【基金项目】浙江省省部共建重点项目（ＷＫＪ ＺＪ １７２９
）【收稿日期】２０１６ ０９ ０９【修回日期】２０１７ ０６ ２７
△【通讯作者】Ｔｅｌ：＋８６ １３５６７２００８０８；Ｅ ｍａｉｌ：ｇｈａｎｇｙｕａｎ＠ｏｕｔｌｏｏｋ．
ｃｏｍ
瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸诱导的小鼠血管平滑肌细胞
去分化和内质网应激的影响及其机制研究
周昌钻１，２
，潘孙雷１，林
辉１，孟立平１，季政１，池菊芳１，郭航远１
△（１．绍兴市人民医院心内科，浙江绍兴３１２０００；２．温州中西医结合医院，浙江温州３２５０００
）【摘要】目的：探讨瑞舒伐他汀（Ｒｓｖ）对同型半胱氨酸（Ｈｃｙ）诱导的小鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）去分化及内质网应激（ＥＲＳ）的影响。方法：Ｈｃｙ和不同浓度瑞舒伐他汀（０．１，１．０，１０μｍｏｌ／Ｌ）干预ＶＳＭＣｓ，４８ｈ后检测细胞骨架及表型蛋白（α ＳＭＡ）、钙调节蛋白（ｃａｌｐｏｎｉｎ）和骨桥蛋白（ＯＰＮ）变化，并检测ＥＲＳ相关ｍＲＮＡ（Ｈｅｒｐｕｄ１，ＸＢＰ１ｓ和ＧＲＰ７８）在不同时间点的水平；再在Ｈｃｙ及Ｒｓｖ干预基础上给予ＥＲＳ抑制剂４ 苯基丁酸（４ ＰＢＡ）或诱导剂衣霉素来调控细胞ＥＲＳ水平，检测细胞增殖、迁移和表型蛋白表达，明确ＥＲＳ在Ｒｓｖ表型保护中的作用；在Ｈｃｙ及Ｒｓｖ干预基础上给予雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ） Ｐ７０Ｓ６激酶（Ｐ７０Ｓ６Ｋ）信号抑制剂雷帕霉素或激活剂磷脂酸，检测ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ磷酸化和ＥＲＳ水平，明确ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６通路在Ｒｓｖ调控ＥＲＳ中的作用。结果：与Ｈｃｙ组相比，Ｈｃｙ＋中Ｒｓｖ组（１μｍｏｌ／Ｌ）和Ｈｃｙ＋高Ｒｓｖ组（１０μｍｏｌ／Ｌ）细胞骨架极性明显增强，α ＳＭＡ、ｃａｌｐｏｎｉｎ表达升高，而ＯＰＮ及ＥＲＳ相关ｍＲＮＡ水平显著降低（Ｐ＜０．０１）；与Ｈｃｙ组比较，Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组和Ｈｃｙ＋４ ＰＢＡ组增殖、迁移水平降低（Ｐ＜０．０１），收缩蛋白表达增强，但衣霉素干预则逆转了Ｒｓｖ的上述作用；与Ｈｃｙ组相比，Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组和Ｈｃｙ＋雷帕霉素组的ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ磷酸化及ＥＲＳ水平降低（Ｐ＜０．０１），但磷脂酸干预抑制了Ｒｓｖ对ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ通路和ＥＲＳ的影响。结论：瑞舒伐他汀可能通过ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ通路抑制ＥＲＳ水平，抑制Ｈｃｙ诱导的小鼠ＶＳＭＣｓ
去分化改变。【关键词】表型去分化；血管平滑肌；瑞舒伐他汀；内质网应激；同型半胱氨酸；小鼠【中图分类号】Ｒ３６３
【文献标识码】Ａ
【文章编号】１０００ ６８３４（２０１８）０１ ０４３ ０６
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５４８９．２０１８．０１２
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｉｎｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｍｏｕｓｅｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈ
leanonmeｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓａｎｄ
ｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ
admirerＺＨＯＵＣｈａｎｇ ｚｕａｎ１，２，ＰＡＮＳｕｎ ｌｅｉ１，ＬＩＮＨｕｉ１，ＭＥＮＧＬｉ ｐｉｎｇ１，ＪＩＺｈｅｎｇ１，ＣＨＩＪｕ ｆａｎｇ１，ＧＵＯＨａｎｇ ｙｕａｎ
１△（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｏｘｉｎｇＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｏｘｉｎｇ３１２０００；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ
，ＷｅｎｚｈｏｕＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ３２５００，Ｃｈｉｎａ
）【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｏｎｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ（Ｈｃｙ）ｉｎｄｕｃｅｄｍｏｕｓｅｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（ＶＳＭ
Ｃｓ）ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ（ＥＲＳ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＶＳＭＣｓｗｅｒｅｃｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＨｃｙａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｒｏ
ｓｕｖａｓｔａｔｉｎ（０．１，１．０ａｎｄ１０μ
ｍｏｌ／Ｌ）．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ＶＳＭＣｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅｍａｒｋｅｒｓ（ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ α，ｃａｌｐｏｎｉｎａｎｄｏｓｔｅｏｐ
ｏｎ ｔｉｎ）ａｎｄＥＲＳｍａｒｋｅｒｍＲＮＡｓ（Ｈｅｒｐｕｄ１，ＸＢＰ１ｓａｎｄＧＲＰ７８）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｔｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｉｍｅ．Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
４ ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ（４ ＰＢＡ）ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＥＲＳｉｎＶＳＭＣｓａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．
Ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）Ｐ７０Ｓ６ｋｉｎａｓｅ（Ｐ７０Ｓ６Ｋ）ｓｉｇｎａｌｉｎｇａｇｏｎｉｓｔｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｒａｐａｍｙｃｉｎｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎ
ＲｓｖｔｒｅａｔｅｄＶＳＭＣｓ．ＡｎｄｔｈｅｎｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄＥＲＳａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍＲＮＡｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＨｃｙｇｒｏｕｐ，Ｈｃｙ＋Ｒｓｖｇｒｏｕｐ（１．０ａｎｄ１０μ
ｍｏｌ／Ｌ）ｓｈｏｗｅｄｅｎｈａｎｃｅｄα ＳＭＡａｎｄｃａｌｐｏｎｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ（Ｐ＜０．０１），ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄＥＲＳｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｄｐｏｌａｒｉｔｙｏｆｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＨｃｙｇｒｏｕｐ
，Ｈｃｙ＋ＲｓｖｇｒｏｕｐａｎｄＨｃｙ＋４ ＰＢＡｇｒｏｕｐｓｈｏｗｅｄｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉ ｇｒａｔｉｏｎａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｐ＜０．０１）；ｗｈｉｌｅｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｃｏｕｌｄｒｅｖｅｒｓｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＲｓｖｏｎＨｃｙｔｒｅａｔｅｄｃｅｌｌｓ．Ｆｕｒ
ｔｈｅｒｍｏｒｅ，ａｌｌｅｖｉａｔｅｄｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６ＫｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄＥＲＳ（Ｐ＜０．０１）ｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎＨｃｙ＋ＲｓｖｇｒｏｕｐａｎｄＨｃｙ＋ｒａｐａｍｙｃｉｎｇｒｏｕｐ
，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＨｃｙｇｒｏｕｐ；ｗｈｉｌｅｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＲｓｖｏｎｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｉｎｇａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＥＲＳｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓ（Ｐ＜
０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＲｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔＨｃｙ
ｉｎｄｕｃｅｄＶＳＭＣｓｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｖｉａｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇＥＲＳ，ｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔｂｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋｓｉｇｎａｌｉｎｇ．【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ；ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ；ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ；ｈｏｍｏｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ；ｍｏｕｓｅ
高同型半胱氨酸（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｈｃｙ
）血症是动脉粥样硬化性冠心病的独立危险因素。但是，降Ｈｃｙ治疗能否使患者在心脑血管疾病中获益在临床研究
３
４中国应用生理学杂志，２０１８，３４（１）
中仍未达成共识［１］。因此，Ｈｃｙ在心血管疾病中可能具有更复杂的调控机制。研究发现，Ｈｃｙ可诱导血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ，ＶＳＭＣｓ）发生表型去分化［２］。
血管平滑肌表型的去分化与心脑血管病密切相关。平滑肌与其他肌细胞相比，具有很强的表型重塑性。成熟分化的ＶＳＭＣｓ呈长梭形，稳定表达包括表型蛋白（ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ α，α ＳＭＡ），钙调节蛋白ｃａｌｐｏｎｉｎ和ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ在内的收缩相关蛋白，细胞增殖与迁移能力极低，称为收缩型ＶＳＭＣｓ。但收缩型ＶＳＭＣｓ在异常刺激下可发生表型去分化，一方面细胞收缩蛋白表达减少，分泌蛋白如骨桥蛋白（ｏｓｔｅｏ ｐｏｎｔｉｎ，ＯＰＮ）表达增强，细胞骨架极性分布减弱；另一方面细胞增殖、迁移能力增强［３］。ＶＳＭＣｓ收缩表型的丧失是冠心病、肺动脉高压、主动脉瘤等心血管疾病的重要病理变化［３，４］。
现研究发现，内质网应激（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ，ＥＲＳ）可能在心血管疾病发病中发挥重要作用。ＥＲＳ是细胞内环境受到干扰后，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔大量堆积，进而影响细胞功能的异常状态。高同型半胱氨酸血症、高脂血症、血管机械损伤等危险因素都可引起血管壁细胞ＥＲＳ状态。此外，在巨噬细胞、内皮细胞及脂肪细胞中也都观察到ＥＲＳ发挥着表型调控的作用［４］。但是ＥＲＳ是否参与调控Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ去分化，仍未被人们了解。
临床中血管保护药物，如他汀类药物被发现存在药物作用的多效性［５，６］。但是，这类常用药物多效性是否与血管ＥＲＳ状态相关，仍不十分明确。本研究旨在明确瑞舒伐他汀（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ，Ｒｓｖ）对Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ表型去分化的影响并探讨ＥＲＳ在其中的作用，进一
步揭示ＥＲＳ在他汀类药物的血管保护作用的机制，为血管重构性疾病的治疗提供新的理论依据。
１材料与方法
１．１实验材料
ＳＰＦ级Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，雌雄不限，８周左右，体重２２～２５ｇ（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司）。实验试剂：Ｈｃｙ、血小板源生长因子 ＢＢ（ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ ＢＢ，ＰＤＧＦ ＢＢ）衣霉素、磷脂酸（ｓｉｇｍａ），Ｒｓｙ（ＭｅｄｃｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ），４ 苯基丁酸（杭州昊鑫生物有限公司），Ⅱ型胶原酶（Ｖｅｔｅｃ），荧光染料４８８Ⅰ 鬼笔环肽（Ａｂｎｏｖａ），ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ试剂盒（Ｒｏｃｈｅ），ＤＭＥＭ高糖培养基、胎牛血清、０．２５％胰蛋白酶 ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ），α ＳＭＡ、ＯＰＮ、ｃａｌｐｏｎｉｎ、ＧＡＰＤＨ单克隆抗体（Ａｂｃａｍ），雷帕霉素靶蛋白（ｍａｍ ｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）、ｐｈｏｓｐｈｏ ｍＴＯＲ（Ｓ２４４８）、Ｐ７０Ｓ６激酶（Ｐ７０Ｓ６ｋｉｎａｓｅ，Ｐ７０Ｓ６Ｋ）、ｐｈｏｓ ｐｈｏ Ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）单克隆抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ），辣根过氧化酶标记二抗（Ａｂｂｋｉｎｅ），ＭＴＴ（Ｅｍ ｒｅｓｃｏ），Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室（Ｃｏｒｎｉｎｇ）。
１．２实验方法
书虫mp3１．２．１ＶＳＭＣｓ内质网应激诱导和分组小鼠ＶＳＭ Ｃｓ细胞用ＩＩ型胶原酶消化法获取，传代３～５代后无血清饥饿培养２４ｈ。实验１：ＲＳＶ对Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ去分化和ＥＲＳ状态的影响。细胞分为对照组、Ｈｃｙ组（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＰＤＧＦ ＢＢ组（３０ｎｇ／ｍｌ）、Ｈｃｙ＋低Ｒｓｖ组（０．１μｍｏｌ／Ｌ）、Ｈｃｙ＋中Ｒｓｖ组（１μｍｏｌ／Ｌ）、Ｈｃｙ＋高Ｒｓｖ组（１０μｍｏｌ／Ｌ），每组设３复孔，分别于培养后３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈ时用ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ检测葡萄糖调节蛋白７８（ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ７８，ＧＲＰ７８）、Ｘ盒结合蛋白１（Ｘ ｂｏｘｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１，ＸＢＰ１ｓ），同型半胱氨酸诱导内质网应激泛素结构域１（Ｈｅｒｐｕｄ１），反映ＥＲＳ水平；４８ｈ时检测细胞表型蛋白α ＳＭＡ表达和细胞骨架变化。实验２：ＥＲＳ在Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ去分化中的作用。细胞分为对照组、Ｈｃｙ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）组、Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ（１０μｍｏｌ／Ｌ）组、Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ＋衣霉素（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ，Ｔｍ，１０μｇ／ｍｌ）组，Ｈｃｙ＋４ 苯基丁酸（４ ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ，４ ＰＢＡ，５ｍｍｏｌ／Ｌ）组，每组设３复孔，检测细胞增殖、迁移和表型蛋白表达变化。实验３：ｍＴＯＲ信号通路对细胞ＥＲＳ影响。细胞分为对照组、Ｈｃｙ组、Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组、Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ＋磷脂酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ，ＰＡ，１０μｍｏｌ／Ｌ）组和Ｈｃｙ＋雷帕霉素（ｒａｐａｍｙｃｉｎ，Ｒａｐａ，５０ｎｍｏｌ／Ｌ）组，每组设３复孔，干预３０ｍｉｎ后检测ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ信号磷酸化程度及ＥＲＳ水平。
１．２．２ＲＮＡ提取检测ＥＲＳ指标经典Ｔｒｉｚｏｌ 异丙醇沉淀法提取总ＲＮＡ，测定浓度纯度。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ检测ＧＲＰ７８、ＸＢＰ１ｓ和Ｈｅｒｐｕｄ１的ｍＲＮＡ表达水平。总ＲＮＡ按逆转录试剂盒及ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ试剂盒说明书进行操作，引物序列如表１所示。记录Ｃｔ值后按２ △△Ｃｔ法进行相对定量。
Ｔａｂ．１Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｆｏｒｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ
ＧｅｎｅＦｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ
ＧＲＰ７８ＴＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＴＡＡＣＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＧＧＣＧＴＣＡＴＨｅｒｐｕｄ１
ＴＣＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡ
ＧＡＣＡ
ＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＧ
ＴＣＣＡ
ＸＢＰ１ｓ
ＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴ
ＧＧＧＣ
ＧＧＧＴＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡ
ＡＴＧＣblou
１８Ｓ
ＣＴＧＧＡＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡ
ＧＧＡＡ
ＧＡＡＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＡＧＣ
ＧＧＣＧ
４
４ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１８，３４（１）
１．２．３提取蛋白检测表型蛋白及信号通路改变
六孔板每孔加入２００μｌ预冷ＲＩＰＡ裂解液冰上裂解细胞３０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ取上清，加入上清体积１／４体积的５×ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，混匀后沸水浴５ｍｉｎ变性蛋白，置于 ８０℃环境冻存。配制ＳＤＳＰＡＧＥ胶，每个泳道２０μｇ蛋白样品上样。按实验设计分别检测样品中α ＳＭＡ、ＯＰＮ、ｃａｌｐｏｎｉｎ、ｍＴＯＲ、ｐ ｍＴＯＲ、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ Ｐ７０Ｓ６Ｋ以及内参ＧＡＰＤＨ表达情况。
１．２．４细胞增殖实验分别收集３～５代ＶＳＭＣｓ，按上述分组以每孔２×１０３个细胞接种于９６孔培养板中，每组设３个复孔。待细胞贴壁后，无血清培养基饥饿２４ｈ后更换为每孔１００μｌ条件培养基，分别培养１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ后，按每孔加入２０μｌＭＴＴ液（５ｍｇ／ｍｌ）。避光孵育４ｈ，小心弃上清，每孔加入２００μｌＤＭＳＯ，震荡溶解结晶后，测量各孔５７９ｎｍ波长下吸光值，独立使用重复３次。
１．２．５细胞迁移实验取３～５代ＶＳＭＣｓ，培养基中加入羟基脲（１．８ｍｍｏｌ／Ｌ）抑制增殖，１２ｈ后重悬浮ＶＳＭＣｓ（３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室上腔室（０．８μｍ）中加入２００μｌ细胞悬液，下室加入完全培养基。２ｈ后待细胞贴壁，上室更换为无血清的条件培养基。２４ｈ后多聚甲醛固定，棉签拭去上层细胞，０．１％结晶紫溶液染色，于倒置显微镜下随机取５个视野统计各视野细胞数目。
１．２．６细胞骨架鬼笔环肽染色取无菌盖玻片置于６孔板中，按每孔１０００个细胞接种细胞，待细胞贴壁后无血清饥饿２４ｈ，无血清条件培养基干预４８ｈ后，多聚甲醛固定，鬼笔环肽染液避光孵育２ｈ，ＰＢＳ洗涤３次后，在荧光显微镜４９０ｎｍ激发波长观察细胞微丝骨架结构和细胞形态。
１．３统计学分析
实验数据以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，两组数据间比较采用ｔ检验，多组数据间比较用单因素方差分析，多组数据间两两比较用Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ检验，并用ＳＰＳＳ１９．０统计软件分析结果。
２结果
２．１瑞舒伐他汀对ＶＳＭＣｓ微丝骨架分布影响对照组细胞微丝骨架极性明显，细胞呈长条形或长梭形；Ｈｃｙ组及ＰＤＧＦ ＢＢ组细胞呈短梭形或椭圆形，微丝分布紊乱；添加瑞舒伐他汀可增强细胞微丝骨架分布的极性，恢复细胞长梭形外形，该作用随他汀浓度增加而增强（图１）
。Ｆｉｇ．１Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｏｎｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｎｇｅｓｉｎｆｏｒｍｏｆａｃｔｉｎｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（×４００）２．２瑞舒伐他汀对Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ表型去分化的影响
Ｗｅｓｔｅｒｎ实验显示，Ｈｃｙ组较对照组，α ＳＭＡ、ｃａｌｐｏｎｉｎ表达下调，ＯＰＮ表达
上调（Ｐ＜０．０１）；添加瑞舒伐他汀可增强Ｈｃｙ组α ＳＭＡ、ｃａｌｐｏｎｉｎ表达，抑制ＯＰＮ表达，且作用随他汀浓度的提高而增强（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，图２）。结果显示ＲＳＶ干预可抑制Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ去分化，
维持细胞收缩表型。
美国大选2020在几月出结果Ｆｉｇ．２ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＨｃｙａｎｄｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｏｎＶＳＭＣｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅｍａｒｋ ｅｒｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｎ＝３）
ＡａｎｄＢ：Ｒｓｖｐｒｏｍｏｔｅｄｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｎ ｈｉｂｉｔｅｄＯＰＮｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｄｏｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ；Ｈｃｙ：Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ；ＰＤＧＦ ＢＢ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ ＢＢ；
英语一国家线Ｒｓｖ：Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ；α ＳＭＡ：Ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ α；ＯＰＮ：Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓＨｃｙｇｒｏｕｐ
２．３瑞舒伐他汀对Ｈｃｙ诱导的ＥＲＳ的影响
药物干预３０ｍｉｎ时，与对照组相比Ｈｃｙ组ＧＲＰ７８、Ｈｅｒｐｕｄ１和ＸＢＰ１ｓｍＲＮＡ水平升高且差异有统计学意义；１０μｍｏｌ／ＬＲｓｖ＋Ｈｃｙ组较Ｈｃｙ组ＧＲＰ７８和ＸＢＰ１ｓｍＲＮＡ水平降低（１．４００±０．２３６ｖｓ２．５６２±０．３４０，１．０４５±０．１
３７ｖｓ５．９２３±０．９３９，Ｐ＜０．０５），Ｈｅｒｐｕｄ１ｍＲＮＡ水平降低（１．３８５±０．１０１ｖｓ５．９２３±０．７５５，Ｐ＜０．０１），且Ｒｓｖ对ＥＲＳ的抑制作用随浓度
５
４
中国应用生理学杂志，２０１８，３４（１）
升高和时间延长而增强（图３）。
初中英语作文带翻译Ｆｉｇ．３ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｏｎＨｃｙｍｅｄｉａｔｅｄ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）ＧＲＰ７８：Ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ７８；ＨＣｙ：Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ；
ＥＲＳ：Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ
杏子的英文Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓＮＣｇｒｏｕｐ
２．４ＥＲＳ对ＶＳＭＣｓ表型去分化的影响
提醒英语
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验中，Ｈｃｙ组较对照组穿透纤维膜的迁移细胞数量明显增加；Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组和Ｈｃｙ＋４ ＰＢＡ组较Ｈｃｙ组，细胞迁移数量减少（分别为５６．７±９．４ｖｓ７２．４±１６．８，４８．３±６．５ｖｓ７２．４±１６．８）；Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ＋Ｔｍ组细胞迁移数高于Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组（９６．１±１８．３ｖｓ５６．７±９．４，图４Ａ）。ＭＴＴ实验发现Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组和Ｈｃｙ＋４ ＰＢＡ组细胞活性低于Ｈｃｙ组，Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ＋Ｔｍ组细胞活性高于Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组（图４Ｂ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ发现４ ＰＢＡ可抑制Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ表型蛋白去分化改变，而Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ＋Ｔｍ组较Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组表型蛋白去分化程度高（图４Ｃ、Ｄ）。
２．５ｍＴＯＲ信号通路对ＥＲＳ的调节作用
Ｈｃｙ组较对照组ｍＴＯＲ、Ｐ７０Ｓ６Ｋ磷酸水平明显增强；Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组和Ｈｃｙ＋Ｒａｐａ组ｍＴＯＲ和Ｐ７０Ｓ６Ｋ磷酸化较Ｈｃｙ组受到抑制（图５Ａ、Ｂ），且ＥＲＳ水平减轻（图５Ｃ）；Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ＋ＰＡ组较Ｈｃｙ＋Ｒｓｖ组ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ磷酸化信号增强，ＥＲＳ水平升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。
３讨论alacrity
ＶＳＭＣｓ细胞表型的去分化发生在动脉粥样硬化、高血压、主动脉瘤等心血管疾病的病理生理过程
中。ＶＳＭＣｓ的去分化并没有特异性的指标，因此对ＶＳＭＣｓ去分化的鉴定常需从细胞形态观察、表型蛋白表达以及细胞增殖、迁移能力等多个方面的共同确认。尽管，ＶＳＭＣｓ可向多种细胞表型转化，比如巨噬细胞样表型、软骨细胞样表型、泡沫细胞表型等，但ＶＭＳＣｓ的去分化是其中的共同过程［７，８］
。
Ｆｉｇ．４ＲｏｌｅｏｆＥＲＳｉｎＶＳＭＣｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｗｉｔｃｈ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）Ａ：ＨｃｙａｎｄＴｍｐｒｏｍｏｔｅｄＶＳＭＣｓｍｉｇｒａｔｉｏｎｗｈｉｃｈｗａｓｓｕｐ ｐｒｅｓｓｅｄｂｙＲｓｖａｎｄ４ ＰＢＡ；Ｂ：ＭＴＴａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＲｓｖａｎｄ４ ＰＢＡｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄＨｃｙｉｎｄｕｃｅｄＶＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｗｈｉｌｅＴｍｅｎｈａｎｃｅｄｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｃ：Ｒｓｖａｎｄ４ ＰＢＡｐｒｅｓｅｒｖｅｄＶＳＭＣｓｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｄｏｓｅｄｅ ｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｔｅｒｎ
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓＮＣｇｒｏｕｐ
Ｆｉｇ．５ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６ＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＥＲＳｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ（ｎ＝３）Ａ，Ｂ：ＲｓｖｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄＨｃｙｍｅｄｉａｔｅｄｍＴＯＲ，Ｐ７０Ｓ６Ｋｐｈｏｓ ｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ；Ｃ：ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋｓｉｇ ｎａｌｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｇｕｌａｔｅｄＶＳＭＣｓＥＲＳｌｅｖｅｌｓ
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓＮＣｇｒｏｕｐ
高Ｈｃｙ血症是动脉粥样硬化的独立危险因素，可诱导血管壁中的内皮细胞和平滑肌细胞发生炎症反应和氧化应激，进而引起细胞凋亡或死亡。现研究发现，Ｈｃｙ在引起血管壁细胞炎症反应，促进凋亡
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４ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１８，３４（１）
的同时，也会诱导细胞ＥＲＳ的发生和ＶＳＭＣｓ收缩表型的丧失［２，９］。但ＥＲＳ在其诱导ＶＳＭＣｓ去分化中的作用，还未被人们完全了解。Ｈｃｙ介导ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ信号激活，可能导致内质网腔中“流入”的新生多肽急剧增加，加重了内质网的多肽折叠功能负荷，进一步造成内质网腔内环境紊乱。此外，高浓度Ｈｃｙ还会引起基因组广泛的甲基化，这也可能是导致细胞蛋白代谢紊乱的重要机制［１０］。
ＥＲＳ在哺乳动物的胚胎发育和生长中扮演着重要的角色。通过人工药物干预减轻胚胎的ＥＲＳ水平，可导致胚胎的发育成熟速度加快；反之，在哺乳动物孕期给予ＥＲＳ诱导剂刺激，则会引起胚胎发育迟滞，早产甚至流产［１１，１２］。此外，糖尿病相关研究中观察到，ＥＲＳ下游信号的紊乱可导致胰岛β细胞的胰岛素释放功能受损［１３］。以上证据都提示ＥＲＳ及其下游信号在组织发育及功能维持中的关键作用。
研究学者在动脉粥样硬化、高血压、主动脉瘤及心肌病中均观察到血管或心肌的异常ＥＲＳ状态［１４］。ＥＲＳ除了能引起细胞凋亡，导致组织中细胞丧失外，细胞功能表型的改变也可能是其在心血管疾病中的另一项重要致病机制。研究者通过ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ等ＥＲＳ诱导药物干预实验动物后，发现血管的ＥＲＳ可能引起血管顺应性降低，整体血压升高以及内皮细胞功能紊乱等血管异常状态［１５］。Ｃａｒｌｉｓｌｅ等在动物实验中观察到，４ ＰＢＡ干预可显著减轻血管的病理性肥厚［１６］。本研究进一步发现，Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ表型的去分化作用以及瑞舒伐他汀的表型保护作用可能与细胞ＥＲＳ相关。瑞舒伐他汀浓度依赖性的抑制Ｈｃｙ诱导的ＥＲＳ。进而用ＥＲＳ诱导剂ｔｕｎｉ ｃａｍｙｃｉｎ增强ＥＲＳ水平后，Ｒｓｖ的表型保护作用被显著抑制；反之，同时用Ｈｃｙ和４ ＰＢＡ干预细胞，ＶＳＭ Ｃｓ仍能维持较强的收缩表型，提示ＶＳＭＣｓ收缩表型受到ＥＲＳ水平调控。
ＥＲＳ对ＶＳＭＣｓ细胞表型的调控可能与ＥＲＳ下游的激活信号相关。研究发现，ＸＢＰ１ｓ可与细胞表型的重要调控因子Ｋｒｕｐｐｅｌｌｉｋｅｆａｃｔｏｒ４和间质转化因子Ｓｎａｉｌ１的基因启动子结合，影响相关因子的表达［１７，１８］。ＳｈｉｎｏｚａｋｉＳ团队发现，敲除ＥＲＳ激活的下游蛋白Ｈｅｒｐｕｄ１能显著减轻高脂小鼠动脉斑块的面积，增强斑块稳定性［１９］。以上研究都提示ＥＲＳ下游信号在血管壁细胞表型调控中的潜在作用机制。本研究发现，常用的血管保护药物 他汀类药物，有一部分非降脂依赖的保护作用可能是通过调控血管壁细胞的ＥＲＳ状态，维持ＶＳＭＣｓ收缩表型实现的。
本研究提示，瑞舒伐他汀可能通过抑制ｍＴＯＲ Ｐ７０Ｓ６Ｋ信号通路磷酸化，减轻细胞ＥＲＳ状态，进而抑制Ｈｃｙ诱导的ＶＳＭＣｓ表型去分化。通过抑制血管组织的ＥＲＳ状态或阻断ＥＲＳ下游的特异性信号通路，保护细胞功能表型，可能是对动脉粥样硬化、高Ｈｃｙ型高血压等发生细胞表型转化的血管重构疾病的潜在治疗策略。
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