wake wake海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)褐藻胶裂解酶基因的r克隆和生物信息学分析
晁雅熙;王淑艳;吴谡琦;陈颢
48个英语音标发音羽毛球的英文【摘 要】以海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)的基因组为模板,使用设计的褐藻胶裂解酶引物进行PCR扩增.将目的基因克隆至pet-22b(+)载体后进行测序.测序结果显示,基因aly-I I的大小为2170 bp,预测编码含有723个氨基酸的蛋白质.对该蛋白质进一步进行了生物信息学分析.利用ProtParam和ProtScale对蛋白质的理化性质进行分析,结果表明,蛋白质Aly-II的理论分子质量为85.6 kDa,理论等电点为5.1,并且是一种亲水性蛋白.利用软件MEG 6.0对蛋白质Aly-II进行系统发育分析,结果显示,蛋白质Aly-II很可能是PL-17家族的褐藻胶裂解酶.利用同源建模法构建蛋白质Aly-II的三维结构,Aly-II含有2个结构域,分别为(α/α)6 toroid结构域和 β-sheet结构域.%Using designed specific primers,the target aly-I I gene was amplified by PCR from the genomic DNA of Vibrio sp.QD-5,cloned into pet-22b(+)vector and then quenced.The result showed that the cloned gene was 2170 bp,encoding 723 amino acid residues.The bioinformatics analysis of Aly-II protein was further conducted using ProtParam and ProtScale to analyze the physical and chemical properties of the protein.The theoretical mol
ecular weight and pI of Aly-II were 85.6 kDa and 5.1,respectively.The protein had hydrophilic property.The phylogenetic trees were constructed by MEG 6.0 and phylogenetic a-nalysis showed that,Aly-II was most likely an alginate lya of PL-17 family.The three-dimensional struc-ture of Aly-II was constructed using homology modeling method.The structure of Aly-II displayed that it contained two ,(α/α)6 toriod domain andβ-sheet domain.湖南农业大学自考
韩文在线翻译器【期刊名称】《海洋科学进展》
【年(卷),期】2018(036)002
【总页数】11页(P290-300)
【关键词】七年级上册英语磁带Vibrio sp.;褐藻胶裂解酶;基因克隆;生物信息学分析
【作 者】晁雅熙;王淑艳;吴谡琦;陈颢
black market【作者单位】国家海洋局 第一海洋研究所,山东 青岛 266061;国家海洋局 第一海洋研究所,
山东 青岛 266061;国家海洋局 第一海洋研究所,山东 青岛 266061;国家海洋局 第一海洋研究所,山东 青岛 266061
【正文语种】中 文
【中图分类】Q939.97
褐藻胶是一类主要存在于褐藻细胞壁中的水溶性酸性多糖,由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸组成,2个单体之间通过α-1,4-糖苷键可组成3种不同的褐藻胶分子,分别为多聚甘露糖醛酸(poly M)、多聚古洛糖醛酸(poly G)和杂聚物(poly GM)[1]。某些细菌也能合成褐藻胶,保护它们免受抗生素等有害因子的伤害[2]。褐藻胶寡糖是褐藻胶降解而形成的产物,已经广泛应用于食品和医药行业[3-5]。
褐藻胶裂解酶是一种降解褐藻胶的工具酶,能够以β-消去方式作用于褐藻胶2个单体分子形成的糖苷键,将褐藻胶大分子降解成小分子的褐藻胶寡糖。褐藻胶裂解酶的来源十分广泛,包括细菌、海洋无脊椎动物、海洋藻类、真菌和病毒等,其中细菌是褐藻胶裂解酶的主要来源。目前,许多不同来源的褐藻胶裂解酶基因已经被克隆,并对褐藻胶裂解酶进行了表达、鉴
定和性质表征。根据褐藻胶裂解酶底物特异性的不同,褐藻胶裂解酶主要被分为两种,一种是专一性降解poly M的poly M裂解酶(EC4.2.2.3),另一种是专一性降解polyG的polyG裂解酶(EC4.2.2.11)。另外,还有少数裂解酶对poly M和polyG同时具有活性,这类酶被称为双功能裂解酶。根据褐藻胶裂解酶作用方式的不同,褐藻胶裂解酶被分为内切型和外切型两种[12]。内切型褐藻胶裂解酶作用于褐藻胶分子内部的糖苷键,主要产生不饱和寡糖;外切型褐藻胶裂解酶从褐藻胶分子的一端对褐藻胶进行降解,可以产生单体分子。目前,在已发现的褐藻胶裂解酶中,大部分都是内切型,外切型褐藻胶裂解酶只占很小一部分。在碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active Enzymes,CAZy)中,褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(Polysaccharide Lya,PLs)中的一类。根据蛋白质分子一级结构的不同,多糖裂解酶被划分到22个不同的家族中,褐藻胶裂解酶分布在7个不同的家族中,分别为PL-5,PL-6,PL-7,PL-14,PL-15,PL-17和PL-18。大部分内切型褐藻胶裂解酶属于PL-5和PL-7家族,而外切型褐藻胶裂解酶多属于PL-15和PL-17家族[6]。根据蛋白质三维结构的不同,褐藻胶裂解酶被分为3个家族,分别为βhelix家族、β-jelly roll家族和(α/α)n环形线圈家族[7]。PL-6家族的褐藻胶裂解酶属于β-helix家族,PL-7,PL-14和PL-18家族的褐藻胶裂解酶属于β-jelly roll家族,PL-5,PL-15和PL-17家族的褐藻胶裂解酶属于(α/α)n环形线圈家族。另外,根据褐藻胶裂解酶分子量
的大小,褐藻胶裂解酶被分为小型裂解酶(25～30 k Da),中型裂解酶(大约40 k Da)和大型裂解酶(>60 k Da)[8]。
目前,褐藻胶寡糖的活性受到了越来越多的关注,褐藻胶裂解酶,特别是内切型褐藻胶裂解酶可用于褐藻胶寡糖的生产[9]。褐藻胶裂解酶也可用于测定褐藻胶分子的精细结构,精细结构的获得能够帮助理解褐藻胶的分子组成是如何影响它的物理性能的[10-20]。红藻和褐藻的原生质体的获取,也需要有褐藻胶裂解酶的参与[21-22]。此外,褐藻胶裂解酶在囊性纤维病的治疗方面也具有一定的潜力[23-24]。
利用基因工程技术可以使褐藻胶裂解酶进行异源高效表达,从而提高褐藻胶裂解酶的产量。本研究通过基因工程的方法,对褐藻胶裂解酶基因进行克隆,并对其进行了生物信息学的分析,为褐藻胶裂解酶的酶学性质,结构与功能及开发应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和培养基
海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)由本实验室筛选分离,保存在中国微生物保藏中心(CGMCC NO.1
4172),E.coli DH5α为北京全式金生物技术有限公司产品,p ET-22b(+)由本实验室保存,2×Taq PCR Mastermix、DNA分子量标准,核酸染料和琼脂糖凝胶回收试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司产品,限制性核酸内切酶和T 4 DNA连接酶为NEB公司产品,其余试剂均为分析纯产品。
海藻酸钠液体培养基:(NH 4)2 SO4 5 g,K 2 HPO4 2 g,MgSO4 1 g,FeSO4 7H 2 O 0.01 g,Alginate 5 g,溶解于过滤后的1 L海水中,并与121℃湿热灭菌20 min。
1.2 实验方法
1.2.1 褐藻胶裂解酶活力的测定
将Vibrio sp.QD-5接种到海藻酸钠液体培养基中,26℃,120 r/min培养48 h后,10 000 r/min、4℃离心20 min,收集菌体,PBS洗涤3次后,用高压细胞破碎仪将菌体破碎,然后在10 000 rad/min下离心10 min,收集上清,即为粗酶提取液。向100μL(5 g/L)海藻酸钠溶液中加入20μL(10 mmol/L)MgCl2溶液,震荡后加入10μL酶液,室温下反应30 min,沸水中煮5 min终止反应,冷却至室温,向上述溶液中加入0.025 mol/L NaIO4溶液100μL,混匀,室温下反应20 min,
后加入120μL(20 g/L)Na2 S2 O3溶液,震荡至黄棕色消失。静止2 min后,加入200μL(6 g/L)2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid,TBA)溶液,100℃下加热10 min,迅速冷却。此时样品为红色,且红色越深酶活性越高。将得到的样品立刻移入比色皿中,测548 nm处吸光度。在实验室测定酶活的条件下,待测酶液中每毫克(mg)的蛋白质每分钟可以分解底物所产生的产物的微摩尔数(μmol)就定义为该酶在该条件下的一个酶活力单位(1 U)。
1.2.2 褐藻胶裂解酶基因的克隆
根据Vibrio sp.QD-5的基因组序列(在GenBank中的序列登记号为:PRJNA382465),合成以下引物,Paly-II-1:5'-GGCAGGATCCGATAATAATGAGC-3',Paly-II-2:5'-TAACTCGAGAATTTGTGCGAATGC-3'。以Vibrio sp.QD-5的基因组为模板,扩增目的基因aly-II。PCR扩增的反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性40 s;40℃退火40 s;72℃延伸160 s,35个循环;72℃延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。目的基因经限制性内切酶Bam HI和Xho I酶切,切出黏性末端,质粒p ET-22b(+)用同样的限制性内切酶切出相同的黏性末端。利用T 4 DNA连接酶将目的基因与质粒连接,转化E.coli DH5α感受态细胞。细胞涂布在含有100μg/m L氨苄青霉素的LB平
板上,37℃培养过夜。挑取单克隆,通过菌落PCR验证阳性克隆。阳性克隆委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.3 基因及其编码产物的生物信息学分析
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四六级英语成绩查询入口利用NCBI中的Nucleotide BLAST和Protein BLAST工具对核酸序列及其所编码的蛋白质氨基酸序列进行同源性搜索;对利用NCBI的ORF finder开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)进行查找;利用分析蛋白质性质和结构的软件ExPASy(Expert Protein Analysis System)的Translate和Protparam工具对ORF进行翻译和对应蛋白质的理化性质分析;由ProtScale程序对蛋白质的疏水性进行分析;由MEG 6.0软件完成核酸序列及氨基酸序列的系统发育分析;分别利用在线工具SOPMA和SMART完成蛋白质二级结构和结构域的预测;分别利用在线工具Phyre2和3DLigandSite完成蛋白质三级结构和底物结合位点的预测。
2 结 果offic
2.1 褐藻胶裂解酶的活力测定
采用TBA法测定海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)所产的胞内、外褐藻胶裂解酶的活性,结果显示,
胞内粗酶的酶活力达到54.6 U/mg,胞外样品的酶活力没有检测到。由此说明,海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)可以产生胞内褐藻胶裂解酶。
2.2 褐藻胶裂解酶基因的克隆
以海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)的基因组为模板,利用设计的褐藻胶裂解酶引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳显示基因aly-II的大小约为2 000 bp(图1)。将扩增的基因片段克隆进入质粒pET-22b(+)后进行测序,测序分析结果显示基因aly-II的大小为2 170 bp。
图1 褐藻胶裂解酶基因的PCR产物Fig.1 The PCR product of alginate lya gene注:M代表DL2000 DNA Marker;1,2,3均为基因aly-II
2.3 褐藻胶裂解酶基因及其编码产物的生物信息学分析
对基因aly-II的分析结果显示,该基因编码一个含有723个氨基酸的蛋白质Aly-II。在Genbank中对该蛋白质进行同源性检索,结果显示蛋白质Aly-II与褐藻胶裂解酶WP_085568977.1(Vibrio alginolyticus),ADW41661.1(Vibrio midae),WP_095759892.1(Vibrio sp.V1B),AKH41065.1(Vibrio sp.W13),WP_009703185.1(
Vibrio harveyi)和软骨素裂解酶WP_045424109.1(Vibrio jasicida),WP_045465198.1(Vibrio hyugaensis),WP_075706108.1(Vibrio panuliri),WP_065677161.1(Vibrio celticus),WP_076678843.1(Vibrio splendidus)分别具有99%,99%,98%,99%,98%,96%,96%,95%,87%和87%的相似性(图2)。在CAZy数据库中褐藻胶裂解酶和软骨素裂解酶同属于多糖裂解酶家族。预测aly-II编码多糖裂解酶基因。
