人源神经降压素受体-1稳转细胞系的建立及其应用
张果1, 孙涛1, 刘慧娟2, 牛国君2, 徐峰1, 2*
(1. 南开大学药物化学生物学国家重点实验室, 天津 300071; 2. 天津国际生物医药联合研究院, 天津 300457)
摘要: 神经降压素受体-1 (neurotensin receptor-1, NTR1) 是G蛋白偶联受体家族的成员, 调节细胞内钙离子
的水平。NTR1与多种疾病的发生发展密切相关。为寻找与NTR1相关的拮抗剂, 建立了稳定表达人源NTR1蛋
wol白的中国仓鼠卵巢细胞系CHO/NTR1。将重组质粒利用脂质体转染的方法转入CHO细胞, 加入G418抗生素进
行筛选, 采用Western blotting和钙离子浓度检测来评判CHO/NTR1细胞系是否构建成功。通过钙离子浓度检
测, 可以得到NTR1的天然配体神经降压素 (neurotensin, NT) 的EC50值和NTR1的已知拮抗剂SR48692的IC50
值。结果提示, 人源CHO/NTR1稳转细胞系可以用来研究NTR1的生物学特征和进一步筛选NTR1的拮抗剂与
激动剂。
关键词: CHO/NTR1; 钙离子浓度检测; 神经降压素受体
中图分类号: R965.1 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2014) 09-1273-06
Establishment and application of human CHO/NTR1 system ZHANG Guo1, SUN Tao1, LIU Hui-juan2, NIU Guo-jun2, XU Feng1, 2*
(1. State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Nankai University, Tianjin 300071, China;
2. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine, Tianjin 300457, China)
Abstract: Neurotensin receptor-1 (NTR1), which can stimulate the intracellular cascade signal pathway, belongs to the large superfamily of G-protein coupled receptors. NTR1 is related to the occurrence and development of veral kinds of dias. In order to screen the inhibitors for the cancers associated with NTR1 protein, we established a CHO (Chine hamster ovary) cell line in w
hich human neurotensin receptor-1 was highly expresd. The method is to construct the recombinant plasmid which was lyd with the hNTR1 gene
and transfect it into CHO cells. After lected with G418, the cell line was evaluated by Western blotting analysis and calcium flux assays.Through the calcium flux assays on FlexStation 3,we got the EC50 value of neurotensin peptide which is the natural NTR1 agonist, and the IC50 value of SR48692 which is the known NTR1 antagonist. The established human CHO/NTR1 cell line can be ud to study the profile of NTR1 biological activity and further screen of NTR1 antagonists and agonists.
Key words: CHO/NTR1; calcium flux assays; neurotensin receptor
G蛋白偶联受体 (G-protein coupled receptors, GPCR) 是一类与G蛋白相互作用并跨膜传递信号的受体家族, 在细胞信号转导中具有重要作用。GPCR
收稿日期: 2014-05-04; 修回日期: 2014-06-02.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (21302102); 天津市科技计划课题基金资助项目 (12ZCZDSY14500).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-22-65378196, E-mail: xufeng@nankai.edu 广泛参与生命活动的各种生理过程, 与一些重要疾病的发生发展密切相关[1], 目前市场上的很多药物都是以GPCR作为治疗靶点的。
神经降压素 (neurotensin, NT) 是一种由13个氨基酸残基组成的内源性多肽[2], NT通过与神经降压素受体(neurotensin receptor, NTR) 结合发挥作用。目前已经被发现的NTR有3种亚型: NTR1、NTR2
和NTR3。其中NTR1和NTR2属于GPCR A家族的成员, 它们具有7次跨膜的结构域; 而NTR3的结构与NTR1、NTR2不同, 它只有1个跨膜结构域, 属于sortilin家族[3]。
NT主要分布在脑和胃肠道中, 影响中枢和外周神经系统[4]。在中枢神经系统中, NT主要通过影响多巴胺D2受体调节神经元信号的传递[5], 与帕金森病、阿尔兹海默症及精神分裂症的发病机制相关[6], NT 还能调节痛觉神经元产生镇痛效应或使机体失去痛觉[7]。NT在胃肠道和心血管等非神经系统中也有重要作用, 在肥胖患者和高血压患者体内NT的分泌会失去平衡[8]。
研究表明NTR1是NT的高亲和力受体, NT和NTR1结合后激活Gq蛋白所在的信号传递通路, 提高细胞内Ca2+的浓度水平[9]。高浓度的NT被发现在多种恶性肿瘤, 如结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌的生长、增殖、侵袭、转移中起着关键的作用[10−14]。在这些恶性肿瘤细胞中, 神经降压素受体被持续性的激活, 促使肿瘤细胞抵抗凋亡而加速生长。一方面NTR1在某些癌症中的特异性高表达, 可以使其作为早期监测诊断的标志物, 有利于早发现早治疗[15]; 另一方面通过寻找NTR1的拮抗剂, 可以为
治疗NTR1相关的疾病提供新的治疗手段。关于NTR1在各种癌症和精神类疾病中的病理研究和以NTR1为靶标的治疗药物的开发正在引起广泛的关注。
中国仓鼠卵巢细胞(Chine hamster ovary, CHO) 是一种非分泌型细胞, 它本身很少分泌CHO内源蛋白, 可以传代百代以上。CHO细胞作为表达系统具有使重组质粒高效扩增和表达的能力。将人源NTR1基因导入CHO细胞, 获得高表达人源NTR1蛋白的CHO细胞系, 可以有针对性地进行NTR1蛋白功能的研究。NTR1的晶体结构在2012年被成功解析[16], 以NTR1结构为辅助, 设计抑制剂小分子, 并利用稳转人源NTR1的CHO细胞系的模型, 可以体外筛选NTR1的拮抗剂, 寻找可供临床试验的候选化合物和治疗与NTR1相关疾病的药物。
材料与方法
实验材料与试剂 CHO细胞系和表达载体pcDNA3.1(+) (南开大学药物化学生物学国家重点实验室); 人源NTR1-PUC57基因(生工生物工程上海有限公司); NT (Strasbourg Co., Ltd); SR48692 (SIGMA Co., Ltd); FLIPR (Fluorescent Imaging Plate Reader) Calcium 6 Assay Kit (Molecular Devices Co., Ltd); NTR1抗体 (Santa Cruz Biotechnology Co., Ltd); 二
抗 (Bioworld Technology Co., Ltd); DNA Marker (Thermo Scientific Co., Ltd); 限制性内切酶Eco RⅠ
和Hin dⅢ (FastDigest Co., Ltd); 大肠杆菌菌株E.coli
DH5α(北京鼎国昌盛生物科技责任有限公司); DNA
测序(金唯智生物科技有限公司); 质粒抽提试剂
盒和DNA凝胶回收试剂盒 (Bioer Technology Co., Ltd); 无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN Co., Ltd); Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen Co., Ltd); RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-1640
培养基和南美胎牛血清(Hyclone Co.,Ltd);G418(BBI Co., Ltd); RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay) 裂解液(碧云天公司); 化学发光试剂 (Millipore Corporation Co., Ltd)。
细胞培养用含10%南美胎牛血清的RPMI 1640
培养基, 在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下培养CHO细胞, 细胞贴壁生长, 生长状态良好。用含10%
南美胎牛血清和600 μg·mL−1 G418的RPMI 1640培
养基培养CHO/NTR1细胞, 其他培养条件同正常的CHO细胞。
continue是什么意思pcDNA3.1(+)-NTR1重组质粒的构建含有PUC57-NTR1重组质粒(酶切位点为Eco RⅠ和Hin dⅢ)
的DH5α甘油菌, 转化, 扩增, 提取重组质粒PUC57- NTR1, 用限制性内切酶Eco RⅠ和Hin dⅢ分别双酶colorful是什么意思
切PUC57-NTR1和pcDNA3.1(+), DNA凝胶回收试剂
盒回收目的基因NTR1和表达载体pcDNA3.1(+), T4 DNA连接酶以一定的比例连接NTR1和pcDNA3.1(+),
连接产物转化DH5α感受态细菌, 用氨苄青霉素筛选
阳性克隆, 扩增, 提取质粒, 用琼脂糖凝胶电泳鉴定
并DNA测序, 然后用Eco RⅠ和Hin dⅢ双酶切重组
质粒, 进一步鉴定。此重组质粒命名为pcDNA3.1(+)- NTR1。
pcDNA3.1(+)-NTR1重组质粒转染CHO细胞
用无内毒素质粒大提试剂盒对表达载体pcDNA3.1(+)
和重组质粒pcDNA3.1(+)-NTR1进行抽提。转染前一
天采用6孔板铺板, CHO细胞数为1×106/孔。取pcDNA3.1(+)-NTR1 4 μg, Lipofectamine 2000 10 μL,
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent说明书
进行转染: 将pcDNA3.1(+)-NTR1和lipofectamine 2000
分别用无血清的不完全培养基 (250 μL) 稀释, 静置
5 min; 将其混匀, 室温静置20 min; 将原有的完全培
养基换为不含血清的培养基; 取pcDNA3.1(+)-NTR1
和Lipofectamine 2000共500 μL加入到待转染的细
胞中; 5% CO2、37 ℃培养箱培养; 6 h后将不完全培
张果等: 人源神经降压素受体-1稳转细胞系的建立及其应用·1275·
养基换为含血清的完全培养基。以同样的方法, 只转染pcDNA3.1(+)表达载体的CHO细胞作阳性对照。
最佳G418筛选浓度的确定首先制备筛选培养基: 用培养基将G418依次稀释为1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200及100 μg·mL−1; 然后取生长状态良好的CHO细胞, 铺2
4孔板(细胞数为20000/孔), 过夜培养使其贴壁。将培养孔中培养基吸除, PBS洗涤1次, 每孔加入不同浓度的筛选培养基, 每2～3天更换1次筛选培养基。选择出在10～14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度即为最佳G418筛选浓度。
G418加压筛选转染24 h后, PBS洗涤, 加入最佳筛选浓度 (600 μg·mL−1) 的G418培养基进行筛选培养。2～3天更换1次培养基。培养6天左右细胞大量死亡, 血清浓度增加到15%继续培养。培养10天, 细胞大量死亡后将G418浓度减半, 维持筛选压力。筛选约14天后可见有抗性克隆出现, 接着进一步进行细胞的单克隆化。
Western blotting检测G418富集细胞RIPA强裂解液加适量的PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), 分别裂解未转染的CHO细胞(对照组)和转染的CHO 细胞: 盛有细胞的培养皿放置冰上, PBS洗涤3次, 加入适量RIPA强裂解液, 冰上静置30 min, 然后在100 ℃水浴锅中水浴10 min, 进行12% SDS-PAGE凝胶电泳。选用PVDF膜进行转膜, 设定转膜电流为150 mA, 转膜时间为90 min。转膜完毕后, 用含5%脱脂奶粉的TBST (Tris-Buffered Saline and Tween 20) 封闭2 h。一抗以1∶500进行稀释, 4℃缓慢摇动孵育过夜。用pH 7.4的TBST洗膜, 8 min/次, 共5次。二抗以1∶1000的比例稀释, 室温孵育2 h。用TBST (pH 7.4) 洗膜, 8 min/次, 共5次。用化学发光试剂在医用X射线胶片上显影, 曝光。
采用有限稀释法进行单克隆化用具有G418抗性的转染细胞铺96孔板, 使每孔的细胞数分别为1、2、3
个, 各2排, 培养4～5天后, 在显微镜下可见到小的细胞克隆, 第8～9天时, 肉眼可见细胞克隆, 待克隆长满后转到24孔板里进行培养, 依次传代扩大培养。即可得到单克隆化的人源NTR1稳转CHO细胞系。
NT钙离子浓度检测 NT是NTR1的天然配体, NT与NTR1结合后, 通过偶联的Gq蛋白激活的信号传递途径可以引起细胞内钙离子浓度的升高, 因此可以通过检测NT的加入对转染pcDNA3.1(+)-NTR1的CHO细胞的钙离子浓度的影响来判断是否转染成功, 并且可以得到NT的EC50值。通过FlexStation 3台式钙流检测工作站, 采用FLIPR Calcium 6 Assay Kit对NT进行钙离子浓度检测, 检测前一天, 将转染的单克隆化的和未转染的CHO细胞(对照组) 铺96孔板, 细胞数为3×104/孔, 待细胞密度为80%～90%时进行检测; 先把完全培养基换为无血清的不完全培养基, 加入钙离子指示剂, 37℃、5% CO2, 孵育2 h; 加入不同浓度梯度的NT, 每个浓度设置3个重复, 进行钙离子浓度检测。
次第的意思
SR48692钙离子浓度检测由NT钙离子浓度检测可确定最适的引起钙离子浓度升高的NT浓度; SR48692钙离子浓度检测条件同NT: 加入不同浓度梯度的SR48692, 37℃孵育10 min; 再加入100 nmol·L−1 NT; 进行钙离子浓度检测。
结果
1 pcDNA3.1(+) 表达载体和NTR1基因的克隆
pcDNA3.1(+) 表达载体和PUC57-NTR1重组质粒经过Eco RⅠ和Hin dⅢ双酶切之后(图1A), pcDNA3.1(+) 可得到大小约为5.4 kb的DNA片段, PUC57-NTR1重组质粒可得到大小分别约为2.7 kb 和1.3 kb的DNA片段, 分别为PUC57载体和NTR1基因片段。利用DNA凝胶回收试剂盒回收pcDNA3.1(+) 表达载体和NTR1目的基因, 用琼脂糖凝胶电泳检测(图1B), 可得到大小分别为5.4 kb和1.3 kb的DNA片段, 分别为pcDNA3.1(+) 表达载体和NTR1目的基因。
2 pcDNA3.1(+)-NTR1重组质粒的构建及检测
pcDNA3.1(+) 表达载体与NTR1基因按一定比例经过连接、转化、挑克隆、扩增、提质粒后, 进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1C), 可得到约6.7 kb的DNA 片段, 为pcDNA3.1(+)-NTR1重组质粒。经DNA测序显示, 所扩增的NTR1基因序列和GenBank数据库中完全一致。对重组质粒经过Eco RⅠ和Hin dⅢ双酶切之后进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1D), 可得到分别约5.4 kb和1.3 kb的DNA片段, 分别为pcDNA3.1(+) 表达载体和NTR1基因。
3 最佳G418筛选浓度的确定及加压筛选
用不同浓度梯度的G418筛选培养基培养状态良好的CHO细胞 (10～14天), 以细胞全部死亡的最低浓度为最佳筛选浓度。最终确定CHO细胞的最佳G418筛选浓度为600 μg·mL−1。未经转染的CHO细胞, 只转染pcDNA3.1(+) 的CHO细胞和转染pcDNA3.1(+)- NTR1的CHO细胞分别经600 μg·mL−1 G418加压
筛
·1276·药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (9): 1273−1278
Figure 1 A: Restriction enzyme analysis of pcDNA3.1(+) and PUC57-NTR1. Lane 1: DNA marker; Lane 2: PUC57-NTR1 after digestion with Eco RⅠand Hin dⅢ; PUC57: 2.7 kb; NTR1: 1.3 kb; Lane 3: pcDNA3.1(+) (5.4 kb) after digestion with Eco RⅠand Hin dⅢ. B: pcDNA3.1(+) and NTR1 after DNA gel extraction. Lane 1: DNA marker; Lane 2: pcDNA3.1(+) expression vector
(5.4 kb); Lane 3: NTR1 gene (1.3 kb). C: pcDNA3.1(+)-NTR1 recombinant plasmid. Lane 1: pcDNA3.1(+)-NTR1 recombinant plasmid
高瞻远瞩英文
(6.7 kb); Lane 2: DNA marker. D: pcDNA3.1(+)-NTR1 recombinant plasmid after digestion with Eco RⅠand Hin dⅢ. Lane 1: DNA marker; Lane 2: pcDNA3.1(+): 5.4 kb; NTR1: 1.3 kb
选, 未经转染的CHO阴性对照组细胞几乎全部死亡; 转染pcDNA3.1(+) 的CHO阳性对照组细胞与转染p
cDNA3.1(+)-NTR1的CHO实验组细胞状态接近。
4 转染pcDNA3.1(+)-NTR1的CHO细胞的Western blotting 检测
对未经转染的CHO细胞和转染pcDNA3.1(+)- NTR1重组质粒的CHO细胞进行Western blotting检测(图2), 经转染的CHO细胞可得到NTR1蛋白条带。
5 NT和SR48692钙离子浓度检测
NT钙离子浓度检测时, 未经转染的CHO细胞加
Figure 2 The strip of NTR1 protein after Western blotting. Lane 1: Cell lysates from CHO cells which transfected with pcDNA3.1(+)-NTR1 recombinant plasmid; Lane 2: Cell lysates from the non-transfected CHO cells 入NT之后钙离子浓度不升高, 在转染pcDNA3.1(+)- NTR1成功的CHO细胞中加入不同浓度梯度的NT, 在一定范围内, 细胞内钙离子的浓度随着NT浓度的升高而升高(图3)。SR48692钙离子浓度检测时, 在一定范围内, 钙离子浓度随着SR48692浓度的升高而降低(图4)。从非线性回归拟合(用GraphPad Prism 5作图) 可得NT的EC50值为6.5 nmol·L−1, SR48692的IC50值为328.2 nmol·L−1。
Figure 3 Curve of the Ca2+ level inner cell responsing to different concentrations of NT, which is fit by non-linear regression in GraphPad Prism model [log(agonist) vs respon]. Bad on this chart, EC50 of neurotensin to NTR1 can be determined
张果等: 人源神经降压素受体-1稳转细胞系的建立及其应用·1277·
Figure 4 IC50 value of antagonist SR48692, which is fit by non-linear regression in GraphPad Prism model [log(inhibitor) vs respon]. The point reprented by a square is excluded becau of less cure regression
讨论
G蛋白偶联受体与癌症的发生和发展有着密切
的联系, GPCR的过度激活或抑制均可能导致细胞内
信号转导途径的失调, 从而引起紊乱的生理反应, 导
致异常的生理现象。目前药物市场上至少有一半的小
分子药物是GPCR的激活剂或拮抗剂, 2012年诺贝
congratulations
尔化学奖就颁给了“G蛋白偶联受体”结构的研究者。有很多的实验表明NTR1在人类的多种癌症中高
表达, 但是这些研究还不深入。
本实验以我国高发的恶性肿瘤肺癌、前列腺癌
和乳腺癌为研发目标, 基于NTR1与癌症的相关性
以及癌症发生、发展、迁移的致病机制, 经过构建pcDNA3.1(+)-NTR1重组质粒, 转染CHO细胞, 通
过G418筛选, 获得高表达人源NTR1蛋白的阳性单
克隆CHO细胞株。并通过对NTR1的天然配体NT
和NTR1已知的拮抗剂SR48692的钙离子浓度检测, 得到NT的EC50值和SR48692的IC50值, 与文
献[17]报道一致。证明了NTR1稳转CHO细胞系的成
功构建。
在本实验中重组质粒的转染是关键, 重组质粒
的浓度对转染效率有一定的影响, 转染时细胞的密
度也对转染是否成功有重要的作用。转染后加G418
抗生素进行筛选时要根据细胞的状态适当增加血清
的浓度。
由于NTR1蛋白介导的信号通路会影响细胞内
钙离子浓度, 采用检测细胞内钙离子浓度的Calcium Flux Assays来评判配体或化合物对NTR1蛋白的激
动或抑制作用。本实验所使用的FLIPR Calcium 6 Assay Kit是国内首先尝试的最新版本的钙流试剂盒,
在钙离子浓度检测时, 细胞状态良好, 作者所设置的化合物或配体的每一个浓度梯度有3个重复, 实验
结果显示3个重复的误差偏大, 可能是由于试剂盒
的原因, 有待于后续实验的观察验证。
本实验成功建立的高表达人源NTR1的CHO
borne是什么意思细胞系, 可用于体外研究NTR1蛋白的功能, 寻找
NTR1蛋白的拮抗剂。实验将继续在建立NTR1稳转
CHO细胞系的基础上通过计算机辅助药物设计从大
规模的小分子数据库中筛选可能对NTR1有抑制作
用的小分子, 并对这些小分子用建立的NTR1细胞
tre模型进行细胞活性测试, 进而得到若干个先导化合
物, 为治疗和NTR1蛋白相关的疾病发现新的药
物。
致谢: 在构建CHO/NTR1细胞系的过程中, 天津国际生
物医药联合研究院高通量筛选平台提供仪器设备; 天津中医
药大学提供FlexStation 3台式钙流检测工作站; 南开大学药物
化学生物学国家重点实验室提供实验材料。
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