山西医科大学学报，2020年2月，第51卷第2期-235-
P2AR激动剂通过线粒体细胞凋亡途径改善大鼠心肌缺血再灌注损伤
刘通，史静怡，王利，闫泱锦，程康，冀永春*(西安市第三医院，西北大学附属医院心血管内科，西安 7202；通讯作者，)
摘要：目的研究09肾上腺素能受体激动剂(henbuterf)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响以及与线粒体细胞凋亡途径的关系。方法将44只SD大鼠分为假手术组、模型组和实验组。构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，实验组大鼠在模型组的基础上给予henbuterX(0.5mg/kg)处理。采用心电图观察大鼠心肌缺血再灌注心律失常现象，采用HE染色以及透射电镜观察组织病理状态以及线粒体形态，采用实时聚合酶链反应(RT-CCR)检测02AR、CaspaA、Bap、Cx43和PKC-s mRNA表达水平，采用蛋白质免疫印迹法检测以上基因的蛋白表达水平，采用全自动生化分析仪测定各组血清中CK-MB及LDH的含量。结果HE染色以及透射电镜结果显示，实验组大鼠心肌细胞坏死和线粒体肿胀较模型组得到明显的改善。与模型组相比，实验组大鼠心肌组织中09AR的mRNA和蛋白表达量均显著上调(P<0.05)。与假手术组比较，模型组及实验组大鼠血清中CK-MB及LDH含量均显著升高(P<0.05)，且实验组大鼠血清中CK-MB及LDH含量均显著低于模型组(P<0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bop和CaspaA蛋白表达水平显著上调，Cx43和PKC-s蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。与模型组比较，实验组大鼠心肌组织中Bap和Ca
spaA蛋白表达水平较模型组显著下调，Cx43和PKC-s蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。结论09肾上腺素能受体激动剂(henbuterf)能明显改善心肌缺血再灌注损伤，而这种作用主要是通过调节线粒体细胞凋亡途径实现。
关键词：02肾上腺素能受体激动剂(henbuterf)；心肌缺血再灌注损伤；线粒体；细胞凋亡
中图分类号：R343文献标志码：A文章编号：287-642(2828)14-235-04DOI：18.2753/j.imx.287-642.2828.10.089
p2-5dreneraic receytoa agonist impravvt ischemio-reperfusion injury in ratt thraugi mitochondriai apoptosit paihway
Lm Tong,Sffl Jingyi(WANG Li ,YAN Yangjin；CHENG Kang,JI Yongchun*(Deeartment f600x01011皿电0;,Xi'an Thira Hospital.ffffdden Hospdal f Northwest Undersita,XOan719019,Chinn；*Corresponning ouaov gL-mob-,186********@) Abstraci:Objective To stuPy We edect of09-sXrexergiv receptor agonist(clexbuterol)on myocardial isckemic-repenusion injury and its relationship with mitockondrial cell apoptosis pathway.Metafs Forth SD mW were divibeP into sham ogeradon group,moPei group and experimextai group.A mt moPei of myocardial isckemic-repenusion injury was consWuheb,and We mW in expenmextai group were treateb with clexbuterol(
015mg/Sg)bab on We WeaWiedt in moPei group.Electrocardiogram was ub to oPme We myocardial isckemic-repenusion arrUythmic.HE staining and transmission electron microscopy were ub to oPme We paWolovicai state and mitockondrial morphology-Real-Pme polymera chain reaction(RT-PCR)was ub to detect We mRNA expression levels of 09AR,CaspaA,Bap,C x43,PKC-s.Western blotting was ub to detect We protein levels of We aXove genes.And axtomativ bio-ckemicai analyzer was ub to determine We contexts of CK-MB and LDH in We rum of each group.Results HE staining and transmission electron microscopy showeb that myocardial cell necrosis and mitockondrial sweXing in experimextai group were significantly improveb.Compareb with moPei group,the mRNA and protein expression levels of09AR in We myocardial Ussue were significanUy incread in experimental group(P<0.03)■Compared with sham group,We rum CK-MB and LDH levels were significanUy in-creab in moPei group and experimextai gropp(P<0.03/,and We rum CK-MB and LDH levels in experimextai group were signifi-canUy lower than tho in moPei gmpp(P<0.03/:Compareb with sham group,the expression levels of B ox and CaspaA protein in We myocardial Ussue were significanUy up-reyulateb in moPei group,and We C x43and PKC-s protein expression levels were signifi-canUy UownAeaUateP(P<0.03).Compareb with moPei group,We expression levels of B ox and CaspaA protein in myocardial Ussue m experimextai group were significanUy Uowe-reaulateP,and We expre
ssion levels of Cx43and PKC-s protein were significanUy up-re-gulateb(P<0.03)■Conclusion09-sXrexergiv receptor agonist(clexbuterol)can significanUy improve We myocardial ischemiareperfusion injury,and this effect is mainly achieveX by regUating We mitockondrial cell apoptosis pathway.
Key wordt:09-sXredergiv receptor ayonist(clenbuterol);myocardial isckemic-repenusion injup；mitochondria；apoptosis
基金项目：西安市科技计划项目(201305094YX2SF(7//
作者简介：刘通，男,284-04生，博士，主治医师,E-mail:
收稿日期：2020-08-20
-1832-J Shani Med Univ,Dec2022,VP51No12
缺血性心肌病(ischemic cyammyonChy,KM)属于冠心病的一种特殊类型，是指由冠状动脉粥样硬化而引起长期心肌缺血，导致患者心肌弥漫性纤维化，产生与原发性扩张型心肌病类似的临床综合征［］，其是严重危胁人类健康的主要疾病之一⑵。随着冠心病发病率的不断增加,ICM对人类健康所造成的危害也日渐严重。目前对其治疗主要是及时有效的恢复血流，抢救“濒死”的心肌［7］。但是，再
灌注过程会对心肌造成一定的损伤，这种损伤被称为心肌缺血再灌注损伤(ischemic/mperfusion injury, KR)，该损伤因严重影响心肌梗死再灌注治疗的效果而逐渐成为研究重点⑷。研究表明，细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用。细胞凋亡中7条主要途径(线粒体、死亡受体及内质网)中线粒体途径为细胞凋亡的关键环节。近年来，通过调节线粒体通路抑制心肌细胞凋亡是研究心肌缺血损伤的一大重点［］。02肾上腺素受体(02-adre6erhlo receptors,02AR)在KR中具有重要的作用［］。研究发现，在心肌缺血时，过度激动02AR，导致心脏氧耗增多，最终导致心肌细胞坏死，激动01受体促进凋亡，而激动02受体有抗凋亡作用［］。CPu-buteal是选择性02受体激动剂，张秋芳等［］发现在心梗后长期联合应用02肾上腺受体阻断剂cPu-buteal可提高生存率，对心肌细胞有保护作用。由此，我们推测cPudutevt可能通过激动02受体对K R损伤具有保护作用，且主要是通过线粒体细胞凋亡途径发挥作用。因此本研究通过建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型在整体和细胞水平研究02肾上腺素能受体激动剂(cPnCutevl)对KR中线粒体细胞凋亡途径的影响，以期为冠心病的临床治疗提供参考。
1材料与方法
1.1实验试剂
戊巴比妥钠(Sigma,USA),TTC(Siumc-APhch),RNA提取试剂盒(Invitapen,USA)RT-PCR试剂盒(Fermetcs)，线粒体蛋白提取试剂盒(wPn34a)、BCA蛋白定量试剂盒(wPn04a):ELISA 试剂盒(Sigma
Aldhch),LDH和CK-MB(南京建成生物工程研究所)，抗体AR-C2(Abcom)B uo(Ab-com)、Caspasa-C(Abcom)、Cx43(Abcom)和PKC-a (Abcom)，电压依赖性阴离子通道蛋白1(voltayv-deueudeut anion channel protein1,VDAC1)兔抗大鼠多克隆抗体(沈阳万类,wP2799)。
1.2实验方法
12-1急性心肌缺血再灌注损伤大鼠模型的制备与分组49只体质量为259-300y的成年雄性Sprauue-DawPy(SD)大鼠购自兵器工业卫生研究所［SCXK(陕)2016-001］，随机分为假手术组、模型组和实验组，每组—只。大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠(1.5m/hy)麻醉后，进行气管插管，调节呼吸频率为99次/min，潮气量—m/hy，连接心电监护仪，于大鼠胸骨左侧第3、4肋间做手术切口，暴露心脏，剥离心包膜，采用7-0带线缝合针于左心耳下缘1cm处穿过待结扎加压。假手术组大鼠不结扎加压，仅在假手术开始前通过腹腔注射给予生理盐水(4m/hy)；模型组大鼠在结扎前通过腹腔注射给予生理盐水(4m/hy)并开始计时，观察到心电图ST段持续弓背抬高，确定心肌缺血成功,34min后轻抽鱼线再灌注705］。实验组大鼠在结扎前9 min通过腹腔注射给予cPnbutev-(0.7my/hy)，后续处理同模型组。再灌注结束后收集大鼠心脏和血液，进行相关指标检测。
1.7.7指标观察与组织学检查通过测量n导联心电图同步监测所有组别大鼠结扎34min后的心电图表现，并与术前心电图比较，观察大鼠心电图有无再灌注心律失常现象。取各组大鼠左室心尖部组织进行多
聚甲醛固定，常规石蜡包埋，再经过二甲苯脱蜡，经无水乙醇、95%乙醇和80%乙醇逐级漂洗，行苏木素一伊红(HE)染色，于光学显微镜下观察。
1.2.8线粒体超微结构观察大鼠造模结束取血后迅速剪下心脏，以生理盐水灌洗后在冰上分离左心室，取一小块组织置入2.5%戊二醛固定液中，并在固定液中迅速将其剪为体积约-mm7的小块，经过脱水、渗透、包埋聚合、切片等步骤，于透射电镜下找到心肌细胞内的线粒体进行观察并拍照。
1.2.2心肌酶检测造模结束后剪开颈部皮肤，分离颈静脉并以一次性医用取血管取血。血液静置34min后置入离心机，以7000r/min离心—min，血清移入EP管中，应用全自动生化分析仪测定各组血清中肌酸激酶同工酶MB(creatica yincsa MB, CK-MB)及乳酸脱氢酶((actate dehydapen丄DH)的含量。
12-9RNA提取和RT-CCR检测通过T/zol法从大鼠心肌组织细胞中提取总RNA，然后将纯化的RNA反转录为cDNAo再通过RT-CCR试剂盒定量
山西医科大学学报，2020年12月，第51卷第12期--37 -
检测p2AR 的mRNA 表达水平。使用Thermo Fishef
的Applied Biosystems 实时荧光定量PCR 仪器进行
检测，采用的软件为Mx3000P,PCR 程序为：95 C 预 热 14 miu,95 C - s,55 C 退火 1 miu,40 个循环反
应。弓 I 物序歹U ： p2AR , F ： 5' - CAGCAAAGGGACGAGt GTG - 3‘，R ： 5’ - AAGTAATGGCAAAGTAGCG - 3‘； GAPDH , F ： 5； - CGTGCGTGACATTAAGGAG - 3；
R ：5； - GGAAGGAAGGCTGGAAGAG - 3；。GAPDH
作为内参，通过2-也方法检测基因相对表达水平。
1.2.6蛋白质免疫印迹分析 用RIFA 法从大鼠
心肌组织细胞中提取总蛋白，以线粒体蛋白提取试
剂盒提取线粒体蛋白，于4 C 14 000g 离心5 mix 。 BCA 测定法测量蛋白质含量，用3% - 12% SDS-
PAGE 分离蛋白质样品（50 py ），并转移到硝酸纤维
素膜上。然后将膜用TBST 中的5% BSA 封闭，并与
p 2AR （ 1：1 000）、Bcx （ 1： 000）、C/p/e-3（ 1 ： 1 000）、
Cx43（ 1 ： 1 000）、PKC-o （1： 540）和电压依赖性阴离子
通道蛋白1 （VDAC 1、兔抗大鼠多克隆抗体（1 ： 1 000）
第一抗体在4 C 下孵育过夜，然后将膜用TBST 洗
涤，并与HRP 偶联的山羊抗兔OG （ 1 : 5 000）或
HRP 偶联的山羊抗小鼠抗体在37 C 孵育1 ho 使
用ECL 蛋白质印迹检测试剂观察蛋白质条带，并计 算灰度值。
63 数据处理与统计分析
使用SPSS21. 0分析数据，所有数据表示为平均
值土标准差，两组数据采用/检验比较差异性，多组
数据采用单因素方差分析差异性。PV0.05表示差
异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 模型组大鼠心电图变化
模型组大鼠结扎后,ST 段显著上移,T 波增高，
步兵团
表现出心律失常现象，而再灌注之后，ST 段和T 波
与结扎时相比显著下降，但与结扎前相比仍有增加 （PV0.01，见表1），表明心肌缺血再灌注大鼠模型
构建成功。
表1模型组大鼠心肌缺血再灌注前后心电图的变化
( mV )
Table 1
Changes of electrocardiogram before and after myocardiae isctemio-referOision io model group (mV )
时间ST 段
T 波缺血前
0. 059 7 ±0. 042 10. 132 4 ±0. 065 7缺血后
0. 254 8 ±0. 092 3"
0. 374 5 ±0. 102 3"
再灌注
0. 109 3 ±0. 075 4"##0. 146 4 ±0. 075 2#与缺血前比较,**P<6.01；与缺血后比较,8p <0. 01
2.2 p 2肾上腺素能受体激动剂对大鼠心肌组织的 病理改变影响
HE 染色结果表明，假手术组大鼠心肌细胞形
态无变化，皮质神经元显示正常结构；模型组大鼠核 固缩，核周体显著增加，出现众多的空泡空间；与模
型组相比，实验组心肌细胞坏死明显减少，心肌纤维
可见轻度水肿，可见核的残留神经元的结构得到改 善（见图1）o
2. 3 大鼠心肌细胞线粒体超微结构观察
透射电镜下可见，假手术组大鼠神经元和细胞
器的外观形态正常，线粒体形态和大小正常；模型组
大鼠线粒体肿胀、变形严重，膜结构模糊；实验组大
外研社小学英语mp3
pompeii鼠膜结构模糊，线粒体略有肿胀，神经元损伤较轻
（见图2）o 该结果提示p2肾上腺素能受体激动剂
cleoduteroi 可以有效减轻大鼠心肌缺血再灌注造成
的线粒体超微结构的损伤。
2. 0 大鼠心肌组织中p 2AR 的表达
与模型组相比，实验组大鼠心肌组织中p2AR
的mRNA 和蛋白相对表达量显著上调（P<0. 05，见
图3） o 表明p2肾上腺素能受体激动剂cleoduteroi
能够激活p2AR 的表达。
假手术组 模型釦
实验迅
图1大鼠心肌组织HE 染色结果(x200)
家庭教育心得
Figure 1 HE staining results of rat myocamift tissue
(x220)
-1338 -J Shanxi Med Unia , Dec 2022, Vol 31 No 12
假手术组实验组
图2肾上腺素能受体激动剂cleudutev-对大鼠心肌缺血再灌注后线粒体超微结构的影响(x2 000)
Figure 2 EEect of cleudutev- on ultmstrnctua of mimcOond/c aCer myoccrhial iscOemic-mpe/usion inju/ in mts (x2 000)
A.各组大鼠中02AR mRNA 的相对表达水平B •各组大鼠中02AR 蛋白的相对表达水平
与假手术组比较,P < 0. 03 ；与模型组比较,P < 0・03
图3肾上腺素能受体激动剂cPndutemt 对大鼠心肌组织中02AR 的mRNA 和蛋白表达的影响
Figure 3 EEect of cleudutev- on 02AR mRNA and protein expression in myocorhiat tissues in eacO gmsp
假手术组模型组实验组
2. 5 大鼠血清中心肌酶检测分析与假手术组比较，模型组和实验组大鼠血清中 CK-MB 和LDH 含量显著升高(P<0. 03)；与模型组
比较，实验组大鼠血清中CK-MB 和LDH 含量显著
降低(PV0.05，见图4)o 提示06肾上腺素能受体
激动剂cPnbuteml 能显著降低大鼠心肌缺血再灌注 导致的急性心肌损伤。
与假手术组比较,P <0. 03；与模型组比较,#P<0. 03
图4肾上腺素能受体激动剂cleudutev-对大鼠心肌缺血再灌注后血清中心肌酶水平的影响
Figure 4 EEect of cleudutev- on rum myocorhiat enzyme level aCer myocorhiat iscOemic-mpe/usion in mW
2. 6 大鼠心肌细胞凋亡因子与线粒体蛋白表达分析 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bap 和Caspaso-C 蛋白表达水平显著上调(P<0. 23)；与
模型组比较，实验组大鼠心肌组织中Bap 和
Caspaso-C 蛋白表达水平显著下调(P < 0. 23 ，见图
0)o 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Cx43
和PKC-a 蛋白表达水平明显下调(P<0. 03)；与模 型组比较，实验组大鼠心肌组织中Cx43和PKC-a
蛋白表达水平显著上调(P<0. 23，见图0)o 提示
06肾上腺素能受体激动剂cPnbuteml 在大鼠心肌
extract缺血再灌注过程中可能通过上调Cx43和PKC-a 蛋
白表达而抑制线粒体细胞的凋亡
。
山西医科大学学报,2220年2月，第31卷第2期
-1339 -o
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.50.50.5O 2 2 110 0
假手术组模型组实验组
与假手术组比较,*P<7. 73；与模型组比较,#P <7. 73
图3肾上腺素能受体激动剂clenbutemt 对大鼠心肌细胞凋亡因子与线粒体蛋白表达的影响
Figure 3 EEect of clenbuterol ox tUe expression levels of rot corkiomyocyte apoptosis factors anh mitocUoxhriol proteins
8讨论
心肌缺血对心肌产生一定损伤，目前常见的治
疗方式为再灌注，但是再灌注过程可进一步加重心
肌的损伤，从而引起一系列病症，因此通过不同 治疗缓解损伤是目前研究的重点。而相关研究主要 是通过建立大鼠缺血再灌损伤模型实现，主要是由
于具有大鼠冠状动脉分支少、用于制备缺血再灌损 伤模型复制性好、模型成功率高等优势口2。本实
masturbation验
构建大鼠心肌缺血再灌注模型，发现02肾上腺素
能受体激动剂clenbutemt 可明显降低心肌缺血损伤
症状，且发现这种治疗作用上调了 02AR 基因表达,
缓解了线粒体损伤以及调控线粒体内蛋白Cx43、 PKC-s 以及细胞凋亡因子Caspa-3和Bax 的表达，
因此推测clenbutemt 治疗作用可能主要是通过抑制 线粒体细胞凋亡实现。
LDH 和CK-MB 是细胞损伤程度的标志，其
存在于心肌细胞内，只有当细胞膜受损，通透性发生 改变时才会出现外漏，所以通常检测和来评价细胞
表达能力差怎么办
损伤的程度［/。本实验结果表明，cleddmml 可降in ca
低心肌缺血再灌后造成的心肌损伤，即与模型组相 比,cU7Uumml 治疗可显著降低大鼠血清中LDH 和
CK-MB 的释放量，这说明henbuteml 对缺血再灌注
后的心肌细胞有保护作用，这与前人的报道一 致⑻。
心肌细胞在缺血缺氧条件下会发生线粒体功能
障碍［⑷、线粒体内的细胞色素C 释放进入胞质并启 动线粒体凋亡途径口3］。本研究通过透射电镜观察
各组中线粒体情况，结果发现,clenbutemt 能缓解线
粒体损伤，这与前人结果一致。Bax 是线粒体膜上 调节细胞色素C 通透性的分子［4 ］，其主要通过增加 细胞色素C 的释放并起到促凋亡作用［7 ］，进入胞质
的细胞色素C 通过级联反应来激活CaspaA 并引 起细胞凋亡［3 ］，本实验中，模型组中Bap 和Caspa- 3的表达水平均明显高于假手术组，提示心肌缺血
再灌注能够导致心肌细胞的线粒体凋亡途径发生激
活。而实验组大鼠心肌组织中Bap 和CaspaA 的 表达水平均明显低于模型组。另外，研究表明，线
粒 体Cx43及PKC-s 在调节心肌细胞内ATP 敏感性钾 通道及MimKATP 通道中起着重要作用［2 ］，其中
MimKATP 通道在干预心肌缺血再灌注损伤中起关
键作用［22 ］，因此，本实验检测了线粒体中Cx43及
PKC-s 蛋白的表达量，结果发现,clenbutemt 显著上
调了线粒体中Cx43及PKC-s 蛋白的表达量，表明 02肾上腺素能受体激动剂clenbutemt 能够抑制心
肌缺血再灌注引起的心肌细胞线粒体途径凋亡。
综上所述，02肾上腺素能受体激动剂hen- butemi 能够减轻心肌缺血再灌注诱导的心肌细胞损
害、抑制再灌注诱导的心肌细胞线粒体途径凋亡，且
这种抑制主要是通过上调线粒体中Cx43及PKC-s 蛋白以及抑制细胞凋亡因子Bap 和Caspa-3
的表
