中国兽医科学 2021，51(0_5):.569-574
Chine Veterinary Science网络首发时间：2_02l-〇l-28 D O I：10.16656/j.issn.1673-4696.2021.0071 中图分类号：S852.612文献标志码：A文章编号：1673-4696 (2021)05-0569-06鉴别大肠杆菌〇8/〇9血清型双重PCR方法的建立
朱红，李妍，魏娟文，张耀东，王瑶，陶程琳，A F A Y IB O D o ssS h J e a n A p6t r e，李涛，祁晶晶，田明星，丁铲，于圣青*，王少辉*
(中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241)
摘要：为了建立一种能鉴定大肠杆菌08、09血清型的高效、快速的双重P C R方法，参考G e n B a n k中大 肠杆菌0…、09血清型的0抗原合成基因簇序列筛选特异性靶标基因并设计合成2对P C R引物，通过优化 反应条件，分析双重P C R方法的特异性、敏感性，通过检测大肠杆菌临床分离株验证双重P C R的实用性。结果显示，所建立的双重P C R方法可有效鉴定08、09血清型大肠杆菌，对其他血清型大肠杆菌及菌株则无交 叉反应，表明P C R方法的特异性好；〇…和09血清型的菌体最低检出限分别为1X1〇3C F U/m L和1X1〇4 C F U/m L，其D N A最低检出限分另为10 p g/V L和500 pg/y L.临床分离菌株检测显示，双重P C R检测结果 与传统血清凝集结果一致结果表明，本研究建立的双重P C R方法可有效、特异、灵敏、快速鉴定大肠杆菌 08、09血清型，为大肠杆菌08、0(|血清型检测及其流行病学调查提供
了新的技术手段_
关键词：大肠杆菌；清型；双重P CR
Establishment of duplex PCR method for detection of
Escherichia coli Os and 09 rotypes
ZHU ll〇ng,IJ Yan,WEI Juan-wen,ZHANG Yao-dong,WANG Yao,TA0 Cheng-lin, AFAYIBO Dosh Jean Apotre,LI Tao,QI Jing-jing,TIAN Ming-xing,DING Chan, YU Sheng-qing* , WANG Shao-hui* (Shanghai Veterinary Rearch Institute Xhine Academy of A gricultimd Sciences ,Shanghai200241 ,China)
Abstract：The aim of this study was to establish a duplex PCR method to detect Escherichia coli 08 and 09rotypes efficiently and quickly. According to the speci fic quence of 0 antigen synthesis gene cluster li08and 09rotypes in GenBank,two pairs of primers were designed and synthesized. The specificity and nsitivity of the duplex PCR were analyzed by optimization of conditions,and the E. coli clinical strains were detected to verify the practicability of the duplex PCR. The results showed that a duplex PCR method was effective for the identification of E. coli08and 09s
erotypes,but no cross reaction was found for other E. coli rotypes and species. This result indicated the good specificity of the duplex PCR method. The minimum detection limits of duplex PCR for E. coli 08and 09rotypes were 1X l〇{,1X101CFU/mL for bacterial ,and 10 pg//^L ,500 pg/ ^L for genomic DNA,respectively. The results of duplex PCR for detection of clinical isolates were coincident with the traditional rological assays. The duplex PCR method established in this study is effective,specific nsitive and rapid assay for li 08and 09 rotypes,which will be a new method for rotype detection and epidemiological investigation of E. coli08and 09rotypes.
收稿日期：2020-12-13；修回日期：2021-01-19
基金项目：同家重点研发计划项I丨（2016YFD0500800,2018YFE0102200)；上海浦江人才计划项U (2019PJD057)；兵团财政 科技计划项目（2020AB025)；中央级公益性科研院所基本科研业务费（2020JB03)
作者简介：朱红（1994-)，女，江苏江阴人，硕士生，研究方向为畜禽细菌性传染病，E-mai 1:*****************。*通讯作 者：王少辉（1983-)，男，河丨封洛阳人，博士，研究员，主要从事畜禽细菌性传染病研究，E-mail:shwang0827@126.
com；于圣青(1961)，女，江苏扬州人，博士，研究员，主要从事畜禽细菌性传染病研究，E-mail:yus
okano_hvri.acc
570中国兽医科学第51卷
Key words：Escherichia coli；08；09；rotype；duplex PCR
* Corresponding authors：WANG Sha〇-hui,E-mail ：******************；YU Sheng-qing,E-mail ：yus@ shvri.ac
大肠杆菌（Escheric/i/a co//)广泛存在于自然界 中，其中大部分是非致病性大肠杆菌，但某些特殊 血清型具有致病性。致病性大肠杆菌可以引起人或 动物的腹泻、肠炎等肠道内感染症状和新生儿脑膜 炎、泌尿道感染、败血症等肠道外病症1;。大肠杆菌 抗原复杂，主要有菌体抗原(〇)、荚膜抗原(K)、鞭毛 抗原(H)和菌毛抗原(F)等，是血清型鉴定和分型的 物质基础。其中，◦抗原是最为常用的分型抗原，从1940年Kauftnann开始用血清学方法分型至今，已鉴定了 190多种0抗原。研究发现，致病性大肠 杆菌与特定0抗原血清型有一定相关性，且不同致 病性大肠杆菌的优势血清型不同〇8、〇9血清型 大肠杆菌广泛流行于猪场、羊场，给养殖带来了严 重的经济损失。〇8、〇9血清型大肠杆菌是引起猪腹 泻的产肠毒素大肠杆菌的主要血清型〜]；亦可引 起羊发病，羔羊易感，该病发病急、死亡快，来不及 治疗，常给养殖场造成重大经济损失。由于大肠杆 菌携带的相同或不同耐药因子的多样性和多变性 以及抗生素的滥用，使其产生了广泛的耐药性，从 而给流行病学调查及疫病防控带来了闲难
目前，大肠杆菌的血清分型主要采用单因子血 清进行血清凝集试验进行鉴定。然而，血清凝集试 验存在诸多不足，如交叉反应比较严重、自凝现象 严重、敏感性低、菌体表面抗原干扰等。因此，实现 大肠杆菌血清型的快速有效检测，对于大肠杆菌鉴 定具有重要的作用。
随着大肠杆菌全基因组测序及〇抗原合成基 因族序列的鉴定完成，聚合酶链式反应（P C R)等分 子生物学检测方法的特异性强、敏感性高、操作简 单、检测快速等优点，逐步用于大肠杆菌血清型鉴 定，弥补了传统血清凝集试验方法的不足。我们前 期研究及其他学者已针对不同致病性大肠杆菌的 0抗原合成基因族特异性基因，建立了 〇抗原血清 型多重P C R检测方法IH3]。但是，没有针对大肠杆 菌08、09血清型的快速检测及鉴别诊断P C R方法。
本研究分析筛选〇8、〇9血清型大肠杆菌的〇抗原特异性靶标基因，并针对特异性靶标基因设计 引物，建立了一种大肠杆菌〇8、〇9血清型双重PCR 检测方法，为大肠杆菌〇»、〇g血清型的鉴定及其流 行病学调查提供了技术手段。1材料与方法
1.1菌株
大肠杆菌、沙门菌等菌株由本实验室分离鉴定 或购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，包括：
o s和09血清型大肠杆菌阳性菌株及其他血清型大 肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢沙门 菌、鸭疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、禽巴氏杆菌等。
1.2试剂和仪器
细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北 京）有限公司。2X PCR Master Mix、DNA Marker 购自南京诺唯赞生物科技有限公司。PCR仪购自ABI 公司。电泳仪、凝胶成像系统购自上海天能生物科 技有限公司。
1.3引物设计
通过〇8、〇9血清型大肠杆菌〇抗原基因簇比 对分析，选择〇8血清型大肠杆菌〇抗原A B C转运 蛋白通透酶编码基因w z m基因及09血清型大肠杆 菌0抗原ABC转运蛋白A T P结合蛋白编码基因 基因作为靶标，设计特异性引物（表1)，由上海 擎科生物科技有限公司合成。
表1本研究使用的引物
Table 1The primers ud in this study
引物
Primers
序列^—3')
Sequence
靶基因
Target gene
大小/bp
Size
crispsEC08-F CAGGCACGCTATCAAACTAG08w zm
208
EC08-R CGCTCTGACCTTTATCCAGCA08w zm
EC09-F GTACGTTACTGAAGCTGCTG09wzt
326
EC09-R GAGCGCTTCATCGACGATCA09wztptember怎么读
1.4细菌基因组DNA提取
根据细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌 基因组D N A，并于_40 °C保存备用。
1.5 双重PCR方法建立
分别以〇8、〇9血清型大肠杆菌阳性菌株基因 组D N A为模板建立单基因P C R反应体系。然后，采 用方阵法优化引物浓度、退火温度等条件，确定最 佳P C R反应体系及反应条件，建立双重P C R方法。将双重P C R产物上样于1%琼脂糖凝胶进行电泳，然后回收P C R目的片段，送上海擎科生物科技有限
第5期朱红等：鉴別大肠杆菌（V〇«血淸型双重P(:R方法的建立571
公司测序，分析P C R产物的特异性。
1.6 PCR特异性分析
分别以不同血清型大肠杆菌、沙门菌、金黄色 葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、禽巴氏杆菌等为模板 进行P C R，分析双重P C R方法的特异性。
1.7双重PCR的敏感性试验
分别培养〇8、〇9血清型大肠杆菌阳性菌株，然后收集菌体倍比稀释，制备1X106、1X105、1X104、1X103、1X102和 10C F U/m L的细菌悬液。取 1 ML 菌液作为模板，按照优化的P C R反应条件进行扩 增，分析双重P C R方法的敏感性。
1.8双重PCR检测DNA的敏感性试验
分别提取〇8、〇9血清型大肠杆菌阳性菌株基 因组D N A，并依次稀释浓度为100ng/fxL、50ng/p L、1ng/p L、500 pg/V L、10 pg/n L、l pg/p L、0.1 pg/f^L。取1 M L作为模板进行扩增，检测双重P C R方法的
D N A敏感性。
1.9临床样品双重PCR检测
采集养殖场粪便及组织病料，通过预增菌、麦康 凯平板培养筛选鉴定大肠杆菌分离株然后，应用 建立的双重P C R方法检测大肠杆菌分离株的血清 型。经P C R鉴定为08、09血清型阳性的单菌落，再 以大肠杆菌0抗原单因子血清进行玻片凝集试验，验证双重P C R结果。
2结果
2.1双重PCR方法的优化及建立
分别以Os血清型大肠杆菌（CE189)和Oy血清 型大肠杆菌（CE223)基因组DNA为模板，均可扩增 到特异性目的条带，大小与预期结果一致。根据单 基因PCR扩增条件，优化引物浓度、退火温度，建立 双重PCR方法，可特异性扩增出目的条带（图1)。测序结果表明特异性目的条带序列与目的基因序 列一致。经过条件优化确定的最适PCR反应体系 为:2XPCRPreMix 10.0 pL、引物 EC08-F、EC08-R、EC09-F、EC09-R 各 1.0 p L、模板 1.0 p L、ddH20 5.0 m L。最佳 PCR 反应程序为：95 °C5 min;95 °C 45s，50 °C30s，72 °C30s，35 个循环；72 °C lOmin。
暑期初中家教多少钱2.2特异性检测
分别以不同血清型大肠杆菌及其他种属细菌 的菌体进行特异性检测，结果显示，仅有0S、09血清型大肠杆菌可扩增到特异性条带，而大肠杆菌其他血清型(〇1、〇2、〇6、〇16、〇l S、〇20、〇:!8、〇7:!、〇78、〇101、〇丨39、〇141、〇M9、〇157)、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸭 疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均
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流水线英文
2000 !>[)
I500 l>p
1000 bp
750 hp
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250 1)|)
100 bp
图丨大肠杆菌CVO，血清型双重PC R方法的建立
Figure 1Development of duplex PCR for detection of E.
coli 08 and 09 rotypes
M:D N A分子质量标准；1：以0K和09血清型混合为模板；2:08血清 型；3:09血清型；4：阴性对照
M：D L2000 D N A Marker；1：Templates of mixed 0K and 09 rotypes；
2 ：08rotype ；
3 ：09rotype ；
4 ：Negative control.
无扩增条带（图2)，表明建立的双重P C R检测方法 可特异性检测和鉴别大肠杆菌〇8、〇9血清型。
2.3菌液的PCR敏感性检测
分别以稀释的o8、o a血清型大肠杆菌菌液为 模板进行双重P C R的结果显示，对O s血清型大肠 杆菌的最低检测限为1X1(F C F U/m L；对09血清型 大肠杆菌的最低检测限为l X104C F U/m L(图3)。
2.4 PCR检测DNA的敏感性试验
分别以倍比稀释的大肠杆菌〇«、〇9基因组 D N A为模板进行多重P C R扩增的结果显示，双重 P C R最低可以检测出10 p g/V L的0…血清型大肠 杆菌基因组D N A，能检测出500 p g/y L的09血清 型大肠杆菌基因组D N A(图4)。
2.5临床样品中大肠杆菌分离株的PCR检测
采集临床样品，通过选择性培养基分离鉴定40 株大肠杆菌分离株，利用建立的双重P C R方法检测 的
结果显示，大肠杆菌为0»血清型11株，阳性率 为27.5%;09血清型有8株，阳性率为20%(图5)。同时，采用玻板凝集方法进行血清型鉴定，〇8、〇9血清型大肠杆菌均能够与相应的单因子血清发生凝 集反应，与双重P C R方法结果一致。
3讨论
大肠杆菌0抗原是最为常用的分型抗原，其血 清型种类繁多。传统的血清型检测方法为血清凝 集试验，该试验是针对0抗原生物学特性不同来检 测大肠杆菌血清型，由于其稳定性高至今仍在使用，但是也存在一些缺点，如血清价格高昂，且易受菌 体表面抗原十扰；存在免疫交叉反应，自凝现象严
572中闻啓眹科？
第51卷
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
图2双重PC R 方法的特异性检测
Figure 2 The specificity analysis of duplex PCR
M：丨)NA 分子质量标准；1：以0…和，血清型洮合为糢板；2:C \血清型大肠杆菌；3:();，血清型大肠杆茁；4:0，血清型大肠杆茵；5:02血清型大 肠杆菌；6:06血清型大肠杆菌；7:0l t ，血清型大肠杆菌；8:0,«血清型大肠杆简；9:Oai 血清型大肠杆菌；10:O:w 血清型大肠杆菌；11:07:，血清型 大肠杆菌；12:0t h 血清型大肠杆葙；13:〇k m 血清型大肠杆菌；14:Ow 血清型大肠杆茵；15:0IU 血清型大肠杆菌；16:Olw 血清型大肠杆菌；17:
OI S 7血清型大肠杆菌；18：鼠伤寒沙门茵；19：肠炎沙门菌；20：鸭疫里默氏杆菌；21：金黄色葡萄球菌；22：铜绿假单胞菌；23：阴性对照
M ：DL2000 DNA M arker ； 1 ：Templates of m ixed 0H and 09 rotypes ；2：f:.co// 0H rotype ；3：f ：.co// 0«» rotype ； 4 ：/：.co// 〇i rotype ；5：E.co// O ： rotype ；6：E.co// 06 rotype；7：l:.coli O：, rotype ；8：E.co// 0；H rotype ；9：/:'.co// O j,, rotype ； 10：/:.co// C ):w rotype ； 11 ：l:.coli O；., rotype ； \2：
l:.coli 〇t h rotype ； \3：E.coli 0,〇, rotypo ； 14 ：/:.co// 0|；« rotype ； 15：/：.co// O,,,
rotype ； \6：E.coli 0|W rotype ； 17 ：f:.coli O 157 rotype ； 18： Salm onclln typhimurium ； \9 ： Salm onella cntcritidis ；20 ： Ricmerella nnntipcslHcr ；2\ ： Staphylococcus aureus ；22：fJ si'uciom oniis «ieruginosa ； 23 ： Negative control.
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图3双重PCR 检测菌液的敏感性试验
Figure 3 Sensitivity test of duplex PCR usin^ bacterial culture M:DNA 分子质量标准；1:1 X 10“CFU/mL;2:l X l 〇3CFU/ml,;3:l X 10，C 丨
X lO 'C F U /m U il X |〇2C R /m l.;6:10 CFU/mL;7：阴
性对照
ball valve
disruptorM ：DL2000 DNA Marker；l ： 1 X 106 CFU/mI.；2： 1 X l 〇5 CFU/mL ；3： 1 X 101 CFU /m l.；4： 1 X 10;, CFU /mL ；5： 1 X l 〇- CFU /m L ；6： 10 CFU /mL ；7： Negative control.
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1 500 l>p 1 ()00 }>p 750 bp 500 h p 250 l>p 100 b p
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图4 PC R 检测细菌基因组丨)N A 的敏感性试验
Figure 4 Sensitivity test of PCR using bacterial DNA
\4：抓/\分子质量标准；1:100叩“丨，；2:50118“丨，；3:1叩/>丨，；4:500丨叫/^丨.；5：丨0叩//^;6:1卩8/>丨.：7:0.1卩以/^;8：阴性对照
M ： DL2000 DNA Marker ； 1 ： 100 ng/ fx L ； 2 ： 50 ng/ M I -; 3 ： 1 ng/ /i l. ； 4 ： 500 p«/ fi I. ； 5 ： 10 pg/ ft L ； 6 ： 1 pg/ ^ I. ； 7 ： 0.1 pg/ ^ I. ； 8 ：
Negative control.
第5期朱红等：鉴别大肠杆菌0»/09血清型双重PCR方法的建立573 M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
2 000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
图5临床分离株的双重PC R检测
Figure 5 Detection of clinical isolates using duplex PCR
M:D N A分子质量标准；1〜24：分别为大肠杆菌分离株的编号。
M：D L2000 D N A Marker ；1—24 ：T h e number li isolates,respectively.better me是什么意思
重；敏感性低、费时费力等，为大肠杆菌血清学鉴定 带来了极大的闲扰。因此，研究新型快速准确的血 清型分型鉴定方法具有重要意义。
不同血清型大肠杆菌编码的〇抗原不同，其〇抗原合成相关基因簇的基因有所差别。大肠杆菌0抗原合成相关基因簇主要编码0抗原合成、翻转及 运输相关蛋白，包括糖基转移酶、乙酰基转移酶、多糖聚合酶及翻转酶14]。因此，大肠杆菌0抗原合成 相关基因簇可以作为血清型的诊断靶标。众多研究 者通过解析不同血清型大肠杆菌的0抗原基因簇 的序列并建立了 P C R检测方法。Dammika等™利用D N A芯片技术调整盒式P C R与多重P C R结合，用5个毛细管单元同时检测10个目标的多重P C R，检 测产志贺毒素大肠杆菌0157和6个最常见的非0157血清群〇26、〇45、〇103、〇111、〇121和〇1«，该技术还可用于快速检测任何其他多个目标。但该方法成本过 高，需要一系列昂贵的仪器，可能无法完全标准化。还有许多学者对大肠杆菌相关血清型进行了相关 研究[1617]。另外，还有一些方法如D N A微阵列、磁性 微球悬浮列阵法和磁性微球免疫分析法等也已用 于检测大肠杆菌[18。这些方法虽然灵敏度高，但是 成本高，操作复杂，不易临床推广应用。
目前，针对0抗原合成相关基因簇的基因设 计引物鉴定大肠杆菌多种血清型的报道有很多。L i 等131通过对尿道致病性大肠杆菌部分0抗原基因 簇测序分析，建立了可以检测O h O^a h C^O L C^、〇15、〇丨6、〇18、〇21、〇22、〇25、〇75 和 〇83等 14 个 0 抗原的多重P C R方法；Olivier等:12：通过/fb基因座5’端 等位基因特异性聚合酶链式反应，检测并建立了一 种可以检测 O h O h C^C^O h O L O L O b O i C^、〇75和〇157这12种败血症大肠杆菌相关〇抗原的 多重P C R方法，但是不同血清型检测结果的特异性有差别。本实验室前期研究，分析禽致病性大肠杆 菌主要流行血清型
和078的0抗原合成 相关抗原决定族，建立了 4种血清型的多重P C R检 测方法，能够快速有效区分禽致病性大肠杆菌的流 行血清型，并具有较高的特异性和敏感性〜。
本研究通过08、09血清型大肠杆菌0抗原基 因族比对分析，选择O a血清型大肠杆菌0抗原A B C 转运蛋白通透酶编码基因w z m基因及09血清型大 肠杆菌0抗原A B C转运蛋白A T P结合蛋白编码 基因vvzt基因作为靶标，设计特异性引物，通过条件 优化，确定了最佳的P C R反应体系和反应参数，建 立了大肠杆菌08、09血清型双重P C R检测方法。对 实验室保存的阳性菌株进行检测，均可扩增到特异 性条带，而其他细菌标准株等对照样品均没有扩增 到条带，表明该检测方法具有较好的特异性；灵敏 性检测表明，08血清型大肠杆菌基因组D N A的最 低灵敏度检测可达到10 pg/M L，表明该方法具有较 高的灵敏性，一定程度上提髙了检测的准确性。采用玻板凝集方法进行血清型鉴定，08、09血清型大 肠杆菌均能够与相应的单因子血清发生凝集反应，与双重P C R方法结果一致，但双重P C R方法大大 缩短了检测需要的时间及操作步骤，既省时又省力，表明该方法具有快速、敏感、特异和操作简单的特 点，能较好的弥补传统大肠杆菌血清型检测方法上 的不足。与上述D N A芯片技术、D N A微阵列方法相 比，成本低，操作简单；与上述多重P C R相比，其灵 敏度检测限相对较低，具有较高的特异性。雅思在线
本研究建立的双重P C R方法能快速鉴定08和〇9血清型大肠杆菌，可作为大肠杆菌传统血清学分 型的替代方法，为养殖场、动物产品等样品中大肠 杆菌的监测与实验室诊断提供了简便快速的方法，
具有广阔的市场前景和较大的经济效益。单身贵族英文
