液相⾊谱串联质谱法测定百⽇咳和百⽩破疫苗中百⽇咳杆菌⽓管细胞毒素
２０１９年２⽉Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．２Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１９
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
１５５１６１
研究论⽂
ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１８．０８００６
收稿⽇期：２０１８?０８?２２
＃共同第⼀作者．
通讯联系⼈．Ｅ?ｍａｉｌ：ｇｕｏｚｈｉｍｏｕ＠ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ（郭志谋）；ｆｘｌｙｑ＠ｓｈｉｍａｄｚｕ．ｃｏｍ．ｃｎ（李⽉琪）．
液相⾊谱?串联质谱法测定百⽇咳和百⽩破疫苗中
百⽇咳杆菌⽓管细胞毒素
龙⼀珍１＃，⼀卫⼀⾠２＃，⼀郭志谋３?，⼀马⼀霄２，⼀李⽉琪１?，⼀
姚劲挺１，⼀冀⼀峰１，⼀李长坤１，⼀黄涛宏１
（１．岛津企业管理（中国）有限公司，北京１０００２０；２．中国⾷品药品检定研究院，卫⽣部⽣物技术产品检定⽅法及其标准化重点实验室，北京１０２６２９；３．中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院⼤连化学物理研究所，辽宁⼤连１１６０２３）
摘要：百⽇咳杆菌⽓管细胞毒素（ＴＣＴ）是⼀种引起百⽇咳及百⽇咳相关疫苗不良反应的毒性糖肽三尽管各国药典均规定了百⽇咳疫苗产品中ＴＣＴ的含量限度，但均没有推荐ＴＣＴ的含量测定⽅法三该研究发展了⼀种液相⾊谱?串联质谱法⽤于ＴＣＴ的含量测定三实验优化了包括⾊谱柱类型和流动相组成在内的ＴＣＴ⾊谱条件三虽然ＴＣＴ在反相⾊谱模式和亲⽔作⽤⾊谱（ＨＩＬＩＣ）模式下均具有较好的保留，但ＨＩＬＩＣ模式与蛋⽩质沉淀的前处理⽅法兼容性更好，因此采⽤ＨＩＬＩＣ模式分离ＴＣＴ三优化所得的⽅法具有较宽的线性范围（５７６３６９ｎｇ／Ｌ），良好的重复性（峰⾯积的相对标准偏差不⼤于３９％），各种基质中均有较好的回收率（９６４％１０２５％），且定量限是药典要求的ＴＣＴ最⾼限量的１／１２７９三将本⽅法⽤于共纯化百⽇咳疫苗⼆组分百⽇咳疫苗⼆共纯化⽆细胞百⽩破疫苗和组分⽆细胞百⽩破疫苗中ＴＣＴ的检测，所有产品均未检出ＴＣＴ，表明被检样品具有较好的⼯艺条件可避免ＴＣＴ在产品中的残留三
关键词：液相⾊谱；质谱；百⽇咳杆菌⽓管细胞毒素；百⽩破疫苗；百⽇咳疫苗中图分类号：Ｏ６５８⼀⼀⼀⽂献标识码：Ａ⼀⼀⼀⽂章编号：１０００?８７１３（２０１９）０２?０１５５?０７
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｒａｃｈｅａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｎｉｎｐｅｒｔｕｓｓｉｓａｎｄｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｅｔａｎｕｓａｃｅｌｌｕｌａｒｐｅｒｔｕｓｓｉｓｖａｃｃｉｎｅｓｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ?ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ＬＯＮＧＺｈｅｎ１＃，ＷＥＩＣｈｅｎ２＃，ＧＵＯＺｈｉｍｏｕ３?，ＭＡＸｉａｏ２，ＬＩＹｕｅｑｉ１?，
全国cet准考证打印ＹＡＯＪｉｎｔｉｎｇ１，ＪＩＦｅｎｇ１，ＬＩＣｈａｎｇｋｕｎ１，ＨＵＡＮＧＴａｏｈｏｎｇ１
英语四（１．ＳｈｉｍａｄｚｕＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２０，Ｃｈｉｎａ；２．ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＨｅａｌｔｈｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＱｕａｌｉｔｙａｎｄＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＢ
ｉｏｔｅｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２６２９，Ｃｈｉｎａ；３．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅｆｏｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，
ＤａｌｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＰｈｙｓｉｃｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｌｉａｎ１１６０２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒａｃｈｅａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｎ（ＴＣＴ）ｉｓａｔｏｘｉｃｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ，ｗｈｉｃｈｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｔｈｅａｄｖｅｒｓｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｅｒｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎ（ＰＴ）ａｎｄｒｅｌａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｓ．ＡｌｔｈｏｕｇｈｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｓｌｉｍｉｔｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆＴＣＴ
ｉｎＰＴｐｒｏｄｕｃｔ，ｔｈｅｒｅｉｓｎｏｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄＴＣＴｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｉｎａｎｙｐｈａｒｍａｃｏ?ｐｅｉａ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ａｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ?ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅＴＣＴ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｏｌｕｍｎ?ｔｙｐｅａｎｄｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅｃｏｍ?ｐｏｓｉｔｉｏｎ，
ｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｐｏｒｔｓ，ｂｏｔｈｒｅｖｅｒｓｅｄ?ｐｈａｓｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏ?
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＲＰＬＣ）ａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＬＩＣ）ｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａ
ｇｏｏｄｒｅｔｅｎｔｉｏｎｆｏｒＴＣＴ．Ａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｉｓｕｓｕａｌｌｙｕｓｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎ
⾊谱第３７卷ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｍａｙａｆｆｅｃｔｔｈｅＲＰＬＣｍｏｄｅ，ｌｅａｄｉｎｇｔｏｐｅａｋｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ，ｗｈｉｌｅｓｕｃｈｅｆｆｅｃｔｓｗｅｒｅｎｏｔｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎＨＩＬＩＣｍｏｄｅ．Ｔｈｕｓ，ＨＩＬＩＣｍｏｄｅｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅＴＣＴｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｅｔｈｏｄｈａｄａｗｉｄｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅ（５７６－３６９ｎｇ／Ｌ），ｇｏｏｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（ｎｏｍｏｒｅｔｈａｎ３９％），ｓａｔｉｓｆｉｅｄｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｉｎｖａｒｉｏｕｓｍａｔｒｉｃｅｓ（９６４％－１０２５％）．Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｆｉｃａ?ｔｉｏｎ（ＬＯＱ）ｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓ１２７９ｔｉｍｅｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｎｅｒｅｑｕｉｒｅｄｂｙＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，ｗｈ
ｅｒｅｉｎｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｄａｍｏｕｎｔｏｆＴＣＴｓｈｏｕｌｄｂｅｌｅｓｓｔｈａｎ２ｐｍｏｌｐｅｒｄｏｓｅ．ＴｈｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＴＣＴｉｎｐｅｒｔｕｓｓｉｓｖａｃｃｉｎｅ（ａｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ），ｐｅｒｔｕｓ?ｓｉｓｖａｃｃｉｎｅ（ａｃｅｌｌｕｌａｒ，ｃｏ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ），ｃｏ?ｐｕｒｉｆｉｅｄｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｅｔａｎｕｓｐｅｒｔｕｓｓｉｓｖａｃｃｉｎｅ，ａｎｄｃｏｍ?ｐｏｎｅｎｔｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｅｔａｎｕｓａｃｅｌｌｕｌａｒｐｅｒｔｕｓｓｉｓｖａｃｃｉｎｅ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ＴＣＴｗａｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎａｎｙｏｆｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｓａｍｐｌｅｓｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｓａｆｅｔｙｏｆｔｈｅｓｅｖａｃｃｉｎｅｓａｎｄＰＴｐｒｏｄｕｃｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＬＣ）；ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）；ｔｒａｃｈｅａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｎ（ＴＣＴ）；ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｅｔａｎｕｓｐｅｒｔｕｓｓｉｓａｃｅｌｌｕｌａｒｖａｃｃｉｎｅ（ＤＴａＰ）；ｐｅｒｔｕｓｓｉｓｖａｃｃｉｎｅ（ＰＴ）
⼀⼀百⽩破（ＤＴＰ）疫苗由百⽇咳疫苗⼆⽩喉疫苗和破伤风疫苗联合组成，是全球范围内应⽤最⼴的疫苗之⼀，同时也是报道不良反应次数最多的疫苗三２０１５年，百⽩破疫苗不良反应约占中国疫苗不良反应的三分之⼀［１］三百⽇咳杆菌⽓管细胞毒素（ＴＣＴ）最早由Ｇｏｌｄｍａｎ等［２］
从百⽇咳杆菌培养液中发现，它的存在被认为是导致百⽇咳和百⽩破疫苗不良反应的原因之⼀三在呼吸道上⽪细胞培养实验中发现，浓度为１µｍｏｌ／Ｌ的ＴＣＴ即可摧毁纤⽑细胞群［２］三当纤⽑细胞被破坏以后可以产⽣类似百⽇咳的症状，如咳嗽甚⾄肺部感染［３］三由于ＴＣＴ的⾼活性和破坏⼒，各国药典均对百⽇咳疫苗中ＴＣＴ的最⾼含量做出了限定，即不得超过２ｐｍｏｌ／剂三按照通常百⽩破疫苗的体积（０５ｍＬ）计算，ＴＣＴ在成品中不得超过４ｎｍｏｌ／Ｌ三
⼀⼀尽管各国药典均对ＴＣＴ的含量做出了限定，但由于⽆商品化ＴＣＴ对照品⼆ＴＣＴ对照品制备困难和缺乏⾼灵敏度⼆⾼选择性的ＴＣＴ检测⽅法等原因，⽬前各国药典均⽆ＴＣＴ的检测⽅法记载三ＴＣＴ⽆强紫外吸收基团且易受疫苗基质⼲扰，即使采⽤低波长检测，仍然⽆法实现复杂疫苗基质中ＴＣＴ的⾼灵敏度准确检测三例如，以２０４ｎｍ为检测波长，进样１０µＬ浓度为４ｎｍｏｌ／Ｌ的ＴＣＴ对照品，⽆明显紫外吸收峰检出三Ｇｏｌｄｍａｎ等［４］将柱前衍⽣?ＨＰＬＣ?ＵＶ⽅法⽤于疫苗中ＴＣＴ的含量测定，该⽅法在进样２００µＬ时，可实现浓度为５ｎｍｏｌ／ＬＴＣＴ的检测，该⽅法灵敏度与药典要求尚存在⼀定差距，且⽅法耗时较长（４５ｍｉｎ）三此外，衍⽣效率受基质和衍⽣试剂⼲扰，从⽽影响定量的准确性⼆重复性和再现性［３］，不能实现疫苗中ＴＣＴ的⾼灵敏度⼆⾼选择性⼆⾼准确度检测，且定量所需消耗的对照品质量
较多，增加了ＴＣＴ对照品制备的⼯作量三通⽤型检
测器为紫外检测器的有利补充，⽆需衍⽣即可实现
弱紫外吸收和⽆紫外吸收化合物的检测［５－８］三但通⽤型检测器的灵敏度通常在ｍｇ／Ｌ级别，⽆法满⾜
各国药典对ＴＣＴ含量检测的限量要求三更重要的
是，⽆论是紫外检测器还是通⽤型检测器均需要对
照品，通过对⽐样品和对照品保留时间定性三⽬前
尚⽆商品化的ＴＣＴ对照品，且ＴＣＴ对照品的制备
复杂三通过４８ｈ培养⼆纯化１ＬＴＣＴ培养液最多只
能制备得到７００ｎｍｏｌ的ＴＣＴ对照品［２］三
⼀⼀为了实现疫苗中ＴＣＴ的有效定性和定量分析，需要发展⼀种⽆须衍⽣⼆灵敏度好⼆选择性较⾼⼆适合百⽇咳和百⽩破疫苗中ＴＣＴ的快速检测的⽅法三本⽂发展了⼀种亲⽔作⽤⾊谱（ＨＩＬＩＣ）?ＭＳ／ＭＳ⽅法⽤于百⽇咳和百⽩破疫苗中ＴＣＴ的定性和定量分析三从百⽇咳杆菌培养液中纯化得到ＴＣＴ样品后，通过ＬＣ?离⼦阱飞⾏时间质谱表征确定其结构后作为对照品，⽤于ＨＩＬＩＣ?ＭＳ／ＭＳ定量⽅法的发展三系统优化了ＴＣＴ检测的⾊谱条件和ＭＲＭ参数，并对⽅法的重
复性⼆回收率⼆线性关系⼆检出限（ＬＯＤ）和定量限（ＬＯＱ）等进⾏了考察三⽅法优化后，将其⽤于两种主流⼯艺（共纯化和组分）所得百⽇咳和百⽩破疫苗中ＴＣＴ的检测三
１⼀实验部分六级时间安排
１．１⼀仪器、试剂与材料
⼀⼀ＬＣ?ＭＳ／ＭＳ系统包括ＬＣＭＳ?８０４５三重四极杆质谱⼆ＬＣ?２０ＡＤＸＲ⾼压⼆元泵⼆脱⽓机⼆ＳＩＬ?３０ＡＣ⾃动进样器⼆ＣＴＯ?２０ＡＣ柱温箱⼆ＳＰＤ?Ｍ３０Ａ紫外检
四６５１四
⼀第２期
龙⼀珍，等：液相⾊谱?串联质谱法测定百⽇咳和百⽩破疫苗中百⽇咳杆菌⽓管细胞毒素
测器，⽤于ＴＣＴ的定量三ＬＣＭＳ?ＩＴ?ＴＯＦ系统⽤于ＴＣＴ的结构确定三ＬＣＭＳ?８０４５和ＬＣＭＳ?ＩＴ?ＴＯＦ均使⽤ＥＳＩ离⼦源并同时监测正⼆负离⼦模式三Ｌａｂ?
small是什么意思
Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ和ＬＣＭＳＳｏｌｕｔｉｏｎ⼯作站分别⽤于ＬＣＭＳ?８０４５和ＬＣＭＳ?ＩＴ?ＴＯＦ的数据处理三以上仪器和软件购⾃岛津（京都，⽇本）三
⼀⼀⼄腈⼆甲酸和低吸附离⼼管购⾃Ｍｅｒｃｋ（ＭＡ，ＵＳＡ）三超纯⽔由Ｍｉｌｌｉ?Ｑ系统制备（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）三ＨＩＬＩＣ⾊谱柱ＣｌｉｃｋＸＡｍｉｄｅ（１５０ｍｍ?２１ｍｍ，３µｍ）由中国科学院⼤连化学物理研究所提供三ＱＭＡ柱为购⾃Ｗａｔｅｒｓ的阴离⼦交换固相萃取柱三共纯化百⽇咳疫苗（⼚家１和２）⼆组分百⽇咳疫苗（⼚家３和４）⼆组分百⽩破疫苗（⼚家５和６），共纯化百⽩破疫苗（⼚家７⼆８和９）和疫苗基质（百⽇咳和百⽩破疫苗基质）由中国⾷品药品检定研究院提供三
表１⼀ＭＲＭ模式下ＴＣＴ的ＭＳ／ＭＳ参数
Ｔａｂｌｅ１⼀ＭＳ／ＭＳｐａｒａｍｅｔｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｔｒａｃｈｅａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｎ（ＴＣＴ）ｉｎＭＲＭｍｏｄｅ
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ／ｍｉｎ
Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｉｏｎ（ｍ／ｚ）
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ｍ／ｚ）
Ｄｗｅｌｌｔｉｍｅ／ｍｓ
coco什么意思Ｑ１／ＶＣＥ／ＶＱ３／ＶＰｏｌａｒｉｔｙ４．８５
９２２．４
７１９．３?
３０－２８－３４－３４＋
３９１．１３０－２８－４０－２６３０２．１
shade３０
－２８
－４７
－３０
⼀ＣＥ：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙ．?Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｏｎ．
１．２⼀溶液配制⼆ＴＣＴ对照品的制备⼀⼀ＱＭＡ柱所⽤平衡液和洗涤液均为含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ⼄酸铵的甲醇⽔溶液
（ｐＨ５５），其中甲醇与⽔的体积⽐为２?８三ＱＭＡ柱洗脱液为含有１０
ｍｍｏｌ／Ｌ⼄酸铵⼆１ｍｏｌ／Ｌ氯化钠的甲醇⽔溶液（ｐＨ教学案例分析范文
５５），其中甲醇与⽔的体积⽐为２?８三ＴＣＴ对照品参考⽂献［２］的⽅法制备，具体步骤如下三（１）纯化：
百⽇咳杆菌培养液在４?下采⽤⾼速离⼼的⽅法去除⼤分⼦杂质，取上清液过０２２µｍ醋酸纤维素膜进⼀步去除溶液中的⼤分⼦杂质，收集滤液，⽤三氟
⼄酸调节滤过液ｐＨ值⾄３三（２）Ｃ１８柱纯化ＴＣＴ：⽤甲醇和体积分数为０１％的三氟⼄酸⽔溶液依次洗涤Ｃ１８填料；将洗涤后的Ｃ１８填料填装在玻璃柱中，然后注⼊纯化步骤所得滤液；抽⼲柱中溶液，再⽤体积分数为０１％的三氟⼄酸⽔溶液洗涤⾊谱柱；⽤三氟⼄酸?正丁醇?⽔（１?２００?８００，ｖ／ｖ／ｖ）溶液洗脱ＴＣＴ并收集馏分；减压浓缩馏分以备ＱＭＡ柱纯化三（３）深度纯化：⽤平衡液浸润ＱＭＡ柱１０ｍｉｎ，再⽤２０ｍＬ洗涤液清洗ＱＭＡ柱，再⽤２０ｍＬ甲醇清洗ＱＭＡ柱，最后⽤２０ｍＬ平衡液平衡ＱＭＡ柱三将减压浓缩所得馏分注⼊ＱＭＡ柱，再⽤洗涤
液洗涤未结合蛋⽩质，然后⽤洗脱液洗脱ＴＣＴ并收集三（４）脱盐：⽤三氟⼄酸酸化第（３）步所得ＴＣＴ溶液⾄ｐＨ为３，再按富集步骤的操作流程上样并收集ＴＣＴ脱盐馏分，冻⼲ＴＣＴ脱盐馏分，得ＴＣＴ对照品，称重后放置于－８０?保存三
１．３⼀疫苗样品的前处理
⼀⼀向疫苗样品中加⼊⼄腈，直到⼄腈体积分数为８０％，充分振荡⼆混合样品１ｍｉｎ后，置于离⼼机中以１４０００ｒ／ｍｉｎ离⼼１５ｍｉｎ三取上清液⽤于ＬＣ?ＭＳ／ＭＳ分析三处理前和处理后疫苗样品均放置于
４?保存三
１．４⼀ＨＰＬＣ条件
⼀⼀ＬＣＭＳ?ＩＴ?ＴＯＦ定性分析ＴＣＴ与ＬＣＭＳ?８０４５定量分析ＴＣＴ的ＨＰＬＣ条件相同三进样体积为１０µＬ；⾊谱柱：ＣｌｉｃｋＸＡｍｉｄｅ（１５０ｍｍ?２１ｍｍ，３µｍ）；流动相Ａ为１０ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵⽔溶液（ｐＨ３０），流动相Ｂ为１０ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵⼄腈溶液（每升含１００µＬ甲酸）三流速为０３ｍＬ／ｍｉｎ；梯度：０
５ｍｉｎ，７５％Ｂ２０％Ｂ；５５１ｍｉｎ，２０％Ｂ７５％Ｂ；５１９ｍｉｎ，７５％Ｂ三０２ｍｉｎ的⾊谱柱洗脱液由六通阀切换⾄废液，其余切换到ＭＳ检测三
１．５⼀ＭＳ条件
⼀⼀ＴＣＴ定性：离⼦源为电喷雾电离源，正离⼦模式；离⼦化电压为３５ｋＶ；雾化⽓流速为１５Ｌ／ｍｉｎ；加热模块温度为２００?；脱溶剂管（ＣＤＬ）温度为２３５?；检测器电压为１７０ｋＶ；ＴＯＦ飞⾏管温度为（４００?０３）?；质谱数据采集范围ｍ／ｚ３００１５００；三氟⼄酸钠（ＮａＴＦＡ）溶液⽤于正负离⼦模
式校正三
⼀⼀ＴＣＴ定量：离⼦源为电喷雾电离源，正离⼦模式；扫描模式为多反应监测（ＭＲＭ）模式；离⼦化电压为３０ｋＶ；离⼦源温度为３００?；脱溶剂管（ＤＬ）温度为２３５?；雾化⽓流速为３Ｌ／ｍｉｎ；⼲燥⽓流速为１０Ｌ／ｍｉｎ；加热器流速为１０Ｌ／ｍｉｎ三ＴＣＴ的３个离⼦对通道⽤于ＴＣＴ分析（见表１）三
１．６⼀标准溶液
⼀⼀将对照品制备步骤中所得ＴＣＴ对照品（０１
四
７５１四
⾊谱第３７卷ｍｇ）⽤１ｍＬ⽔溶解，配制成质量浓度为１００µｇ／Ｌshrink
的ＴＣＴ母液三取ＴＣＴ母液，⽤疫苗基质逐级稀释成质量浓度为３６９⼆１８４５⼆９２２５⼆４６１３⼆２３０６⼆assignedto
１１５３⼆５７６ｎｇ／Ｌ，进样１０µＬ，获取线性曲线三⼀⼀ＬＯＤ和ＬＯＱ测试溶液配制⽅法如下：取质量浓度为５７６ｎｇ／Ｌ的ＴＣＴ溶液，⽤疫苗基质稀释成质量浓度为２８８ｎｇ／Ｌ和０７４ｎｇ／Ｌ三
２⼀结果与讨论
２．１⼀ＴＣＴ对照品的结构鉴定
⼀⼀由于尚⽆商品化的ＴＣＴ对照品，在发展ＴＣＴ定量⽅法前需制备ＴＣＴ对照品三根据⽂献［２］⽅法制备⼆纯化得到ＴＣＴ样品后⽤ＬＣＭＳ?ＩＴ?ＴＯＦ鉴定其结构三根据ＬＣＭＳ?ＩＴ?ＴＯＦ的⼀级质谱数据（图１ａ）结合ｆｏｒｍｕｌ
ａｐｒｅｄｉｃｔｏｒ软件测得ＴＣＴ分⼦式为Ｃ３７Ｈ５９Ｎ７Ｏ２０，该结构与⽂献［２］报道⼀致三由于所得ＴＣＴ对照品质量较少（０１ｍｇ）且ＴＣＴ固体对照品容易吸⽔（核磁氢谱中受⽔峰影响较⼤），难以实现⽤核磁共振测试其纯度，本⽂采⽤质谱和紫外光谱法辅助测试样品纯度三在ｍ／ｚ１００２０００范围内和在２００４００ｎｍ范围内分别获取ＴＣＴ总离⼦流图（图１ｃ）和
紫外光谱图（图１ｄ），其中２１０ｎｍ处的⾊谱图见图１ｄ三从图１ｃ可以看到，除ＴＣＴ主峰以外，⽆其他杂质峰检出三如图１ｄ所⽰，ＴＣＴ样品中⽆杂质峰检出三由于ＴＣＴ紫外吸收弱，低浓度ＴＣＴ也⽆法被紫外检测器检出三
２．２⼀⾊谱条件优化
２．２．１⼀⾊谱模式的选择
⼀⼀由于⼤分⼦化合物（如疫苗中的铝佐剂⼆蛋⽩质等）容易堵塞分离系统，污染⾊谱柱，导致系统压⼒升⾼⼆保留时间漂移和⾊谱峰变形，因此需要采⽤适当的前处理步骤将其去除三蛋⽩质沉淀技术（ＰＰＴ）［９］是常⽤的蛋⽩质沉淀和铝佐剂去除⽅法三ＰＰＴ处理后的样品通常溶解在⾼浓度有机溶剂中三在反相分离（ＲＰＬＣ）模式中，⾼浓度有机溶剂为强洗脱溶剂，以⾼浓度有机溶剂为样品溶剂容易造成ＲＰＬＣ分离⾊谱峰分叉⼆变形甚⾄穿透等溶剂效应现象［１０－１２］三在ＨＩＬＩＣ模式中⾼浓度有机溶剂为弱洗脱溶剂［１３］，不但没有ＲＰＬＣ分离出现的溶剂效应，当ＨＩＬＩＣ分离初始流动相中有机相⽐例低于样品溶剂中有机溶剂⽐例时，还具有柱头富集的作⽤三虽然ＴＣＴ在ＲＰＬＣ和ＨＩＬＩＣ模式中均可保留，但ＨＩＬＩＣ模式具有与ＰＰＴ处理溶剂兼容性的优点
三图１⼀ＬＣＭＳ?ＩＴ?ＴＯＦ所得ＴＣＴ的（ａ）⼀级质谱图⼆（ｂ）⼆级质谱图⼆（ｃ）总离⼦流图以及（ｄ）ＴＣＴ对照品的紫外光谱图Ｆｉｇ．１⼀（ａ）ＭＳｓｐｅｃｔｒｕｍ，（ｂ）ＭＳ２ｓｐｅｃｔｒｕｍ，（ｃ）ｔｏｔａｌ
ｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＣＴｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＬＣＭＳ?ＩＴ?
ＴＯＦａｎｄ（ｄ）ＵＶ／ＶｉｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＣＴ
⼀Ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ１０µＬ１ｍｇ／ＬＴＣＴｔｏｏｂｔａｉｎｔｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＣＴｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆｍ／ｚ１００－２０００．Ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ１０µＬ０１ｍｇ／ｍＬＴＣＴｔｏｏｂｔａｉｎ３ＤＵＶ／ＶｉｓｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＴＣＴｉｎｔｈｅｗａｖｅ?ｌｅｎｇｔｈｒａｎｇｅｏｆ１９０－４００ｎｍ．
汕头翻译公司四８５１四
⼀第２期
龙⼀珍，等：液相⾊谱?串联质谱法测定百⽇咳和百⽩破疫苗中百⽇咳杆菌⽓管细胞毒素
因此，选择ＨＩＬＩＣ模式⽤于疫苗中ＴＣＴ的分离三２．２．２⼀流动相组成的优化
⼀⼀本⽂考察了流动相ｐＨ值（３０６３）⼆缓冲盐浓度（５２０ｍｍｏｌ／Ｌ）和初始⼄腈体积分数（８５％
６０％）对ＴＣＴ保留⾏为的影响，如图２所⽰三随着流动相中ｐＨ的增加，ＴＣＴ保留增强且呈现拖尾峰图２⼀不同流动相组成下ＴＣＴ的ＭＲＭ图Ｆｉｇ．２⼀ＭＲＭｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆＴＣＴｏｂｔａｉｎｅｄ
ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｓ
⼀Ａｍｍｏｎｉａｆｏｒｍａｔｂｕｆｆｅｒ：ａ．５ｍｍｏｌ／Ｌａｍｍｏｎｉａｆｏｒｍａｔ（ｐＨ５０）；ｂ．５ｍｍｏｌ／Ｌａｍｍｏｎｉａｆｏｒｍａｔ（ｐＨ３５）；ｃ．１０ｍｍｏｌ／Ｌａｍｍｏｎｉａｆｏｒｍａｔ（ｐＨ３５）．
⼀ＭｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡ：ａｍｍｏｎｉａｆｏｒｍａｔｂｕｆｆｅｒ；ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢ：ａｍｍｏｎｉａｆｏｒｍａｔｂｕｆｆｅｒｉｎａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ．Ｆｌｏｗｒａｔｅ：０３ｍＬ／ｍｉｎ．Ｇｒａｄｉｅｎｔ：０－５ｍｉｎ，７５％Ｂ－２０％Ｂ；５０－５１ｍｉｎ，２０％Ｂ－７５％Ｂ；５１－９０ｍｉｎ，７５％Ｂ．
（图２ａ），ｐＨ过低不利于⾊谱柱的长期稳定性，综合考虑选择ｐＨ３５⽤于ＴＣＴ分离三ｐＨ３
４是甲酸铵的常⽤缓冲范围，故选择甲酸铵作为缓冲盐三流动相中缓冲盐浓度的增加可增加亲⽔层的极性，增强化合物的亲⽔保留，但同时降低离⼦交换保留和增加ＭＳ检测背景噪⾳三本⽂选择１０ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵作为ＴＣＴ分离的缓冲盐浓度，该浓度相对于
５ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵（图２ｂ）作流动相添加剂⽆明显ＭＳ背景增加［１２］，且ＴＣＴ峰形更为对称⼆柱效更⾼（图２ｃ），有利于提⾼检测灵敏度三随着初始流动相中⼄腈含量的减少，ＴＣＴ保留变弱，因此确定初始流动相中⼄腈的体积分数为７５％，并在５ｍｉｎ内线性降低到２０％三该起始体积分数（７５％）低于ＰＰＴ处理所得样品中⼄腈的体积分数（８０％），可避免溶剂强度带来的溶剂效应［１４］三如图２ｃ所⽰，ＴＣＴ在⼄腈体积分数约为３６％时从⾊谱柱洗脱，该体积分数⾼于Ｃ１８分离ＴＣＴ时所⽤⼄腈含量（２０％）三当⼄腈体积分数低于８０％时，随着⼄腈体积分数的增加，可有效增加雾化效率［１５］，从⽽提⾼检测灵敏度三
２．３⼀ＴＣＴ定量分析时质谱条件的优化
