甘蓝型油菜-埃塞俄比亚芥种间杂交非整倍体后代的遗传
祁玉洁;袁世峰;戚存扣
【摘 要】非整倍体Nj04-089为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)与埃塞俄比亚芥(B.carinata A.Br.)种间杂交后代中获得的附加系.为分析Nj04-089的遗传特性,利用显微镜对Nj04-089自交后代的根尖细胞染色体进行计数、对花粉母细胞染色体分裂行为进行观察,并采用PCR、GISH和Southern杂交等技术对Nj04-089的2个连续自交后代的附加染色体进行了遗传分析.结果显示:这两个连续自交世代根尖细胞染色体数2n =37 ～51条；花粉母细胞减数分裂的中期染色体构型分别为(0-4)Ⅰ+(16-23)Ⅱ+(0-2)Ⅲ和(0-8)Ⅰ+(14-24)Ⅱ+(0-4)Ⅲ+(0-1)Ⅳ,且观察到染色体桥、染色体落后、分裂周期不同步等异常行为.结果表明在该非整倍体后代中未检测到芸薹属B组染色体或大的片段,推测非整倍体附加的染色体并非整条或大片段B组染色体.
【期刊名称】《中国油料作物学报》
【年(卷),期】2013(035)002
【总页数】6页(P117-122)
【关键词】万物网甘蓝型油菜;埃塞俄比亚芥;非整倍体;基因组原位杂交;Southern杂交
conference是什么意思【作 者】fold祁玉洁;袁世峰;戚存扣
【作者单位】南京农业大学农学院,江苏 南京,210095;南京农业大学农学院,江苏 南京,210095;农业部长江下游棉花油菜重点实验室,江苏南京,210014
【正文语种】儿童夏令营中 文
【中图分类】S565.403
芸薹属(Brassica)是芸薹(Brassicaceae)中最重要的一个属。芸薹属包括白菜型油菜(B.rapa，AA，2n=20)、黑芥(B.nigra，BB，2n=16)和甘蓝(B.oleracea，CC，2n=18)三个基本种，以及芥菜型油菜(B.juncea，AABB，2n=36)、甘蓝型油菜(B.napus，AACC，2n=38)和埃塞俄比亚芥(B.carinata，BBCC，2n=34)三个异源四倍体物种［1］。
甘蓝型油菜起源于欧洲，遗传基础单一。通过细胞工程或染色体工程途径构建成套染色体组附加系可用来进行植物基因组分拆、基因的染色体定位［2］、基因的剂量效应研究［3
］、额外染色体的遗传连锁群创建［4］、将遗传连锁群定向到相应的染色体上［5］等理论和应用研究。目前，通过染色体工程途径已获得芸薹属植物种间非整倍体材料，包括甘蓝型油菜－黑芥二体附加系［6］、甘蓝型油菜－萝卜二体附加系［7］、甘蓝型油菜 － 白芥二体附加系［8］、甘蓝型油菜－诸葛菜单体附加系［9］、获得甘蓝型油菜－埃芥二体附加系［10］和甘蓝型油菜－黑芥异代换系［11］等。有关芸薹属植物种内非整倍体如甘蓝型油菜三体、双三体、双四体［12］、单体、双单体和缺体［11］等的研究报道也在不断增加。埃塞俄比亚芥具有耐干旱、抗裂角、黄种皮等诸多优良农艺性状［13］。已通过甘蓝型油菜/埃塞俄比亚芥种间杂交、回交将埃芥的黄种皮性状转移到甘蓝型油菜中［14］，并从该种间杂交组合后代获得一个多体附加系材料［10］。本文报道该多体附加系衍生后代植株的遗传组成及附加染色体的遗传规律。
1 材料与方法
1.1 材料
以［(宁油 10号(B.napus)×Dodolla(B.carinata))F1×宁油10号］连续自交4代后的群体中出现的多体附加系植株 NJ04－089为起始材料［10］。经连续自交选育，以其F3、F4群体
植株、盆栽白菜型油菜、黑芥、羽衣甘蓝、宁油10号和Dodolla作为供试材料。
1.2 体细胞染色体数观察
取种子置于培养皿中，25℃恒温培养箱中培养发根。当幼根长到1.5cm左右时取根尖，置于0.002mol/L的8－羟基喹啉溶液中22℃处理3.5～4 h，蒸馏水冲洗干净，移入卡诺氏液中固定24h。压片前，用混合酶液包括0.8%(m/V)的纤维素酶R－10(Japan)+0.4%(m/V)的果胶酶 Y－23(Japan)+0.8%(m/V)的蜗牛酶处理1.5～2h，然后用10%改良卡宝品红溶液染色，Olympus BX51显微镜下观察并摄影。
1.3 花粉母细胞(PMC)减数分裂观察
arm是什么意思中文soya取幼嫩花蕾放入卡诺氏固定液中固定24h。镜检筛选处于减数分裂期的花蕾，挑出花药置于固定液中4℃下保存。压片前，用混合酶液处理3.5～4 h，然后用10%改良卡宝品红染色，在Olympus BX51显微镜下镜检观察并摄影。
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1.4 原位杂交(GISH)分析
将处于减数分裂期的PMC置于混合酶液中37℃下酶解3.5～4h。染色体制片参照 Zhong等人［15］的方法进行。采用CTAB法大量提取全基因组DNA并纯化。采用缺刻平移法标记黑芥基因组DNA作为探针。甘蓝型油菜基因组DNA于沸水浴处理30min，使片段大小在200～500bp左右作为封阻;基因组原位杂交的程序参照 Snowdon［16］和 Li［17］等人的方法进行。
1.5 PCR与Southern杂交分析
采用PCR的方法检测F3群体植株中是否渗入B 基因组片段，引物序列是 Schelfhout［18］和 Márquez－Lema等人［19］发表的9对引物，引物序号为pBNBH35、Ni2－A02、Ni2 －A08、Ni2 －A11、Ni3 －H07、Ni4－A09、Ni4－C06、Ni4－D01和Ni4－G02。对F4群体植株花粉母细胞采用染色体制片技术进行染色体数目观察，选择其中6株非整倍体植株(染色体数目大于38)，采用CTAB法提取各单株全基因组DNA，每个样品DNA含量约20μg，用 Hind III酶切样品;采用Southern杂交的方法检测芸薹属B基因组染色体着丝粒区域一段特异性重复序列pBNBH35，以Dig－11－dUTP作为底物合成探针序列。Southern杂交按Roche公司的DIG－Southern方法进行。
2 结果与分析
2.1 多体附加系F3和F4群体植株体细胞染色体数
怎样画生活妆多体附加系F3和F4群体植株的根尖细胞染色体数存在着 2n=44、41、40、39、38、37 这几种类型(图1)。甘蓝型油菜/埃塞俄比亚芥种间杂交和回交后代中，体细胞染色体数多于甘蓝型油菜，有1～6条附加染色体，表明其为非整倍体植株。
2.2 花粉母细胞减数分裂染色体行为
两个世代群体的花粉母细胞减数分裂中期染色体行为观察结果，F3群体染色体基本构型为(0－4)Ⅰ +(16－23)Ⅱ +(0－2)Ⅲ;F4群体的染色体基本构型为(0－8)Ⅰ +(14－24)Ⅱ +(0－4)Ⅲ+(0－1)Ⅳ(表1)。花粉母细胞减数分裂过程中观察到单价体(图2a，b)、三价体(图2b)、四价体(图2c)、环状多价体(图2d)、染色体桥(图2e)、落后染色体(图2g)和分裂周期不同步现象(图2h)。在观察的群体中各单株之间染色体数目存在客观的差异，这可能因为PMC减数分裂期间染色体不均等分离造成不同染色体数目的配子相互结合而形成。由于个体之间染色体数目存在的差异可能也是导致植株根尖细胞与花粉母细胞染色体数目观察结果不同的原因。
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图1 多体附加系F3和F4群体植株根尖细胞染色体数Fig.1 Chromosome numbers of root－tip cell from F3 and F4 lines注:a:根尖染色体数目2n=44;b:根尖染色体数目2n=41;c:根尖染色体数目2n=40;d:根尖染色体数目2n=39;e:根尖染色体数目2n=38;f:根尖染色体数目2n=37;标尺:10μmNote:Root－tip cells with a(2n=44)，b(2n=41)，c(2n=40)，d(2n=39)，e(2n=38)and f(2n=37).Bar=10μm
表1 PMCs M I染色体基本配对构型Table 1 Chromosome pairing behavior in M I of PMCs of F3 and F4 linesF3 7 184 0～4 16～23 0～2 0 F4 18 501 0～8 14～24 0～4 0～1
图2 F4群体花粉母细胞减数分裂染色体行为Fig.2 Chromosome behaviors of pollen mother cellmeiosis of F4注:a:减数分裂中期Ⅰ染色体构型为22Ⅱ+3Ⅰ，箭头指向单价体;b:减数分裂中期Ⅰ染色体构型为23II+1I，箭头指向单价体;c，d:减数分裂中期Ⅰ，箭头指向环状多价体;e:减数分裂后期Ⅰ(AI)染色体出现不均等分离，染色体呈25∶26分离，箭头指向染色体桥;f:减数分裂后期Ⅰ(AI)染色体出现不均等分离，染色体数呈20∶24分离;g:减数分裂后期Ⅰ(AI)，箭头指向落后染色体;h:减数分裂后期Ⅰ(AI)，分裂周期不同步;标尺10μmNote:a:metapha IPMC with 22Ⅱ +3I，arrow indicates univalent;b:metapha IPMC with 23Ⅱ +1I，arrow in
breakindicates univalent;c to d:metapha IPMC with ringmultivalent;e:anapha I，unequal disruption of chromosomes(25∶26)，arrow indicates chromosome bridges;f:anapha Iwith 20∶24 chromosomes in each polar;g:anapha I，arrow indicates lagged chromosome;h:anapha I:meiotic cycle asynchrony;Bar=10μm
