DOI:10.13995/jki.11-1802/ts.025381
引用格式：刘梦琦，朱媛媛，倪慧，等.荆州地区霉豆渣真菌多样性研究[J].食品与发酵工业,2021,47(6):241-246.LIU Mengqi,
ZHU Yuanyuan,NI Hui,et al.Fungal diversity in Meitauza collected from Jingzhou [J].Food and Fermentation Industries,2021,47(6):241-246.
荆州地区霉豆渣真菌多样性研究
刘梦琦，朱媛媛，倪慧，王玉荣，郭壮∗
(湖北文理学院，湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北襄阳,441053)
摘㊀要㊀采用高通量测序技术，对采集自湖北省荆州地区下辖的监利市和石首县的霉豆渣样品真菌多样性进行解析㊂结果发现，子囊菌门(Ascomycota )平均相对含量57.77%㊁担子菌门(Basidiomycota )33.54%和毛霉门(Mucoromycota )8.00%，为荆州地区霉豆渣中主要真菌门，且各菌门在2个县市霉豆渣样品中含量差异不显著(P >0.05)㊂镰刀霉属(Fusarium)34.60%㊁丝孢酵母属(Trichosporon)28.96%㊁篮状菌属(Talaromyces)12.51%㊁放射毛霉属(Actinomucor)7.27%和枝孢属(Cladosporium)1.55%为主要真菌属，且镰刀霉属在2个县市霉豆渣样品中含量差异极显著(P <0.01)，
其在监利市和石首县样品中的平均相对含量分别为56.74%和12.45%㊂10个分类操作单元矩阵(operational taxonomic units ,OTU )存在所有样品中，其中OTU1366和OTU963分别被鉴定为丝孢酵母属和镰刀霉属，平均相对含量分别为27.50%和29.08%㊂经聚类分析㊁主坐标分析和多元方差分析发现，采集自荆州地区下辖2个县市的霉豆渣样品真菌群落结构存在显著差异(P <0.05)，且采集自石首县的霉豆渣真菌类群的组间差异性大于监利市(P <0.05)；经LEfSe (linear discriminant analysis effect size )分析发现，导致2个县市霉豆渣样品存在差异的类群为耐碱酵母属(Galactomyces)，其在监利市和石首县样品中的相对含量分别为1.46%和0.62%㊂由此可见，虽然共有大量的核心类群，但荆州地区不同县市制作的霉豆渣其真菌群落结构存在显著的差异，而该差异主要由耐碱酵母属导致㊂关键词㊀霉豆渣；真菌多样性；高通量测序；荆州
第一作者：本科生(郭壮副教授为通讯作者,E-mail:)
㊀㊀基金项目：湖北文理学院教师科研能力培育基金项目(2017kypy051)
收稿日期:2020-08-16，改回日期:2020-09-23
㊀㊀豆渣又名豆腐渣，是豆腐㊁豆奶和腐竹等生产过
程中的副产品[1]㊂新鲜豆渣含水量高㊁豆腥味重㊁口感粗糙㊁难以贮存且干燥成本高，因而应用率较
低，造成了一定的环境问题和资源浪费[2]㊂豆渣中含有丰富的膳食纤维㊁矿物质和维生素等成分，可为部分微生物菌株的生长提供必要的营养需求，同时微生物的生长亦可改善豆渣的口感，并在发酵过程中产生多种活性物质和酶系[3]㊂我国是豆制品的生产和消费大国，因而利用微生物发酵开发豆渣产品是极为必
要的[4]㊂
霉豆渣又名豆渣粑，是以豆渣为原料经微生物发
酵制作而成的地方特色发酵食品，在我国湖北省㊁湖南省和江西省具有一定的分布，其中湖北省主要分布在荆州和洪湖地区[5]㊂近年来，国内研究人员围绕霉豆渣微生物多样性解析开展了系列研究，张燕鹏等[6]对江西省瑞金地区霉豆渣微生物类群解析发现，其真菌主要隶属于串珠霉属(Monilia )㊁根霉属(Rhizopus )和酵母属(Saccharomyces )，细菌主要隶属
于微球菌属(Micrococcus )㊁葡萄球菌属(Staphylococ-cus )㊁片球菌属(Pediococcus )和异常球菌属(Deinococ-cus )㊂毛欣欣[7]研究发现湖南省邵阳地区霉豆渣细菌类群主要为克罗诺杆菌属(Cronobacter )㊁不动杆菌属(Acinetobacter )和Staphylococcus ，真菌类群主要为Rhizopus 和丝孢酵母属(Trichosporon )㊂由此可见，不同地区制作的霉豆渣其微生物群落结构可能存在一定的差异，然而目前关于湖北省霉豆渣微生物类群的研究鲜见报道㊂
作为近年来较为流行的第二代高通量测序技术,Illumina MiSeq 测序技术具有成本低㊁通量高和结果准确的优点，目前广泛地应用于豆豉[8]㊁豆瓣酱[9]㊁
酱油[10]和腐乳[11]等发酵食品的微生物多样性解析中㊂本研究采用Illumina MiSeq 测序技术对湖北省荆州地区下辖的监利市和石首县所产霉豆渣真菌多样性进行了比较分析，明确了2个县市所产霉豆渣真菌多样性的共性及差异，并对造成差异的真菌类群进行了甄别，以期为后续以霉豆渣为代表的地方特色发酵
豆制品的产业化推进提供数据支持㊂katia
1㊀材料与方法
1.1㊀材料与试剂
霉豆渣：采集自湖北省荆州地区下辖的监利市容城镇(E112ʎ35ᶄ~113ʎ19ᶄ,N29ʎ26ᶄ~30ʎ12ᶄ)和石首县高陵镇(E112ʎ43ᶄ~112ʎ47ᶄ,N29ʎ67ᶄ~29ʎ85ᶄ),2个采样点间的直线距离约为60km㊂
引物SSU0817F/SSU1196R，武汉天一辉远生物科技有限公司;5ˑFast Pfu Buffer㊁dNTPs Mix㊁Fast Pfu Fly DNA Polymera，宝生物工程大连有限公司；基因组提取试剂盒，德国QIAGEN公司㊂
1.2㊀仪器与设备
PE300高通量测序平台，美国Illumina公司; CR21N高速冷冻离心机，日本HITACHI公司;ND-2000C微量紫外分光光度计，美国Nano Drop公司; vetiri梯度基因扩增仪，美国ABI公司;Fluor Chem FC3型化学发光凝胶成像系统，美国ProteinSimple公司;R930机架式服务器，美国DELL公司㊂
1.3㊀实验方法
1.3.1㊀样品采集
2019年11月于湖北省荆州地区下辖的监利市和石首县采集农家自制的霉豆渣样品各4份，编号为JL1~JL4和SS1~SS4㊂样品采集时，霉豆渣的制作时间在10~15d，颜色一般为白色不带有黑色或绿色的斑点，略带酱臭味但不刺鼻，其制作工艺大体分为清浆㊁压榨㊁蒸料㊁再次压榨㊁摊晾㊁筛匀㊁成型和霉制等8个流程㊂将采集的样品放入采样箱中带回实验室进行分装，置于-20ħ冰箱中备用㊂
1.3.2㊀样品微生物宏基因组DNA提取、PCR扩增及高通量测序
按DNA提取试剂盒中的步骤进行DNA提取，使用分光光度计进行检验，置于-20ħ暂存备用㊂以合格的DNA为模板,SSU0817F(5ᶄ-TTAGCATG-GAATAATRRAATAGGA-3ᶄ)和SSU1196R(5ᶄ-TCTG-GACCTGGTGAGTTTCC-3ᶄ)为引物，参照周书楠等[12]的方法对真菌18S rRNA V4~V5区进行PCR扩
增㊂将合格的扩增产物寄往上海美吉生物医药科技有限公司使用PE300高通量测序平台进行测序㊂
1.3.3㊀生物信息学分析
序列下机后，参照郭壮等[13]的方法对序列进行质控，剔除错配的序列并进行筛选得到合格的序列集㊂利用QIIME分析平台[14]，对合格的序列进行分析，继而对序列使用PyNAST软件[15]进行标准比对和对齐，之后使用2步UCLUST法在100%和97%的相似度下进行划分[16]，构建分类操作单元矩阵(oper-ational taxonomic units,OTU)，最后使用SILVA数据
库[17]对真菌OTU代表性序列进行同源性比对㊂在绘制系统发育树的基础上，对样品的发现物种数和香浓指数等α多样性指标进行分析，然后基于UniFrac 距离使用加权组平均法(weighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类和主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)对2个县市霉豆渣样品真菌类群进行β多样性解析㊂
1.3.4㊀多元统计分析及图表绘制
应用多元方差分析(multivariate analysis of vari-ance,MANOVA)对2个县市霉豆渣样品真菌群落结构的差异性进行分析，使用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)分析对关键真菌类群进行甄别㊂使用R软件(v4.0.2)的waterfall软件包绘制瀑布图，使用Origin2017绘制其他图㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀α多样性分析certified
本研究的8个霉豆渣样品经质控后得到216309条高质量的序列，平均每个样品27039条㊂经2步UCLUST划分后，监利市4个霉豆渣样品OTU的数量分别为693㊁753㊁807和770个，石首县的分别为838㊁847㊁446和368个㊂使用折线图对2个县市样品的α多样性进行比较分析，进而判断本研究测序深度是否满足后续分析的要求㊂
由图1-a可知，当测序量达到近40000条时，稀释曲线尚未进入平台期，说明随着测序深度的增加霉豆渣中新的真菌物种会进一步被发现㊂由图1-b 可知，当测序量达到5000条时，香农指数曲线已经进入平台期，这说明本研究的测序深度已可完全捕获霉豆渣中真菌类群的生物学信息㊂由此可见，本研究的测序深度是符合后续分析要求的㊂
本研究中样品的最小测序深度为10010条序列㊂在该测序深度下，监利市4个霉豆渣样品的发现物种数分别为390㊁341㊁393和391，香浓指数为3.44㊁3.10㊁3.28和3.36；石首县各样品的发现物种数分别为357㊁346㊁170和348，香浓指数为2.98㊁2.75㊁0.90和2.89㊂经Mann-Whitney检验发现，采集自监利市的霉豆渣真菌类群的香浓指数显著偏高(P<0.01)，而两者发现物种数差异不显著(P>0.05)㊂由此可
见，采集自监利市的霉豆渣真菌多样性要显著高于石首县(P <0.01)㊂
a -稀释曲线;
b -香农指数曲线
图1㊀稀释曲线和香农指数曲线
Fig.1㊀Rarefaction curves and shannon index curves
2.2㊀基于门和属分类学地位的真菌类群分析
本研究将平均相对含量>1.00%的真菌门或属定义为优势门或属，将其他<1.00%的门或属归并为 其他 (
others)，将不能鉴定到门或者属水平的序列归并为 不可鉴定 (unclassified)㊂基于门水平2个
县市霉豆渣真菌类群的比较分析如图2所示㊂图2㊀基于门水平2个县市霉豆渣真菌类群的比较分析Fig.2㊀Comparative analysis of fungal groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the phylum level
由图2可知，所有霉豆渣样品中真菌类群可鉴定为3个门，分别为子囊菌门(Ascomycota)㊁担子菌门(Basidiomycota)和毛霉门(Mucoromycota)，平均相对含量分别为57.77%㊁33.54%和8.00%，有0.69%的序列无法鉴定到门水平㊂经Mann-Whitney 检验发现，采集自2个县市的霉豆渣样品在门水平上真菌类群差异均不显著(P >0.05)㊂
本研究中的所有序列可鉴定为32个真菌属，其中平均相对含量>1.00%的有5个，其相对含量如图3所示㊂
图3㊀基于属水平2个县市霉豆渣真菌类群的比较分析Fig.3㊀Comparative analysis of fungal groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the genus level
由图3可知,5个平均相对含量>1.00%的真菌属分别为镰刀霉属(Fusarium )㊁Trichosporon ㊁篮状菌
属(Talaromyces )㊁放射毛霉属(Actinomucor )和枝孢属(Cladosporium )，平均相对含量分别为34.60%㊁
28.96%㊁12.51%㊁7.27%和1.55%㊂经Mann-Whit-ney 检验发现,2个县市霉豆渣中仅Fusarium 含量差异非常显著(P <0.01)，其在监利市和石首县样品中的平均相对含量分别为56.74%和12.45%㊂
Fusarium 和Trichosporon 为监利市各样品中的优势真菌属，平均相对含量分别为56.74%和17.40%，
样品JL1和JL2中亦存在一定量的Actinomucor ，相对含量分别为7.46%和11.02%㊂采集自石首县的霉豆渣样品存在一定的差异性，其中Fusarium 和Tri-chosporon 为样品SS1㊁SS2和SS4中的优势菌，其平均相对含量分别为16.52%和51.65%，而样品SS3中优势真菌属为Talaromyces ，相对含量达到88.39%㊂此外，较之样品SS2和SS4，样品SS1中还含有一定量的Actinomucor ，相对含量为31.83%㊂由此可见，采集自石首县的霉豆渣真菌类群组间差异性可能要大于监利市㊂
研究表明,Fusarium 和Talaromyces 具有一定的致病性,Talaromyces 可能引起中枢神经系统感染[18]和肺炎[19]等疾病，而Fusarium 可能引起皮肤或呼吸道的感染[20]㊂有研究表明霉豆渣主要依靠毛霉菌进行发酵，管瑛[21]从湖北省黄石市阳新县霉豆渣中分离出了隶属于毛霉科(Mucoraceae)的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans )㊂本研究发现Actinomucor 仅为部分霉豆渣样品中的优势真菌属，其在样品JL3和SS2中的相对含量均<1.00%，而在样品SS3中根本
黑利伯瑞国际学校
不存在㊂由此可见，霉豆渣样品的真菌类群整体上是存在较大差异的，究其原因可能在于霉豆渣含水量较高㊁营养物质丰富且制作方式为开放式发酵，多种真菌均可以其为基质进行生长，因而环境㊁制作工具及豆渣本身携带的微生物直接决定了最终产品中的真菌类群构成㊂由于发酵环境的开放性和发酵条件的不可控，霉豆渣的生产受外界影响较大且存在一定的食用安全隐患，因而在后续研究中积极分离㊁鉴定和筛选具有较高食用安全性和优良发酵特性的Actino-mucor 菌株，并将其用于霉豆渣的生产具有积极的意义㊂
2.3㊀基于OTU 水平的真菌类群分析
在97%的相似度下，本研究将序列划分到了3918个OTU,
若某一OTU 在8个样品中均存在，则定义其为核心OTU，相对含量如图4所示㊂
需求英文
图4㊀基于OTU 水平的2个县市霉豆渣真菌核心类群
Fig.4㊀Fungal core groups of Meitauza from Jianli
city and Shishou county at the OTU level
由图4可知，核心OTU 共有10个，仅占总OTU 数量的0.26%，但包含的序列数占总序列的59.56%㊂OTU1366被鉴定为Trichosporon ，平均相对含量为
27.50%;OTU2599㊁OTU2028㊁OTU1846㊁OTU963和OTU1206被鉴定为Fusarium ，其中OTU963的平均相对含量高达29.08%；而其他4个OTU 均鉴定不到属水平，累计平均含量仅为0.29%㊂这也进一步证实了,Fusarium 和Trichosporon 为采集自监利市和石首县多数霉豆渣样品中的优势真菌类群㊂
本研究发现有20个OTU 在监利市4个霉豆渣样品中均存在，但在石首县样品中均不存在，其累计包含序列仅占总序列数的0.69%，且均鉴定不到属水平㊂没有发现有OTU 仅存在于石首县4个霉豆渣样品中，而在监利市样品中不存在㊂2.4㊀β多样性分析
本研究进一步采用基于UniFrac 距离的UPGMA
聚类和PCoA 对2个县市霉豆渣真菌类群的β多样性进行了分析，结果如图5所示㊂a -基于聚类分析;b -主坐标分析
图5㊀基于聚类分析和主坐标分析的2个县市
霉豆渣真菌类群β多样性分析
Fig.5㊀Analysis of beta diversity of fungal groups in Meitauza from Jianli city and Shishou county using cluster analysis and
principal coordinate analysis
由图5-a 可知，监利市4个样品形成一个聚类,
石首县样品SS2和SS4可单独形成一个聚类，虽SS1和SS3与该地区其他2个样品无法形成一个分支，但2个县市霉豆渣形成了明显的聚类趋势㊂由图5-b 可知，监利市样品主要分布在第一和第四象限，而石首县样品主要分布在第二㊁三和四象限㊂由此可见,
不同县市制作的霉豆渣样品其真菌类群呈现出一定的差异㊂在提取PCoA 前85%因子的基础上，本研究采用MANOVA 分析发现,2个县市霉豆渣样品真菌群落结构存在显著差异(P <0.05)㊂本研究团队对湖南省湘西土家族苗族自治州龙山县和湖北省宜昌市当阳市的豆豉[22]及湖北省恩施土家族苗族自治州咸丰县和湖北省宜昌市当阳市的辣椒酱[23]细菌多样性进行了解析，亦发现了类似的现象，究其原因可能在于生态环境和制作工艺的不同会对发酵食品微生物类群的形成产生一定影响㊂大量研究表明，小学数学试卷
不同地区特殊发酵食品中蕴含了较为丰富和独特的微生物类群，对其进行挖掘㊁保藏和筛选，对我国特色发酵食品的产业化推进和使用安全性提升均具有积极的意义[24]㊂
由图5-a 可知，监利市样品JL1和JL2,JL3和JL4两两形成一个分支且在树的末端，这说明4个样
品的真菌类群较为相似；而石首县样品SS3和SS1的分支相对较长，这说明这2个样品真菌类群与其他样品存在较大差异㊂由图5-b 可知，较之监利市样品，石首县样品空间分布更为分散㊂由此可见,
采集自石首县的霉豆渣真菌类群组间差异性可能要大于监利市，这也进一步验证了图3的结论㊂本研究进一步对2个县市样品真菌类群的组间差异进行了分析，结果如图6所示㊂
图6㊀两个县市霉豆渣真菌类群的组间差异性分析Fig.6㊀Intergroup difference analysis of fungal groups in
Meitauza from Jianli city and Shishou county
注:∗表示两者差异显著(P <0.05)
what would you do
由图6可知，采集自监利市霉豆渣样品真菌类群的组间距离为0.039ʃ0.002，而石首县为0.107ʃ0.206，且经Mann-Whitney 检验发现，两者差异显著(P <0.05)㊂由此可见，采集自石首县的霉豆渣真菌类群组间差异性大于监利市㊂2.5㊀关键真菌类群甄别
本研究进一步采用
LEfSe 分析对导致2个县市霉豆渣真菌群落结构存在差异的类群进行了甄别，结果如图7所示㊂
图7㊀基于LEfSe 分析2个县市霉豆渣关键真菌类群的甄别Fig.7㊀Identification of key fungal groups in Meitauza from
Jianli city and Shishou county by LEfSe analysis
由图7可知，导致2个县市霉豆渣真菌群落结构存在差异的类群隶属于双足囊菌科(Dipodascaceae)的耐碱酵母属(Galactomyces )，其在采集自监利市样品中的相对含量为1.46%，而在石首县样品中仅为
0.62%，为非优势菌属㊂值得一提的是，除Galacto-myces 外并未发现其他类群导致2个县市霉豆渣真菌群落结构存在差异㊂由此可见，正是由于部分相对含量较少的真菌类群存在差异，进而导致了采集自2个县市的霉豆渣真菌群落结构的不同㊂
3㊀结论
湖北省荆州地区霉豆渣中的优势真菌类群以Fusarium ㊁Trichosporon ㊁Talaromyces ㊁Actinomucor 和Cladosporium 为主㊂虽然荆州地区下辖的监利市和石首县制作的霉豆渣具有大量的核心真菌类群，但采集自2个地区的样品真菌类群存在显著的差异，且该差异主要是由Galactomyces 等非优势真菌类群导致的㊂
参
考
文
献
[1]㊀夏秀东，刘小莉，王英，等.豆渣固定化培养乳酸菌的条件优化及
其对乳酸菌的保护作用[J].江西农业学报,2017,29(9):89-93.XIA X D,LIU X L,WANG Y,et al.Optimization of conditions for im-mobilized culture and protection of lactic acid bacteria on soybean dreg (okara)[J].Acta Agriculturae Jiangxi,2017,29(9):89-93.
英文歌曲大全
[2]㊀XIU D X,YING W,XIAO L L,et al.Soymilk residue (okara)as
a natural immobilization carrier for Lactobacillus plantarum cells en-hances soymilk fermentation,glucosidic isoflavone 59bioconversion,and cell survival under simulated gastric and intestinal conditions [J].PeerJ,2016,4:e2701.
[3]㊀李伟伟，曲俊雅，周才琼.真菌及乳酸菌联合发酵对豆渣膳食
深圳好会计纤维及理化特性的影响[J].食品与发酵工业,2018,44(11):159-166.
LI W W,QU J Y,ZHOU C Q.Effects of combined fermentation of fungi and lactic acid bacteria on dietary fiber and physicochemical properties of soybean dregs[J].Food and Fermentation Industries,2018,44(11):159-166.
[4]㊀申春莉，李曼，沙见宇，等.灵芝菌丝体固态发酵豆渣的营养成
coke什么意思分变化[J].食品与发酵工业,2019,45(12):114-119.
SHEN C L,LI M,SHA J Y,et al.Nutrient changes in solid-state fermented okara with Ganoderma lucidum [J].Food and Fermenta-tion Industries,2019,45(12):114-119.
[5]㊀姚英政.霉豆渣粑发酵过程中营养及风味成分变化研究[D].
武汉：华中农业大学,2010.
YAO Y Z.Study on the changes in nutrition and flavor ingredients during soybean residue cakes fermentation [D ].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2010.
[6]㊀张燕鹏，杨瑞金，王贺，等.传统豆渣菌的菌相分析及蛋白酶和
纤维素酶主要产生菌株的鉴定[J].食品工业科技,2012,33(1):171-174.
quantity是什么意思ZHANG Y P,YANG R J,WANG H,et al.Analysis of the microflora and identification of the protea and cellula producing strains from the traditional fermentative Douzhajun [J].Science and Technology of Food Industry,2012,33(1):171-174.
[7]㊀毛欣欣.发酵豆渣微生物多样性与其营养成分变化关系研究
[D].广州：华南农业大学,2019.
MAO X X.Study on the relationship between microbial diversity of fermented soybean dregs and its nutrient composition [D ].Guang-zhou:South China Agricultural University,2019.
