白花蛇舌草通过抑制ＣＸＣＲ３的表达调控非小细胞
肺癌细胞Ａ
５４９凋亡的机制研究胡同晨１，果 然２，魏晓琼１，彭华利１，周 洋１，杨 帆１
（１．乐山市人民医院胸心外科，四川乐山６１４０００；２．内蒙古自治区人民医院肿瘤外科，内蒙古呼和浩特０１００１０）ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０２０．１２．０３１收稿日期：２０２０ ７ ３１；修回日期：２０２０ １０ １４基金项目：四川省科技计划项目（编号：２０１４ｚｃ００３８）通讯作者：果然。
摘要：目的 探讨白花蛇舌草引起非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡的潜在机制。方法 使用白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ
５４９后，检测其凋亡水平。通过ＲＮＡ ｓｅｑ检测白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后的ｍｉＲＮＡ差异。通过ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓ过表达差异ｍｉＲＮＡ，检测非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平。通过ｍｉＲＤＢ和荧光素酶报告系统分析ｍｉＲＮＡ的靶向底物。结果 白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５）；ｈｓａ ｍｉＲ ２１１０、ｈｓａ ｍｉＲ １２９０、ｈｓａ ｍｉＲ ３１４４ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ａ ５ｐ
、ｈｓａ ｍｉＲ ６８５７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７８０ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４４８７、ｈｓａ ｍｉＲ ６７６３ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４９７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７７０ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １９５ ５ｐ、ｈａｓ ｍｉＲ ４４３、ｈｓａ ｍｉＲ ４７４９ ５ｐ的表达量升高（Ｐ＜０．０５）。过表达ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５）；敲低ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５）。此外，白花蛇舌草和ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ同时处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平无显著变化（Ｐ＞０．０５）。ｍｉＲＤＢ在线分析和荧光素酶报告实验发现ｍ
atuｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ靶向ＣＸＣＲ３的非编码区（Ｐ＜０．０５）。过表达ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５）；敲低ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５）。同时，白花蛇舌草处理后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的蛋白水平和ｍＲＮＡ水平均下降（Ｐ＜０．０５）。同时敲低ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５）；同时过表达ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５）；将白花蛇舌草处理Ａ５４９细胞并过表达ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５）。结论 白花蛇舌草通过促进ｍｉＲ ４５０strong的反义词
ａ ２ ３ｐ的表达后，ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ靶向ＣＸＣＲ３ｍＲＮＡ的非编码区，随后促进了非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡。关键词：白花蛇舌草； 非小细胞肺癌； Ａ５４９； 凋亡； ＣＸＣＲ３； ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ中图分类号：Ｒ７３４．２ 文献标识码：Ａ
ＡＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａｂｙＩｎｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｔｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＸＣＲ３ｉｎＲｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＡｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆ
Ｎｏｎ ｓｍａｌｌＣｅｌｌＬｕｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｌｌＡ５４９
ＨＵＴｏｎｇｃｈｅｎ１，ＧＵＯＲａｎ２，ＷＥＩＸｉａｏｑｉｏｎｇ１，ＰＥＮＧＨｕａｌｉ１，ＺＨＯＵＹａｎｇ１，ＹＡＮＧＦａｎ
１
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｈｏｒａｃｉｃａｎｄＨｅａｒｔＳｕｒｇｅｒｙ，ＬｅｓｈａｎＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｅｓｈａｎ６１４０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏ
ｌｉａＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００１０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｔｏｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９．ＭｅｔｈｏｄｓＡｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｏｎｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９，ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＴｈｅｍｉＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＮＡ ｓｅｑ．ＢｙｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｉＲＮＡ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｆｍｉＲＮＡｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｍｉＲＤＢａｎｄａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ｒｅｐｏｒｔｅｒｓｙｓｔｅｍ．
ＲｅｓｕｌｔｓＡｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｈｓａ ｍｉＲ ２１１０，ｈｓａ ｍｉＲ １２９０，ｈｓａ ｍｉＲ ３１４４ ５ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ １５ａ ５ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ ６８５７ ５ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ ６７８０ｂ ５ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ ４４８７，ｈｓａ ｍｉＲ ６７６３ ５ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ ４９７ ５ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ ６７７０ ５ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ １５ｂ ５ｐ，４５０ａ ２ ３ｐ，ｈｓａ ｍｉＲ １９５ ５ｐ，ｈａｓ ｍｉＲ ４４３，ａｎｄｈｓａ ｍｉＲ ４７４９ ５ｐａｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜
４
６１２ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｄｅｃ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１２
loveaffair
０．０５）．ＢｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＡ５４９ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａａｎｄｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ（Ｐ＞０．０
５）．ｍｉＲＤＢｏｎｌｉｎｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈａｔｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｔａｒｇｅｔｅｄｔｈｅｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆＣＸＣＲ３（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ３，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎＣＸＣＲ３，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ａｌｓｏ，ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌａｎｄｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＣＸＣＲ３ｉｎＡ５４９ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐａｎｄＣＸＣＲ３ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｉｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＞０．０５）．ＢｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐａｎｄＣＸＣＲ３，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｉｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＞０．０５）．ＡｆｔｅｒｔｒｅａｔｉｎｇＡ５４９ｃｅｌｌｓｗｉｔｈＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ３，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９（Ｐ＞０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｆｔｅｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ，Ｈｅｄｙｏ
ｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｗｉｌｌｔａｒｇｅｔｔｈｅｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆＣＸＣＲ３ｍＲＮＡ，ａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａ； Ｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ； Ａ５４９； Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ； ＣＸＣＲ３； ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ
肺癌可分为小细胞肺癌（ＳＣＬＣ）和非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）。肺癌的发病率和死亡率极高［１］。ＮＳＣＬＣ占肺癌总病例的８０％，是男性癌症相关死亡的主要原因，也是女性癌症相关死亡的重要原因［２］。在美国，每年约有２２万例肺癌新病例，其中１５万例死于肺癌。肺癌的主要原因是直接吸烟或继发性吸烟［３］。此外，空气污染、汽车尾气排放等因素也可导致肺癌发生。肺癌常伴有慢性支气管炎、肺心病、肺结核等疾病，且早期症状难以发现［４］。此外，肿瘤转移和血管因子介导的耐药较为常见，对肺癌的治疗效果不理想［５］。ＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａＷｉｌｌｄ，命名为“白花蛇舌草”，在传统中药中因其温和的有效性和低毒性，已被广泛应用于治疗各种疾病，包括癌症［６］。其含有苯丙类、蒽醌类、甾体、黄酮类、多糖等多种生物活性成分［７］。研究发现，白花蛇舌草能够在体外和体内抑制肺癌细胞增殖，并促进其凋亡［８］。目前，白花蛇舌草已经在临床上辅助治疗非小细胞肺癌［９］。然而，白花蛇舌草促进肺癌细胞凋亡的机制尚未十分明了。基于此，本研究使用非小细胞肺癌细胞Ａ５４９为研究对象，旨在探讨白花蛇舌草引
起非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡的机制。
材料和方法
１ 材料
六一儿童节的来历故事
白花蛇舌草水提物（ＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔ，ＨＤＷＥ）：３０ｇ白花蛇舌草加蒸馏水３Ｌ温火煎煮６０ｍｉｎ，加热沸腾３０ｍｉｎ，离心取上清液浓缩为３００ｍＬ，０．２２μｍ过滤除菌。ＴＲＩｚｏｌ试剂购自四川爱奇生物科技有限公司（货号：１５５９６ ０２６）。ｐｓｉＣＨＥＣＫ２质粒购自广州佰汇生物科技有限公司（货号：Ｐ０１９７）。ｈｓａ ｍｉＲ ２１１０、ｈｓａ ｍｉＲ １２９０、ｈｓａ ｍｉＲ ３１４４ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ａ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６８５７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７８０ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４４８７、ｈｓａ ｍｉＲ ６７６３ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４９７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７７０ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １９５ ５ｐ、ｈａｓ ｍｉＲ ４４３、ｈｓａ ｍｉＲ ４７４９ ５ｐ、ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｍｉｍｉｃｓ、ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ均由北京睿博兴科合成。ｓｉＣＸＣＲ３由吉凯基因合成。荧光定量ＰＣＲ试剂盒购自上海兢蔚生物科技有限公司（货号：ＢＬ７０５Ａ）。人肺腺癌细胞株Ａ５４９购自北京安鑫康科技有限公司（货号：ＫＧ００７ Ｇ）。ＣＸＣＲ３过表达质粒通过非小细胞肺癌细胞Ａ５
blazed４９的ｃＤＮＡ克隆至ｐＣＤＮＡ３．１表达载体上。反转录试剂盒购自昆明皇宝商贸有限公司（货号：２１８１６１）。ＧＡＰＤＨ抗体购自北京博奥派克生物科技有限公司（货号：ＭＯ２５０３８）。双荧光素酶报告基因试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司（货号：ＣＤＬＧ ４９９７）。ＣＸＣＲ３抗体购自昆明皇宝商贸有限公司（货号：ＧＴＸ５１５３２）。二抗购自北京海科鸿创生物科技有限公司（货号：Ｙ２０１１）。
２ 方法
网上热销产品 ２．１ 细胞培养与转染 人肺腺癌细胞株Ａ５４９在含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中培养，３７℃，５％ＣＯ
２
培养箱。使用体积分数１％的白花蛇舌草水提物处理Ａ５４９细胞。按照脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００转染ｈｓａ ｍｉＲ ２１１０、ｈｓａ ｍｉＲ １２９０、ｈｓａ ｍｉＲ ３１４４ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ａ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６８５７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７８０ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４４８７、ｈｓａ ｍｉＲ ６７６３ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４９７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７７０ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １９５ ５ｐ、ｈａｓ ｍｉＲ ４４３、ｈｓａ ｍｉＲ ４７４９ ５ｐ、ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｍｉｍｉｃ
ｓ、ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ３０ｈ后，进行后续实验。将白花蛇舌草水提物做一系列浓度梯度稀释后处理Ａ５４９细胞。除图１外，其余所
５
６
１
２
标记免疫分析与临床 ２０２０年１２月第２７卷第１２期
有实验白花蛇舌草水提物的使用浓度均为２００μｇ／ｍＬ。 ２．２ ＲＮＡ抽取与实时荧光定量ＰＣＲ 按照ＲＮＡ提取试剂盒的说明，使用Ｔｒｉｚｏｌ法提取对数生长期细胞样本的总ＲＮＡ。根据反转录试剂盒的指令
合成第一链ｃＤＮＡ。最后，按照ｑＲＴ ＰＣＲ试剂盒说明书检测Ｅ
ＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、ＩＧＦ２、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９、ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ的表
达水平。通过２－ΔΔ
Ｃｔ计算上述基因的相对表达水平。 ２．３ 免疫印迹 收集每组细胞并在冰上裂解２５ｍｉｎ。以１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。将上清液置于ＥＰ管中，并加入５×ＳＤＳ加载缓冲液并煮沸１０ｍｉｎ。
电泳后，用膜转移仪将蛋白质转移到Ｐ
英语常用交际用语ＶＤＦ膜上。将膜用５％脱脂奶粉封闭２ｈ。洗涤膜后，加入ＧＡＰＤＨ和ＣＸＣＲ３抗体并在４℃下温育过夜。然后，在４℃下加入二抗２ｈ。加入发光液体并曝光。 ２．４ ＲＮＡ Ｓｅｑ 分别用白花蛇舌草和ＰＢＳ处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，抽取非小细胞肺癌细
胞Ａ５４９的ＲＮＡ。ＲＮＡ样品被送到北京基因组研究所（中国深圳）进行商业性ＲＮＡ Ｓｅｑ服务和数据分
suits第二季
析。使用Ｓ
ＯＡＰａｌｉｇｎｅｒ／ＳＯＡＰ２不匹配，将干净的读段映射到ｈｕｍａｎ数据库。计算每个基因的纯净读数，然后将其标准化为每百万分之一读数（ｋｂＫＭ），
该读数将读数与基因表达水平相关。利用ｌ
ｏｇ２比率来确定基因调控。选择ｌｏｇ２比率为－１或ｌｏｇ２比率为１的免疫基因进行进一步分析。设置两个重复。 ２．５Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色 经过不同处理后，收集在６孔板上生长的漂浮非小细胞肺癌Ａ５４９细胞和胰
蛋白酶分离的细胞，并用冷的１×
ＰＢＳ洗涤。然后将细胞沉淀物用结合缓冲液重悬，并根据试剂盒方案用Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色。荧光显微镜观察。将实验组中凋亡细胞的百分比与对照转染组进行比较。所有样品一式三份测量。 ２．６ 荧光素酶报告实验 收集各组Ａ５４９细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册
操作。ｐ不好意思英语
ｓｉＣＨＥＣＫ２载体表达萤火虫和肾细胞荧光素酶活性。构建荧光素酶报告载体ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ ＣＸ ＣＲ３ ３′ＵＴＲＷＴ和ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ ＣＸＣＲ３ ３′ＵＴＲＭＵＴ。
转染２
４ｈ后测定荧光强度。肾素荧光素酶发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值显示ｍｉＲ ４５０ａ
２ ３ｐ与ＣＸＣＲ３的结合力。 ３ 统计学处理
所有实验数据采用ＳＰＳＳ２１．０软件进行分析。测量数据以均数±标准差表示，组间数据采用单因
素方差分析进行比较。两两比较采用Ｓ
ＮＫ ｑ检验。Ｐ＜０．０５被认为差异具有统计学意义。
结 果
１ 白花蛇舌草促进非小细胞肺癌细胞Ａ５４９
凋亡
使用白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，荧光显微镜发现Ａｎｎｅｘｉｎ阳性的早期凋亡细胞和ＰＩ阳性的晚期凋亡细胞的水平均上升（Ｐ＜０．０５），见图１Ａ。使用不同浓度的白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，Ａ５４９的凋亡水平呈时间依赖
性和浓度依赖性上升，见图１
Ｂ和图１Ｃ
。图１ 白花蛇舌草促进非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡
６
６１２ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｄｅｃ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１２
２ 白花蛇舌草操控ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ调控非小
细胞肺癌细胞Ａ
５４９的凋亡 白花蛇舌草处理非小细胞肺癌Ａ５４９细胞后，通过高通量测序发现ｈ
ｓａ ｍｉＲ ２１１０、ｈｓａ ｍｉＲ １２９０、ｈｓａ ｍｉＲ ３１４４ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ａ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６８５７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７８０ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４４８７、ｈｓａ ｍｉＲ ６７６３ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４９７ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ６７７０ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １５ｂ ５ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ、ｈｓａ ｍｉＲ １９５ ５ｐ、ｈａｓ ｍｉＲ ４４３、ｈｓａ ｍｉＲ ４７４９ ５ｐ的表达量升高（Ｐ＜０．０５），见图２。通过ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓ过表达上述ｍｉＲＮＡ后，发现过表达ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（
Ｐ＜０．０５），使用ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ敲低ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ
５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５），见图３和图４Ａ。此外，使用白花蛇舌草和ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ同时处理非小细胞肺癌细胞Ａ
５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平无显著变化（Ｐ＞０．０５），见图４Ｂ
。
图２ 白花蛇舌草处理后非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中
ｍｉＲＮＡ
的表达水平
注： Ｐ＜
０．０５图３ ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓ处理后非小细胞肺癌细胞
Ａ５４９
的凋亡水平
注： Ｐ＜
０．０５图４ 白花蛇舌草操控ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ调控非小细胞
肺癌细胞Ａ５４９的凋亡
３ ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ靶向ＣＸＣＲ３调控非小细胞
肺癌细胞Ａ５４９的凋亡
通过ｍｉＲＤＢ在线分析，发现ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ潜在靶向ＥＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、ＩＧＦ２、ＣＸＣＲ３、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９。通过ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐｍｉｍｉｃｓ过表达ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的表达量下降（Ｐ＜０．０５），而ＥＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、ＩＧＦ２、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；通过ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ敲低ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的表
达量上升（Ｐ＜０．０５），而ＥＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、ＩＧＦ２、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），见图５Ａ。通过荧光素酶报告实验发现ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ靶向ＣＸＣＲ３的非编码区（Ｐ＜０．０５），见图５Ｂ。通过ＣＸＣＲ３过表达质粒过表达ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌
７
６１２标记免疫分析与临床 ２０２０年１２月第２７卷第１２期
细胞Ａ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５），见图６Ａ和６Ｂ；通过ｓｉＣＸＣＲ３敲低ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５），见图６Ｃ和６Ｄ。同时，白花蛇舌草处理后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的蛋白水平和ｍＲＮＡ水平均下降（Ｐ＜０．０５），见７Ａ和７Ｂ。同时敲低ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡
水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５），见图８Ａ；同时过表达ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化，见图８Ｂ；将白花蛇舌草处理Ａ５４９细胞并过表达ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５），见图８Ｃ
。
莴笋的营养价值注： Ｐ＜
０．０５图５ ｍｉＲ ４５０ａ ２ ３ｐ靶向ＣＸＣＲ３的３
端非编码区
注： Ｐ＜
０．０５图６ ＣＸＣＲ３抑制非小细胞肺癌细胞Ａ５４９
的凋亡
注： Ｐ＜
０．０５图７ 白花蛇舌草抑制ＣＸＣＲ３的表达
８
６１２ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｄｅｃ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１２
