我们的爱结束了
佐剂是指加入到疫苗制剂后能有效促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂的选择是疫苗乳化工艺的基础,稳定的疫苗乳剂能有效提高动物抵抗疫病的能力。因此,选择合适的佐剂,确定最佳的水相与油相比例,对于疫苗的稳定性具有重要的意义。目前,市场的口蹄疫灭活疫苗均采用ISA 206佐剂进行乳化,新型的基因工程
口蹄疫基因工程疫苗
不同佐剂水相配比优化研究
刘 斌1,2,陈晓宇2,黄银君2,牟克斌2,张云娟3,胡永浩1
(1. 甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;2. 天津威特生物医药有限责任公司,天津 300301;
3. 福建省浦城县动物卫生监督所,福建浦城 353400)
摘 要:[目的]选择一种适合口蹄疫基因工程疫苗生产的佐剂。[方法]通过ISA 206和ISA201 VG油佐剂乳
化后物理性状检验,参照现有口蹄疫灭活疫苗乳化工艺,选用ISA 206和ISA201 VG油佐剂,分别用4.6:5.4、1:1、
5.4:4.6的水相和油相比例进行乳化,制备疫苗,于2~8 ℃保存15个月,分别于第3、6、9、12、15个月取样,
进行疫苗物理性状检验。[结果] ISA201VG佐剂疫苗物理性状好于ISA 206油佐剂;疫苗水相和油相最佳配制
比例为1:1;疫苗的外观、剂型、稳定性和黏度均符合产品的质量要求。[结论] ISA201VG佐剂可以作为口蹄
疫基因工程疫苗佐剂使用。
关键词:乳化;疫苗;佐剂;口蹄疫
中图分类号:S851.3 文献标识码:A 文章编号:1005-944X(2017)07-0096-04
DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.027
Optimization of Water Mixture Ratio of Different Adjuvants of
FMD Gene Engineering Vaccine
Liu Bin1,2,Chen Xiaoyu2,Huang Yinjun2,Mu Kebin2,Zhang Yunjuan3,Hu Yonghao1(1. College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070;2. Tianjin Witte Biological Medicine Co. Ltd,Tianjin 300301;3. Pucheng Animal Health Inspection Institution,Pucheng,Fujian 264000)
Abstract:[Objective] In order to choo an adjuvant suitable for foot-and-mouth dia(FMD)of the genetic engineering vaccine. [Methods] By ISA 206 and ISA201 VG emulsified oil adjuvants after physical properties test,according to the existing FMD inactivated vaccines emulsification process,choosing the ISA 206 and ISA201 VG oil adjuvant,using the proportion of water and oil pha emulsification of 4.6:5.4,1:1 and 5.4:4.6 respectively,the
vaccine was prepared and then was saved at 2~8 ℃. The samples were tested of vaccine physical characteristics at the
third,sixth,ninth,12th and 15th month,respectively. [Results] It´s showed that ISA201VG adjuvant vaccine was better than ISA 206 oil adjuvants in physical properties. The best preparation ratio of vaccine water pha and oil pha
was 1:1. The appearance,formulation,stability and viscosity of the vaccine were all satisfactory in product quality.
[Conclusion] ISA201VG adjuvant could be ud as the dia gene engineering vaccine adjuvant.
Key words:emulsify;vaccine;adjuvant;FMD
基金项目:天津市支持科研院所来津发展项目
(16PTYJNC00060)
通信作者:胡永浩
疫苗暂时还未见适合的乳化佐剂。ISA 201 VG佐剂是一种针对基因工程产品研发的一种新型佐剂。与ISA 206相比,ISA 201VG可以更有效地改善免疫反应和保护力,可用于制备针对病原体族交叉保护型疫苗,诱导产生更高水平的IgG2a和TCD8+[1]。因此,本研究采用新型ISA 201VG与原ISA 206佐剂进行乳化后疫苗的物理性状对比实验,已确定更适合基因工程疫苗产品的乳化佐剂。
水包油包水剂型(W/O/W)是目前口蹄疫疫苗的主要剂型[2],从内到外依次具有内水相、内-水油界面膜、油相、外-油水界面膜、外水相等。这种性质使它能将一些性质不同的物质溶解在不同的相中,
bumper
从而起到缓释、隔离、保护的作用。因此在化妆品[3]、生物制剂[4]、食品[5]等领域都得到广泛应用。乳剂的稳定性包括复合界面膜、优化油相组成、稳定内水相、改进制备工艺等方面[6-7]。稳定的乳剂状态,能刺激动物产生长久持续的免疫反应,直接关系到产品质量,所以多数疫苗生产企业将质量控制中的物理性状检验列为重中之重。
1 材料与方法
1.1 试剂
中间品纯化抗原,由天津威特生物医药有限责任公司发酵工程疫苗生产线提供;油佐剂ISA 206和ISA 201 VG,购自赛彼科(上海)特殊化学品有限公司;其他分析纯试剂,均购自国药集团。
1.2 仪器与设备
移液器,购自德国 Eppendorf公司;医用离心机(型号L720R-3),购自湘仪公司;洁净工作台(型号SW-CJ-2FD),购自苏净安泰公司;小型乳化机,购自德国FLUKO公司;黏度仪,购自美Brookfield公司。
1.3 方法
1.3.1 水相和油相配制比例。以中间品检验合格抗原作为水相,ISA 206和ISA 201 VG油佐剂为油相。分别按照水相和油相为4.6:5.4、1:1、5.4:4.6进行疫苗乳化,分ISA 206组与ISA 201 VG组,每组3批,编号为BC01(水油比为4.6:5.4)、BC02(水油比为1:1)、BC03(水油比为5.4:4.6)。将乳化后的疫苗分装,2~8℃保存;分别于第3、6、9、12、15个月取样,进行物理性状检验。
1.3.2 疫苗乳化。参照赛彼科公司提供的使用Montanide TM ISA佐剂制备水包油包水型(W/O/W)乳剂方法制备。
1.3.3 物理性状检验
1.3.3.1 外观。眼观乳白色略带黏滞性乳状液。
1.3.3.2 剂型。采用滴液实验,取1只清洁吸管,将乳化后的ISA 206和ISA 201 VG乳剂滴入清洁冷水中,液体停留在水面判定为水包油型(W/O);液滴溶入水中判定为油包水型(O/W);一部分停留在水面形成白色圈状,另一部分溶于水中,呈云雾状扩散,判定为水包油包水型(W/O/W)。
1.3.3.3 稳定性。采用离心分层后的水相体积衡量,吸取疫苗10 mL加入离心管中,以3 000 r/min 离心15 min,读取离心管中的底部析出的水相的体积,管底析出的水相不超过0.5 mL为合格。
1.3.3.4 黏度。按《中国兽药典》(2010年版)附录,使用黏度计法进行检验,先将存放在2~8 ℃的
ricky gervais冷库中的乳剂置(20±0.1)℃水浴锅内30 min;如果直接取样检测,则不作水浴处理。将乳剂充分摇匀,然后倒入300 mL锥形烧杯,将黏度仪转子浸入乳剂中;将转子以一定的角速度旋转,待显示屏上cP数值稳定后,记录黏度值。黏度小于200 cP 判定为合格。
2 结果
2.1 外观
所有乳剂眼观均为乳白色略带粘滞性乳状液(表1、表2)。
2.2 剂型
所有乳剂滴入水中均呈现云雾中扩散,判定剂型为水包油包水型(W/O/W)(表1、表2)。
2.3 稳定性
以ISA 206和ISA 201 VG油佐剂为油相不同比例的乳剂,保存15个月,两种佐剂显示结果大致相同。通过稳定性检验表明BC02(水相与油相比例1:1)组疫苗乳化效果最好,在12个月保存期内,物理性状稳定,未出现分层、破乳现象,第
15个月离心检验中略有水相析出。在第15个月,疫苗离心后析出水相略有升高,但外观、剂型、稳定性、黏度仍符合标准要求;BC01和BC03组疫苗在保存期内均有不同程度分层,保存至第9个月时,BC01离心油相析出较多,BC03离心水相析出较多(表1、表2)。2.4 黏度
所有乳剂通过黏度计检测,黏度均未超过40 cP ,符合小于200 cP 口蹄疫疫苗质量标准(表1、表2)。
3 讨论
动物疫苗常用来接种免疫动物,它有助于动物机体抵御外来病原体、毒素等的入侵。在疫苗的研发过程中需要从多个因素对其进行衡量。一种好的疫苗除了具有高效性、稳定性、持久性外,还必须具备安全性,即被免疫动物所受到的刺激小、副反应小等。这就使疫苗研究涉及到其重要的组成部分,佐剂的选择与配比。佐剂最初被发现可增强疫苗的免疫效力。能通过增强局部炎症反应,提高对免疫反应的诱导。其特有的贮库效应能使抗原缓慢且持续性地进入机体,通过缓释减少对机体的刺激,延长抗原作用时间,保持长久稳定的免疫效果,防止抗原过快退化
[8-10]
。同时佐剂能增强抗原呈递,
提高免疫应答,有些佐剂还具有靴向效应。有效的佐剂应增强抗原呈递并促进T 细胞与B 细胞的激活。抗原停留在注射部位或淋巴结的持久性成为影响免疫反应效果持续性的重要因素。佐剂效应己被
证明,抗原从注射部位释放的速率是维持抗原特异
疫苗编号保存时间(月)
外观
剂型稳定性黏度(cP )BC01
动画片下载地址
0乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 233乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 256
乳白色略带粘滞性乳状液
水包油包水型(W/O/W )
水相析出不超过0.5 mL 259乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL ,
油相析出0.6 mL 2612乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL ,油相析出0.8 mL 2315乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL ,油相析出1.1 mL 21BC02
0乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
293
乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
306乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
299乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
圣诞节英文
2712乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 2615乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 26BC03
0乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 343
乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 336乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL
369乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型
(W/O/W )水相析出0.8 mL
3212乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型
(W/O/W )水相析出1.1 mL
3215
乳白色略带粘滞性乳状液
水包油包水型
(W/O/W )
水相析出1.2 mL
30
疫苗编号保存时间(月)
外观
剂型稳定性黏度(cP )BC01
rowdy
0乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 223乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 256乳白色略带粘滞性乳状液
水包油包水型(W/O/W )
水相析出不超过0.5 mL 239乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL ,油相析出0.5 mL 2612乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL ,油相析出0.6 mL 2415乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL ,油相析出0.8 mL 20BC020乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
303乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
286乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
319乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
2712乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )无水相、油相析出
2515乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 25BC03
0乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 353
乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL 336乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出不超过0.5 mL
37
9乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出0.7 mL 3212乳白色略带粘滞性乳状液水包油包水型(W/O/W )水相析出0.9 mL 3315
乳白色略带粘滞性乳状液
水包油包水型(W/O/W )
水相析出1.0 mL 30
性免疫应答的关键因素[11]。根据佐剂的作用机制,选择佐剂可以从以下几方面进行参考:①发病机
制清楚,佐剂可根据疫苗进行选择,达到防护免疫反应的效果;②免疫学和发病机制尚不清楚,从引发不同免疫反应的佐剂中进行选择;③利用己有研究将佐剂联用,根据所需加强不同的免疫反应,从而达到更好的佐剂效应[12]。
mba成绩本试验从不同佐剂与水相油相配制比例的选择上对口蹄疫基因工程疫苗进行了研究,旨在从物理性状检验判定一种与之匹配的新型基因工程疫苗的佐剂。除此之外,还需根据动物免疫抗体的检验结果来进行评价。
teach
基层防疫工作者在疫苗的使用中,能从疫苗的颜色、状态简单判断一种疫苗是否符合注射标准、是否污染、是否过期。从成品检验的物理性状检验来分析疫苗的乳化工艺,能最直观、简便、快速的判断疫苗的优劣。一个成熟的疫苗乳化工艺,关系到整个产品的质量,它需要从乳化的温度控制、搅拌搅拌、压力、油水相混合等因素进行综合衡量,这就需要与其相匹配的检验方法与标准。一种新型基因工程疫苗从工艺开发到检验标准制定都是漫长的过程,需要借鉴与参考同类产品的技术来进行工艺研究,才能生产出合格而又优质的产品,使其早日面市,这也将为口蹄疫疫苗的多元化发展提供一种新的思路。
参考文献:
[1] LI D,ZHOU C X,SHE D L,et al. The comparison of the efficacy of swine FMD vaccine emulsi
fied with oil adjuvant of ISA 201VG or ISA 206 VG [J]. Journal of Biosciences and Medicines,2013,1(3):22-25.
[2] PERVAIZ D,RAMYA K,NURU S,et al. Montanide IS 201 adjuvanted FMD vaccine induces improved immune respons and protection in cattle [J]. Vaccine,2013,31(33):3327-3332.
[3] TADROS T F. Future development in cosmetic formulations [J]. Int J Cosmet Sci,1992,14(3):93-111.惊喜 英文
[4] LU B. New Techniques and New Dosage Forms of Drugs [M]. Beijing:Peoples´ Medical Publishing Hou,1998:53-106.
[5] NISSIM G. Double emulsionsscope,limitations and new achievements [J]. Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,1997(123/124):233-246. [6] NISSIM G. Progress in stabilization and transport phenomena of double emulsions in food applications [J]. Lebensmitted Wisnschaft and Technologie,1997,30(3):222-235.
[7] KANOUNI M,BOSANO H L,NAOULI N. Preparation of a stable double emusion(W/O/W):role of the interfacial films on the stability of the system [J]. Advances in Colloid and Interface Science,2002,99(3):229-254.
equalization
[8] MAK T W,SAUNDERS M. Primer to the lmmune Respon [M]. Beijing:Science Publishing Hou,2012:243-248.
[9] 戴波涛,赵刚. 兽用疫苗佐剂研究现状[J]. 现代畜牧兽医,2013(2):41-43.
[10] 厍大亮. 新型兽用疫苗佐剂研究进展[J]. 中国兽药杂志,2011,45(4):44-48.
[11] LIU Y,WANG L,ZHANG Y,et al. Uniform-sized water-in-oil vaccine formulations enhance immune respon against Newcastle dia and avian influenze in chickens[J]. International Immunopharmacology,2014,23(2):603-608.
[12] JOHN C C,ALAN R C. Adjuvants a Classification and Review of Their Modes of Action [J]. Vaccine,1997,15(3):248-256.
(责任编辑:朱迪国)