图1.
治疗性单抗技术演化
一、单抗技术的发展、应用和市场前景
Kohler 和Milstein 于1975年发明了被称之为“魔弹”的单抗技术，并在1984年获得了诺贝尔奖。单抗是B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生，其重链和轻链所形成的结构域可以识别和结合
特异性抗原。1987年单抗技术被成功应用到诊断试剂当中，但由于HAMA (人抗鼠抗体) 反应，没能有效应用在人类疾病的治疗上。90年代，随着基因工程技术的迅速发展，治疗性单抗从早期100%的鼠源性单抗(Mab )，到嵌合抗体，人源化抗体(Humanized Mab )，到近年的全人源性抗体 (图1、2)，逐步消除了抗体的免疫源性问题，在保持对抗原高亲和力的同时，改善了抗体的药动力学。
1997年FDA 批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单抗药物Rituxan ,CD-20上市，并进入56个国家，由IDEC /Genentech
/Roche 三大药厂联合生产，至今仍然供不应求1。2001年5月，《时代周刊》封面文章指出，治疗性单抗是人类与癌症战斗中的一次重大胜利2。单抗药物的主要治疗机制是：1. 直接诱导癌细胞凋亡或抑制癌细胞生长和代谢，或通过 补体效应或ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用) 间接杀死癌细胞。
2. 癌症、心血管等疾病的导向治疗：以单抗荷载同位素、 毒素蛋白、抗生素等药物制成生物导弹。
3. 应用抗体T 细胞、抗IL-2R 的单抗防治器官移植排斥反 应等。
4. 以单抗制成避孕、传染病的预防药物。
至2004年，FDA 已批准了20多种治疗性单抗药物，约一半用于治疗癌症 (详见附录1，2004年FDA 批
准了10个治疗用抗体，1个诊断用抗体)，在治疗慢性疾病如关节炎方面也取得了显著的临床效果。已上市抗体有不少已成为年销售额数亿美元的“重磅炸弹药物” (Blockbuster Drug )。全球抗体药物的市场增长十分迅猛，有约200多种单抗在临床实验，占整个临床生物技术药品总数的三分之一多，其中四分之一在临床三期或等候批准。预计单抗的全球销售额将从2004年的50多亿美金增至2010年的150亿美金，平均年增长30%。预计整个抗体市场 (包括多抗) 2007年即将达到150多亿美金 (图3)。2000年人类基因组序列初稿的完成，近年蛋白质组和结构基因组技术的蓬勃发展，也给抗体研究带来更多机遇和挑战。国内正在推动的抗原表位组学、抗体组学和抗体药物组学，将对中国抗体技术的发展起到很大的促进作用。
抗体纯化手册
孙文改 陈昕·通用电气(中国)医疗集团Bio-Sciences (原Amersham Biosciences
)
图3.
全球单抗销售额趋势
2005-03-10-BJ
图2. 上市单抗的分布图51 正在临床试验的单抗分布51
鼠源性单抗30%
人源化抗体40%
嵌合型抗体30%
人源化抗体65%
人源性抗体9%
鼠源性
单抗15%主营业务收入分录
嵌合型
抗体11%表1. 2007年全球治疗与诊断用抗体（单抗与多抗）市场预测（单位：
亿美元）
52
利用DNA 重组技术，在全分子抗体往嵌合抗体及改型抗体的发展的同时，小分子及单链等基因工程抗体 (Gab ) 也得到了极大的发展 (表2)。
2.2 单抗特性及纯化策略专升本算第一学历吗
每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解他们的共性，又要了解个性，从而制定相应的纯化策略 (下表3)。
二、单抗的结构、种类、性质及纯化策略概览
2.1 单抗的结构和种类
传统单抗的Y 型结构，由重链和轻链组成 (图4
)。
图4. 全分子、
小分子及单链抗体结构示意图
表3. 单抗的基本性质
表2. 基因工程抗体 (Genetically engineered antibody, Gab) 49、50
中国教育考试图5. 抗体及主要杂蛋白等电点分布范围(右下图为抗体等电聚焦
结果图：基因工程抗体(Gab)由于细胞培养过程带来的糖基化的
不均一，等电点往往较分散而非单一条带)
2.3 针对不同抗体和其生产宿主的特性制定纯化策略(下表4)
* 需考虑不同宿主病毒灭活验证问题。
表4. 不同宿主生产抗体纯化策略
三、不同亲和层析介质纯化单抗及优化策略
3.1 Protein A Sepharo、rProtein A Sepharo亲和 层析介质与抗体的结合
目前，约70-80%的抗体纯化使用了Protein A、Protein G亲和层析13。A蛋白(Protein A)来源于金黄色葡萄球菌的一个株系。A蛋白作为亲和配体被固定于琼脂糖上，它所包含的5个与IgG Fc段结合的结构域被空出来以便捕捉IgG。1个A蛋白分子至少可以结合2个IgG。A蛋白也可以结合另一些免疫球蛋白与如IgA、IgM。天然和重组的A蛋白(rProtein A)对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的A蛋白经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点固定于琼脂糖上，增加了与IgG的结合能力。A蛋白与IgG的结合强度依赖于该抗体的物种来源，而其动态结合能力则决定于结合强度及其他因素(例如上样时的流速)。
3.2 Protein G Sepharo 亲和层析介质与抗体的结合
G 蛋白是一种源自链球菌G 族的细胞表面蛋白，一种三型Fc 受体。其通过类似于A 蛋白的非免疫机制与抗体的Fc 段结合。像A 蛋白一样，G 蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharo 还可以特异性低亲和地与重链的C H 1及轻链的C 结合而用于纯化Fab 及F(ab’)2 54。另外，Protein G 可以广泛、更强地结合许多类型的IgG ，多克隆IgG 及人IgG ，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配体脱落也相对更低。
3.3 Protein A 、Protein G 亲和层析方法优化14
由于不同抗体与A 蛋白或G 蛋白的亲和力不同，有必要单独优化结合和洗脱条件和层析柱载量，过程可以通过用自动化层析系统如AKTA 来完成。 以下是一个杂交瘤细胞培养单抗的纯化条件探索 (表5，图6-9)。
图7. AKTA自动摸索HiTrap rProtein A FF最优pH洗脱条件: pH梯度从pH 7.4到pH
sav3.0
3.4 MabSelect 系列——大规模抗体纯化亲和层析介 质16,17
MabSelect 是一系列最新的大规模纯化抗体的亲和层析介质。它们的特点包括：
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1. 更高的流速和动态载量：MabSelect的蛋白A配体经基因 工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫键 (见图11)，同时增加了对IgG的有效结合。蛋白A 和凝 胶交联时采用了全新的工艺流程，增加了介质的稳定性和 胶内孔的表面积，因此增加了流速和动态载量：在线形流 速为500 cm/hr和柱床高度为20 cm的条件下，每毫升 MabSelect的动态载量可以达到30多mg IgG (图10、12), 超过原来A蛋白介质数倍，在纯化特性方面也明显优于其 他几种蛋白A偶联的介质。图10、12是几种不同的蛋白A 介质纯化人IgG 的动态载量与线形流速的比较。近年来， CHO细胞单抗的表达量进一步提升到每升2-5克，因应市 场对更高载量蛋白A亲和介质的需求，2004年底推出的 MabSelect Xtra，载量又比普通MabSelect增加了30% 46。
优化条件优 化 过 程 优化目的、结果rProtein A 柱利用AKTA
的自动探索功尽量避免杂蛋白的
结合缓冲液
能 (scouting ) 连续尝试不结合，在载量与纯NaCl 浓度
同浓度的NaCl (0-3.5M )下度间取得平衡。最单抗的载量和纯度。佳条件为NaCl 2.5M 。
rProtein A 柱利用AKTA 的自动缓冲液避免剧烈的洗脱条洗脱pH
配置功能 (bufferprep ) 在件 (如pH<3.0) 易导pH7-2.5范围逐步降低pH ，致抗体失活。最佳找最佳的pH 洗脱条件。在条件为pH 4.5。
洗脱缓冲液中加精氨酸，更利于保护抗体活性，提高回收率和防止抗体聚合15。
Superdex 200利用自动探索功能 (scout-去除微量杂质和二、柱上样量ing ) 尝试不同上样量 (1-5%
多聚体，达到最终柱体积)，并探索连续自动所需纯度。
进样的条件。
表5. 抗体层析方法优化图8. Superdex 200精细纯化
图9. 全自动二维抗体纯化及纯化结果电泳图 (还原电泳)
图6. AKTA自动摸索HiTrap rProtein A FF上样最优盐浓度
0.2
0.40.60.81.0Total amount of hIgG applied (mg/ml adsorbent)
糟糕的拼音图10. 蛋白A亲和凝胶载量测定
同传
2. 更低的宿主杂蛋白吸附，抗体纯度更高: 著名抗体生产商 IDEC公司的研究显示，MabSelect对CHO细胞宿主杂蛋 白的吸附比其它同类介质如Prop-A低七倍，对其它小 分子杂质的吸附比Prop-A更低数百倍以上48。毫无疑 问，MabSelect所纯化的抗体纯度更高，这将大大有利于大 规模治疗性抗体的下游纯化。
3. 更低的蛋白A 脱落: MabSelect由于通过环氧共价交联，蛋 白A的脱落比其它同类介质低一半。微量的脱落可以在后 续的层析中，如凝胶过滤或离子交换层析有效去除。
4. 更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，
MabSelect可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条 件下，通过增加柱直径进行线性放大。装填在内径为60- 80厘米层析柱时，可以在一个工作日处理超过上万升高表 达的抗体发酵液18。
5. MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连 续的生产中，介质寿命是成本效益的一项重要指标。蛋白 A配体常比一般层析介质的配基对在位清洗 (CIP) 试剂更 不稳定，有效的CIP有助延长介质使用寿命。MabSelect的 CIP和除菌程序简单，一般用很常规和经济的试剂如50 mM NaOH+1M NaCl 或50 mM NaOH+0.5 M Na 2SO 4
溶液就可以去除沉淀和变性物质；用非离子去污剂或酒精 可以去除通过疏水作用结合的物质；用0.1M醋酸和20％
酒精可以除菌。由于CIP所使用的化学试剂不能被重复使 用，CIP试剂的成本对整个生产成本的影响不容忽视。某 些蛋白A介质使用尿素、盐酸胍等作为CIP试剂，长期的 CIP花费比蛋白A介质本身还高 (图13)。经测试，Mablect 配合CIP (50 mM NaOH+1 M NaCl) 纯化三百次后，纯 度与回收率
不变 (图14)19,20。2004年底新推出的MabSelect SuRe ，更可以直接用0.1 M NaOH 做CIP ，两百次后纯度 与回收率保持不变48。
6. 生产过程无动物血清成分：Mablect配体重组蛋白A在大 肠杆菌中表达，并通过多步柱层析纯化，完全适用于抗体 药物生产纯化。
3.4.1 MabSelect 成功案例21
德国匹兹堡的罗氏制药公司一种用于肿瘤治疗的单克隆抗体已进入三期临床。他们将目前几种蛋白A 介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的MabSelect 。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B 淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到MabSelect 填充的FineLINE 柱，直径300 cm , 柱高20 cm ，上样的浓度是30 mg /ml 。 洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和
pH 值到6.8-7.0。再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上。
rProtein A 图11. MabSelect蛋白A的定向硫键偶连方式增加了对IgG的有效结合
200
threadpool400
600
8001000
102030405060MabSelect Product A Product B
Flow velocity [cm/h]
图14. Mablect每五次做一次CIP (500 mM NaOH+1 M NaCl)，第1-299次纯化的选择层析图谱，每次纯化回收率95-100%
deathworm
图13. 使用不同试剂有效在位清洗 (CIP) 时的成本比较20。使用尿素、盐酸胍等作为CIP试剂，长期的CIP花费比蛋白A介质本身还高
