌｌｈｉｇｈｅｒａｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ１ｈａｎｄ６ｈｐｏｉｎｔｓｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｈａｍｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），ａｌｔｈｏｕｇｈｉｔｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｔｈａｔａｔｉｓｃｈｅｍｉａ２ｈｐｏｉｎｔ．ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰｒａｔｉｏｒｅａｃｈｅｄａｐｅａｋａｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ２４ｈｐｏｉｎｔ，ｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｈａｍｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｉｓｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｗａｓｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉ ｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅａｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ６ｈａｎｄ２４ｈｐｏｉｎｔｓｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓａｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｈａｍｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｗａｔｅｒｉｎｔｈｅｂ
ｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｏｆｒａｔｓａｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ２４ｈｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙ，ｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｈａｍｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｅｄｅｍａ，ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎ，ｓｏｍｅｃｅｌｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｎｌｙｉｎｔｈｅｃｏｒ ｔｉｃａｌｔｉｓｓｕｅｏｆｒａｔｓａｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ２４ｈｗｅｒｅｓｈｏｗｅｄ，ａｎｄａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｎｅｕｒｏｎｓｎｕｃｌｅｉｉｎｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｗａｓｓｈｒｕｎｋｅｎ，ｈｙｐｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｃｓｈｏｗｉｎｇｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙＨＥｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｅｕｒｏｎｓａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｉｃｅｓｏｆｒａｔｓｗｉｔｈｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙａｃｔｉｖａｔｅｄａｔｉｓｃｈｅｍｉａ２ｈｐｏｉｎｔ，ｉｔｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙａｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ１ｈａｎｄ６ｈｐｏｉｎｔｓａｎｄｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｐｅａｋａｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ２４ｈｐｏｉｎｔ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】ｂｒａｉｎ；ｉｓｃｈｅｍｉｃ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ；ＬＣ３；ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓ；ｒａｔ
yy是什么意思
【基金项目】浙江省科技厅公益技术应用研究计划项目（２０１５Ｃ３７１１８）；金华市科技局社会发展类项目（２０１５ ３ ０５７）【收稿日期】２０１７ ０８ ２８【修回日期】２０１８ ０２ ０２
△【通讯作者】Ｔｅｌ：０５７９ ８２２３２５９０，１３５１６９６０９７５；Ｅ ｍａｉｌ：ｔｈｍ７６１０２３＠１６３．ｃｏｍ女英文名字
缺血性脑卒中是全球主要的致死及致残疾病之一［１］，在有效时间窗内恢复缺血脑组织的血液灌注是目前缺血性脑卒中的唯一有效治疗策略。然而，血流再灌却造成脑缺血再灌注损伤，极大地影响缺
７
７
２
中国应用生理学杂志，２０１８，３４（３）
血性脑卒中的临床治疗。脑缺血损伤的病理机制尚未完全阐明，有证据表明细胞自噬可能在其中发挥了重要的作用［２ ５］。细胞自噬是一种细胞通过自噬溶酶体途径降解细胞内容物的过程。正常情况
下，细胞内维持着低水平的自噬；当受到营养缺乏、低氧和炎症等刺激后细胞内自噬可被激活［６］。诸多文献报道大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬溶酶体途径被激活，自噬通过降解损伤线粒体、清除炎症物质等机制发挥神经保护作用［７，８］；但是，自噬溶酶体途径的过度激活可能将胞浆物质和细胞器“消化”掉，造成细胞内环境紊乱和能量耗竭，引发细胞凋亡程序的启动，导致细胞死亡加重了缺血损伤［９］。自噬在脑缺血损伤过程中究竟发挥了什么样的作用，目前结论不一。有学者认为自噬如同一把双刃剑，脑缺血不同时期的自噬对神经细胞的转归有截然不同的作用［８］。而且有研究表明，在缺血再灌注损伤中施加药物、缺血后处理等调控因素可以有效减轻其损伤程度，而且调节神经细胞自噬水平是主要治疗机制之一，提示自噬是一种潜在的脑缺血损伤治疗靶点［９ １４］。因此，了解自噬水平变化规律可以为临床治疗脑缺血再灌注损伤提供可靠的实验依据和理论基础。
本实验通过建立局灶性大鼠脑缺血和脑缺血再灌注模型，在不同时间点分别采用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法测定大脑皮层脑组织中微管相关蛋白轻链３（ｍｉｃｒｏ ｔｕｂｕｌｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ３，ＬＣ３ Ⅱ）的水平，并进一步通过透射电镜检测大脑皮层神经细胞自噬情况，探讨局灶性脑缺血和缺血再灌注所诱导大鼠脑皮层神经细胞的自噬变化规律。
１材料与方法
１．１动物
svc
普通级雄性健康ＳＤ大鼠６０只，体重（２５０～２８０）ｇ，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。生产许可证号为ＳＣＸＫ（沪）２０１２ ０００２，动物合格证号为０２６７７６０。
１．２主要试剂及材料
altogether
栓线（北京沙东生物有限公司，２６３４ Ａ４型）；ＬＣ３ Ⅱ抗体（ａｂ１２８０２５，英国Ａｂｃａｍ公司）；ＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ５４６５，联科生物）、山羊抗兔Ⅱ抗（ＧＡＲ００７２，联科生物）。ＴＥＣＮＡＩ１０透射电镜。
１．３动物分组及模型制备
取健康雄性ＳＤ大鼠６０只，随机分为假手术（Ｓｈａｍ）组（ｎ＝１０）、脑缺血和缺血／再灌注模型组（ｎ＝５０）。大鼠称重，腹腔注射１０％水合氯醛（３５０ｍｇ／ｋｇ）麻醉大鼠。Ｓｈａｍ组仅单纯暴露右侧颈总、颈内和颈外动脉，不做其他任何处理。模型组大鼠采用Ｌｏｎｇａ等［１５］改良线栓法制作右侧大脑中动脉栓塞（ｒｉｇｈｔｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）模型：颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉；结扎颈外动脉远心端，用血管夹暂时夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉；在颈外动脉靠近颈总动脉分叉处剪１小口，插入一特制线栓（其一端用硅胶包被），松开颈内动脉上的血管夹，将线栓轻轻由颈外动脉插入颈内动脉，直至线栓堵塞大脑中动脉的起始部，线栓插入长度一般为１８～２０ｍｍ，扎紧
线栓，再松开颈总动脉上的血管夹。模型组于缺血３０ｍｉｎ、２ｈ和缺血２ｈ再灌注１ｈ、６ｈ、２４ｈ五个时间点分别随机抽取１０只大鼠：缺血３０ｍｉｎ及２ｈ大鼠不拔出线栓，直接处死并取材；缺血２ｈ再灌注１ｈ、６ｈ、２４ｈ组大鼠，于缺血２ｈ后拔出线栓（即开始再灌注），再灌注１ｈ、６ｈ和２４ｈ时处死大鼠并取材。各组大鼠模型如未能存活至预计时间点，则重新制作模型补足。大鼠苏醒后，依据Ｚｅａｌｏｎｇａ５分制标准（无神经功能缺损症状、活动正常者为０分；不能伸展对侧前爪者为１分；爬行时出现向左转圈者为２分；行走时身体向偏瘫侧倾倒者为３分；不能自发行走，意识丧失者为４分），筛选出２分或３分的具有典型脑缺血症状的大鼠模型进入后续实验，剔除其余动物以保证入组动物均造模成功。所有大鼠造模后均无死亡，造模成功率８０％。
１．４标本的采集和保存
每个时间点各组随机抽取４只大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉并处死大鼠，迅速断头取脑组织，去除嗅球、小脑和低位脑干，取右侧大脑半球组织标本，用于脑梗死体积测定。其余６只大鼠处死后迅速用预冷的生理盐水及４％福尔马林溶液（溶于生理盐水）恒压贯序体循环灌流固定，以梗死区脑组织为中心，分别取材并用于以下指标检测：取约２ｍｍ厚的脑组织称湿重后用于含水量检测；另取小块脑组织迅速放入液氮，再转入 ８０℃冰箱保存，用于Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测；随机选取３只大鼠，于海马位置冠状位切一块脑组织浸入４％甲醛固定，用于病理学检查，并切取１ｍｍ３皮层组织浸入２．５％戊二醛固定，用于透射电镜检查。
１．５ＴＴＣ法检测脑梗死体积
沿冠状面将右侧大脑半球切片，片厚约２ｍｍ，迅速将脑片置于２％ＴＴＣ ＰＢＳ中，３７℃避光孵育３０ｍｉｎ，不时翻动脑片使之与染液均匀接触。正常脑组织染成深红色，梗死区为白色（不着色）。染色后弃
８
７
２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１８，３４（３）
去染液，将脑片放入４％甲醛中固定２４ｈ，数码相机拍照，将图像输入计算机，用图像分析软件Ｉｍａｇｅ ＰｒｏＰｌｕｓ６．０计算脑梗死体积百分比。为减少由脑水肿产生的误差，采用以下公式计算大脑梗死体积百分比（％）＝（缺血对侧半球体积一缺血侧非梗死体积）／缺血对侧半球体积×１００％［１６］。
１．６干湿法测定脑组织的含水量
取病变侧约２ｍｍ厚的脑组织称湿重，放入９５℃烤箱内烘干２４ｈ至恒重后取出恢复到室温，称干重。脑组织含水量（％）＝（脑组织湿重 脑组织干重）／脑组织湿重×１００％。
１．７脑组织的病理学观察
将沿海马位置冠状位切取的脑组织浸入４％甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、ＨＥ染色制片，观察脑组织病理学变化。
１．８Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测ＬＣ３ Ⅱ的蛋白质水平将脑组织称重后剪碎匀浆，加入细胞裂解液裂解，离心，取上清采用ＢＣＡ法测定蛋白质浓度， ８０℃冰箱保存。取适量蛋白质样本按常规方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将凝胶上分离得到的蛋白质条带转印至ＰＶＤＦ膜上，然后分别用非标记Ｉ抗（抗ＬＣ３ Ⅱ抗体）及Ⅱ抗（山羊抗兔ＩｇＧ）对其进行孵育、检测。用ＩｍａｇｅＪ图像分析软件分析灰度值，以ＬＣ３ Ⅱ／ＬＣ３ Ⅰ比值为其相对表达水平。
１．９透射电镜观察脑组织的自噬情况
取１ｍｍ３皮层脑组织，置于２．５％戊二醛溶液中固定过夜。磷酸缓冲液冲洗后，用１％锇酸固定１ｈ；梯度乙醇、丙酮脱水，纯包埋剂包埋。将超薄（１２０ｎｍ）切片经铀、铅双染色后上单孔铜网，透射电镜下观察自噬泡并拍照。自噬体和自噬溶酶体的判断标准参考相关指南［１７］：自噬体为双层膜结构（至少可见部分双层膜结构），内含结构完整的细胞器；自噬溶酶体为单层膜结构，内含处于不同消化阶段的细胞器或胞质成分。由于有时很难严格区分自噬体和自噬溶酶体，经常将二者统称为自噬泡。
１．１０统计学处理
用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０统计软件进行统计学处理。所有计量指标以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示。多组资料比较采用单因素方差分析（ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯ ＶＡ），Ｔｕｋｅｙ法进行组间均数的两两比较。
２结果
２．１脑梗死体积的动态变化
缺血３０ｍｉｎ大鼠无明显脑梗死，再灌注１ｈ，６ｈ，２４ｈ大鼠脑梗死体积随再灌注时间延长呈增加趋势，与Ｓｈａｍ组相比，再灌注６ｈ，２４ｈ大鼠脑梗死体积具有统计学差异（Ｐ＜０．０１，图１、表１）。
２．２脑组织含水量的动态变化
缺血３０ｍｉｎ、２ｈ，缺血后再灌注１ｈ、６ｈ脑组织含水量呈逐渐增加趋势，但与Ｓｈａｍ组比较均无统计学差异。再灌注２４ｈ脑组织含水量较Ｓｈａｍ组明显增加，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５，表１）
。
Ｆｉｇ．１ＴｈｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｉｍａｇｅｓｏｆｔｈｅｉｎｆａｒｃｔｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＴＴＣｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｈｏｗｅｄ
ａ：Ｓｈａｍｇｒｏｕｐ；ｂ：Ｉｓｃｈ３０ｍｉｎｇｒｏｕｐ；ｃ：Ｉｓｃｈ２ｈｇｒｏｕｐ；ｄ：Ｒｅｐｅ１ｈｇｒｏｕｐ；ｅ：Ｒｅｐｅ６ｈｇｒｏｕｐ；ｆ：Ｒｅｐｅ２４ｈｇｒｏｕｐ
Ｔａｂ．１Ｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｓｏｆｉｎｆａｒｃｔｓｉｚｅａｎｄｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｅｒｅｂｒａｏｆｒａｔｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕ
ｓｉｏｎａｎｄｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（％，珋ｘ±ｓ）
ＧｒｏｕｐｓＩｎｆａｒｃｔｓｉｚｅ（ｎ＝４）Ｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ（ｎ＝６）Ｓｈａｍ０７９．５６±４．９８
Ｉｓｃｈ３０ｍｉｎ０７９．６６±３．９０
Ｉｓｃｈ２ｈ２．７５±０．４４８０．４９±４．４７
Ｒｅｐｅ１ｈ４．７０±０．５４８２．７８±３．０４
Ｒｅｐｅ６ｈ９．７５±２．８１ ８２．９４±６．３９
Ｒｅｐｅ２４ｈ２４．７８±３．５３ ８６．４９±４．３５ Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓｓｈａｍｇｒｏｕｐ
２．３ＨＥ染色观察大鼠脑组织病理学的动态改变Ｓｈａｍ组大鼠脑皮层区和海马区结构正常，细胞排列致密规则，无明显水肿、细胞变性及凋亡等改变。缺血３０ｍｉｎ、缺血２ｈ时，大鼠大脑皮层均未见明显病变，海马区见少量神经元细胞核皱缩、深染呈变性凋亡状态。缺血后再灌注１ｈ、６ｈ时，大鼠脑皮层未见明显病理改变，海马区见较多神经元细胞核皱缩、深染呈变性凋亡状态。再灌注２４ｈ时，大鼠脑皮层见组织水肿、疏松，部分细胞变性、凋亡，海马区见大量神经元细胞核皱缩、深染呈变性凋亡状（图２）。
９
７
２
中国应用生理学杂志，２０１８，３４（３）
Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｓｏｆｎｅｕｒｏｎｓｉｎｃｏｒｔｅｘａｎｄｈｉｐｐｏｃａｍ ｐｕｓａｆｔｅｒｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＨＥｓｔａｉｎｉｎｇ（×２００）
ａ：Ｓｈａｍｇｒｏｕｐ；ｂ：Ｉｓｃｈ３０ｍｉｎｇｒｏｕｐ；ｃ：Ｉｓｃｈ２ｈｇｒｏｕｐ；ｄ：Ｒｅｐｅ１ｈｇｒｏｕｐ；ｅ：Ｒｅｐｅ６ｈｇｒｏｕｐ；ｆ：Ｒｅｐｅ２４ｈｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅａｒｒｏｗｓｉｎｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｒｅｆｅｒｔｏｎｕｃｌｅｕｓｓｈｒｉｎｋａｇｅ，ｈｙｐｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅｃｉｒｃｌｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｉｓｓｕｅｅｄｅｍａａｎｄｌｏｏｓｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＭＣＡＯ大鼠大脑皮层ＬＣ３蛋白质水平的动态变化
与Ｓｈａｍ组比较，缺血３０ｍｉｎ大鼠大脑皮层ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰ比值无明显差异，缺血２ｈ该比值明显升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。缺血再灌注１ｈ、６ｈ大鼠大脑皮层ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰ比值虽较缺血２ｈ有所下降，但仍明显高于Ｓｈａｍ组（Ｐ＜０．０５）；缺血再灌注２４ｈ大鼠大脑皮层ＬＣ３ Ⅱ／Ⅰ达到高峰０．４３±０．０６，明显高于Ｓｈａｍ组（Ｐ＜０．０１，图３和表２）
。
Ｆｉｇ．３ＴｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｓｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＬＣ３
ⅡｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｒａｔｂｒａｉｎｃｏｒｔｅｘｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
Ｔａｂ．２ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＬＣ３ ⅡｉｎｃｏｒｔｅｘｏｆｒａｔｗｉｔｈＭＣＡＯ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）ＧｒｏｕｐｓＬＣ３ Ⅱ／ＬＣ３ Ⅰｒａｔｉｏ
Ｓｈａｍ０．２０±０．０９
Ｉｓｃｈ３０ｍｉｎ０．２６±０．０２
Ｉｓｃｈ２ｈ０．３７±０．０４
Ｒｅｐｅ１ｈ０．３２±０．０６
Ｒｅｐｅ６ｈ０．３０±０．０３
Ｒｅｐｅ２４ｈ０．４３±０．０６
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓｓｈａｍｇｒｏｕｐ
spou２．５透射电镜观察大鼠脑皮层自噬的动态变化Ｓｈａｍ组大鼠神经元细胞核结构正常，染色质分布较均匀，线粒体脊线清晰，神经髓鞘丰富，自噬不明显。与Ｓｈａｍ组相比，缺血３０ｍｉｎ大鼠皮层神经元染色质有固缩，线粒体有轻度损伤，有１～２个自噬泡；缺血２ｈ细胞凋亡较明显，可见较多的自噬泡。缺血／再灌注１ｈ、６ｈ时，神经细胞凋亡更明显，自噬泡持续增多；缺血／再灌注２４ｈ时，神经细胞边界模糊接近坏死，自噬泡在各组别中最多（图４）。
３讨论
研究表明，自噬是脑缺血过程中的重要细胞生物学事件，脑缺血过程中伴有细胞自噬发生，且缺血和缺血／再灌注过程中都伴有自噬激活，提示细胞自噬可能与脑缺血过程密切相关［２ ５］。尽管自噬在脑缺血过程中的作用仍存在争议，但最近的研究表明，脑缺血／再灌注过程中的细胞自噬通过清除损伤线粒体进而发挥了神经保护作用［８］。不仅如此，通过药理学或者缺血后处理等方法调控缺血／再灌注过程中的细胞自噬，可减轻脑缺血损伤［１０，１８］。这些结果提示，自噬可能是一种抗脑缺血／再灌注损伤的药物干预新靶点。然而，自噬是一种复杂的细胞生物学过程，脑缺血／再灌注过程中自噬发生的时相特征
０
８
２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１８，３４（３）
尚不完全清楚。因此，了解缺血／再灌注过程中自噬的变化规律，对进一步寻找自噬干预时间窗具有十
分重要的意义。
Ｆｉｇ．４Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｔｈｅｒａｔｂｒａｉｎｃｏｒｔｅｘｂｙｔｒａｎｓ
ｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ａ：Ｓｈａｍｇｒｏｕｐ；ｂ：Ｉｓｃｈ３０ｍｉｎｇｒｏｕｐ；ｃ：Ｉｓｃｈ２ｈｇｒｏｕｐ；ｄ：Ｒｅｐｅ１ｈｇｒｏｕｐ；ｅ：Ｒｅｐｅ６ｈｇｒｏｕｐ；ｆ：Ｒｅｐｅ２４ｈｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅａｒｒｏｗｓｉｎｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｒｅｆｅｒｔｏａｕｔｏｐｈａｇｉｃｖｅｓｉｃｌｅｓ，ａｎｄｔｈｅｃｉｒｃｌｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｃｈｒｏｍａｔｉｎｃｏｎ ｄｅｎｓａｔｉｏｎ
本研究采用的大鼠大脑中动脉栓塞 再灌注模型是一种常用的动物局灶性脑梗死模型。本实验结果显示，再灌注６ｈ和２４ｈ时大鼠脑梗死体积增加较明显，再灌注２４ｈ
时脑组织含水量增加较明显，见皮层组织水肿、疏松，部分细胞变性、凋亡，海马区可见大量神经元细胞核皱缩、深染呈变性凋亡状。该结果与前人的发现一致，同时也证实了本实验模型的可靠性。基于该模型，我们进一步探讨了缺血再灌注不同时间点自噬的激活情况。
ＬＣ３是自噬标志物。自噬泡成熟时，ＬＣ３ Ｉ
ubound转变为ＬＣ３ ＩＩ（即自噬体膜型），ＬＣ３ ＩＩ／Ｉ比值的大小被广泛用于评估自噬激活的程度。本实验结果显示，缺血诱导自噬激活的时间可能在３０ｍｉｎ
以上，该结果与之前的报道类似［１９
］。然而，缺血诱导的自噬并未因血流再灌注而终止，再灌注１ｈ、６ｈ
时自噬持续升高，再灌注２４ｈ
达到高峰。该结果提示，缺血后再灌注同样是诱导神经元自噬的一种重要应激因素。该结果还提示，在缺血后再灌注过程中自噬可能存在着较长的激活时相。透射电镜是研究自噬最可靠的检测手段，我们利用透射电镜对梗死区周围大脑皮层组织进行了观察，进一步证实了上述现象。上
述研究均发现，在局灶性脑缺血再灌注模型中大脑皮层缺血２ｈ神经细胞自噬即明显激活，再灌注１
ｈ、６ｈ自噬均持续增高，再灌注２４ｈ自噬达高峰，提示缺血和缺血再灌注过程中都伴有自噬激活。
在缺血过程中，组织低氧、酸化及能量供应障碍都可能是导致自噬激活的因素，本研究发现自噬随缺血时间延长而激活，提示自噬激活可能与病理损伤的程度呈正相关。然而，伴随着血流再灌注过程，氧化应激损伤是主要病理特征。有文献报道，氧化
应激是激活自噬的重要途径［
６
］。脑缺血后的再灌注过程伴随着氧化应激，在再灌注早期有大量活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ
）生成，对组织细胞造成氧化损伤，同时细胞通过多种抗氧化机制清除部分的过氧化物。随着再灌注的进行，这些半衰期较短的ＲＯＳ可能通过超氧化物歧化酶的作用形成过氧化氢及脂质过氧化物，后者的半衰期较长，造成组织的持续氧化损伤。不仅如此，而且细胞的抗氧化机制在再灌注早期已耗竭，会造成氧化应激的第二次增强。本实验发现，相比缺血２ｈ组，缺血后再灌注
过程造成的自噬激活呈现先降低、后升高的趋势，于再灌注２４ｈ达峰值，这可能是再灌注过程中氧化应激导致自噬二次激活的原因。该结果提示，调控缺血再灌注后的氧化应激可能是有效干预自噬的手段之一。
本研究未对再灌注２４ｈ后的情况进行观察。
但有学者［
２０
］采用透射电镜观察到，脑缺血再灌注损伤后半暗带神经细胞内自噬体形成、溶酶体增多，并持续到５ｄ。提示自噬激活可能存在于脑缺血再灌注后的较长时间内，这可能为缺血性脑损伤治疗提供了一个具有更长时间窗的治疗策略。有研究利用永久性脑缺血大鼠模型发现，缺血１ｈ
半暗带自噬就开始激活，缺血５ｈ自噬达高峰，而缺血性脑卒中２４ｈ
时自噬活性明显下降而凋亡激活，认为可能发生了从自噬到凋亡的转变［
１９
］。这提示，在不同脑缺血大鼠模型中自噬激活的规律存在差异，在将自噬作为脑卒中治疗靶点时，需要充分考虑到这一点。
综上所述，本研究通过大鼠在体脑缺血和缺血再灌注损伤模型，发现大脑皮层缺血２ｈ神经细胞
自噬即明显激活，缺血后再灌注１ｈ、６ｈ时自噬均持续增高，缺血后再灌注２４ｈ时自噬达高峰，为自噬干预提供了理论依据。【参考文献】
［１］ＤｏｎｎａｎＧＡ，ＦｉｓｈｅｒＭ，ＭａｃｌｅｏｄＭ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．
Ｌａｎｃｅｔ，２００８，３７１（９６２４）：１６１２ １６２３．
１
８２中国应用生理学杂志，２０１８，３４（３）
