Science and Technology &Innovation ┃科技与创新
2018年第13期
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文章编号：2095－6835（2018）13－0045－03
甜叶菊三个UDP-糖基转移酶基因生物信息学分析
孙宇蛟，陈欣，李悦，徐慧莹，董源，王左，康雨琦
（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）
摘要：甜叶菊（Stevia rebaudian ）是富含甜菊苷类物质的多年生菊科草本植物，其叶片中含一类天然甜味剂——甜菊醇糖苷（steviol glycosides ，SGs ）。在其合成的过程中，尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶（UDP-glycosyl transfera ，UGT ）催化糖基从供体分子转移到受体分子上，参与糖苷转运代谢，达到提高甜叶菊甜度的目的。为了在甜叶菊中更为深入地研究尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶的结构和理化性质，改良甜叶菊品质，以甜叶菊3个主要UGT 基因UGT76G1（AY345974）
、UGT85C2（AY345978）、UGT91D1（AY345980）为研究对象，对其蛋白质进行生物信息学预测分析和进化树的构建。结果表明，3个UGT 蛋白质初级结构理化性质较为相似，均为亲水性蛋白，且结构中含较多的α螺旋和无规则卷曲，但三级结构具有一定的差异。进化树及多序列比对结果表明，甜叶菊3个UGT 基因同源性不高，但与康乃馨等其他作物中UGT 基因有一定的进化关系。研究为进一步探究甜叶菊UGT 基因及蛋白质的功能奠定了基础。
关键词：尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶（UGT ）；甜叶菊；生物信息学分析；理化性质中图分类号：S566.9
文献标识码：A
DOI ：10.15913/jki.kjycx.2018.13.045
甜叶菊是一种含糖量很高的作物，叶片中的甜菊醇糖苷（steviol glycosides ，SGs ）是一种天然的甜味剂，其甜度是蔗糖的300倍左右，但热量只有蔗糖的1/3000[1]，因此，甜叶菊深受糖尿病、肥胖症等相关疾病患者的关注。近些年来，甜叶菊被大规模运用到食品、医药等相关领域。它作为一种新型的食材和药材，在国内外均广受关注。有研究表明，作为甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键酶，尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶（UDP-glycosyltransfera ，UGT ）通常以甜菊醇为前体，合成不同的甜菊醇糖苷，对甜叶菊甜度和品质的提高有关键作用。
UGT 基因种类多样，在许多经济和模式作物中均有研究。Brazier 等人通过T-DNA 插入手段，获得了拟南芥T3代UGT72B1基因敲除株，发现ugt72b1植株（At4g01070）对3，4-二氯苯胺（3，4-dichloroaniline ，DCA ）和2，4，5-三氯苯酚（2，4，5-trichlorophenol ，TCP ）的结合能力显著下降，证明了UGT 基因在植物体内的脱毒作用[2]；Jackon 等人通过对拟南芥UGT84B1基因过表达植株的研究，发现其具生长激素缺陷的现象，推测该基因可能参与植物激素平衡[3]；Chong 等人通过抑制糖基转移酶TOGT 基因在烟草中的表达，发现在其植株中出现组织坏死、抗性降低等表型。推测该基因可能与植物防御相关[4]。
在世界范围内，多数学者对甜叶菊糖苷转运代谢、合成及其功能进行了研究，但在基因及蛋白质层面对甜叶菊尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶的研究却不多。本研究依托于生物信
息学分析，以甜叶菊3个UGT 基因为研究对象，对其蛋白质进行了理化性质分析、初级及高级结构的预测、多序列比对分析，并与康乃馨、陆地棉等其他物种的UGT 基因一同构建了分子进化树，以期为甜叶菊作物UGT 蛋白质研究及分子辅助育种提供参考及依据。1材料与方法1.1数据来源
甜叶菊3个尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶基因UGT76G1（AY345974）、UGT85C2（AY345978）、UGT91D1（AY345980）及其他物种UDT 基因均来源于NCBI （bi.v/）。
1.2UGT 基因各级结构的分析
采用在线软件ProtParam （pasy/protparam/）预测UGT 蛋白序列的一级结构，通过ProtScale 在线工具（pasy/protscale/）分析蛋白质的亲疏水性，利用SOPMA 在线软件（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/cpred_sopma.pl ）预测UGT 蛋白序列的二级结构，采用SWISS-MODEL 软件（pasy/）预测蛋白质的三级结构。1.3多序列比对及分子进化树的构建
get on the floor
通过Clustal X2和DNAMAN 进行多序列比对分析，采用MEGA 7.0软件对所有蛋白质编码序列进行分子进化树的构建，采用邻接法（Neighbor-jioning ，NJ ）建树，其中，校正值（bootstrap ）设置为1000，其他均为默认值。
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科技与创新┃Science and Technology&Innovation ·46·2018年第13期
2结果与分析
2.1UGT基因一级结构分析
UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1对应蛋白序列通过pasy/protparam/进行分子量、等电点、氨基酸数量、带正负点的残基总数、分子式、不稳定指数和脂肪酸指数预测，相关结果
如表1所示。经分析，从表1中可以看出，等电点集中于6左右，氨基酸数量为520～550个不等，不稳定指数集中于45左右，脂肪族指数为100左右。
2.2UGT蛋白质的亲疏水性预测
通过pasy/protparam/预测所有蛋白质亲疏水性（GRAVY）。UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1对应的GRAVY值分别为－0.089，－0.077，－0.104，这初步说明3个蛋白质呈一定的亲水性；通过pasy/protscale/网站，采用Hphob./Kyte&Doolittle算法进一步进行亲疏水性预测，图1进一步认证了其均为亲水性蛋白质。
表1UGT基因一级结构分析
基因名UGT85C2UGT76G1UGT91D1分子量（Da）58778.0360476.8261965.41等电点 6.24 6.28 6.09
氨基酸数量520531549
带负电残基总数586463
带正电残基总数505955分子式
C2666H4130
N690O750S29
C2740H4297
N721O781S20
apply to物理公式C2804H4354
N734O799S26不稳定指数48.1045.5843.30
tiger是什么意思
脂肪族指数91.2997.7892.84
图1UGT蛋白质亲疏水性预测
2.3UGT蛋白二级结构预测juanes
利用SOPMA在线软件（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ cpred_sopma.pl）预测UGT蛋白序列的二级结构。经过分析，从表2和图2中可以看出，各UGT蛋白含有35%～45%左右的α-螺旋及无规卷曲，含有15%左右的链延伸结构，较少的β-转角。其中，UCT85C2、UCT76G1这2个蛋白除了含有较相近
的β-转角外，其余相似度高。
表2UGT蛋白序列二级结构
route基因名α-螺旋β-转角
链延伸
结构
无规则
卷曲
序列长
度UGT76G145.20% 5.84%15.25%33.71%531 UGT85C242.31% 6.92%15.00%35.77%520 UGT91D135.70% 5.83%17.49%40.98%549
图2UGT蛋白二级结构预测
2.4UGT蛋白质高级结构预测
通过SWISS-MODEL预测所得序列蛋白质高级结构，3条序列均通过同源建模获得结构预测。从图3中可以看出，3个UGT蛋白结构均有所差异，推测可能是基因在进化过程中内含子插入或丢失造成的。
2.5多序列比对分析
将甜叶菊中3个UDT基因序列通过Clustal X2及DNAMAN进行多序列比对分析，序列的总体相似度为42.60%.从图4中可以看出，完全一致的序列占较小部分，序列间总体相似度不高，由此推测其在进化过程中存在一定的差异。
2.6分子进化树的构建
bing翻译
将甜叶菊（Stevia rebaudian）、陆地棉（Gossypium hirsutum）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、棉豆（Phaolus lunatus）和烟草（Nicotiana tabacum L.）中已报道的UGT基因通过MEGA7.0软件进行分子进化树的构建。从图5中可
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以看出，各分支自展值均大于80，说明建树信息可靠。除此之外，对于同一物种，甜叶菊中的3个UGT 基因进化关系比较远；对于不同物种来说，甜叶菊AY345974基因与康乃馨BAD52007基因具有一定的亲缘关系。总体可以看出，不同物种与同一物种间UGT 基因均存在一定的进化关系。
图3UGT 蛋白质高级结构预测
图4甜叶菊3个UGT 基因序列比对
图5分子进化树的构建
3讨论
本研究通过生物信息学手段对甜叶菊3个UGT 蛋白质进行了一级结构亲疏水性分析，二级结构、高级结构的预测，多序列比对和系统进化树的构建。在亲疏水性方面，甜叶菊中UGT 蛋白质均为可溶蛋白质，呈较强的亲水性。
向丽等人用5’-RACE 和RT-PCR 方法克隆了1条三七UDP-糖基转移酶基因，该基因编码495个氨基酸，蛋白分子量为55kD ，属于不稳定蛋白。其二级结构中α-螺旋占36.16%，β-转角占11.31%，无规
卷曲占52.53%，这与本研究中甜叶菊3个UGT 基因二级的预测较为相符[5]。除此之外，郭书巧等人在甜叶菊中分离出与本研究同源性很高的UGT76G2基因，研究发现其与玉米、康乃馨、水稻等5种均存在一定的进化关系，但进化地位相差较远，与本研究的进化树结果较为相符[6]
。
UGT 基因为多拷贝、多家族基因，家族中基因数目比较多，功能不尽相同。近年来，多种UGT 基因被渐渐发掘，例如李微微等人在甜叶悬钩子中克隆了18条UDP-糖基转移酶基因，在大肠杆菌中进行了异源表达，并对克隆的基因进行了初步的序列分析，为进一步挖掘和验证甜叶悬钩子中UGT 基因功能奠定了基础[7]。随着生命科学和微机科学的迅速发展，生物信息学作为一门独立学科，在发掘新基因、研究生物大分子功能方面发挥着重要作用[8]。本研究依托生物信息学手段，在甜叶菊作物中鉴定3个UDP-糖基转移酶基因，并对其进行蛋白质功能的初步研究，为甜叶菊UGT 基因的发掘、提高作物经济效益方面的研究提供了新的思路。参考文献：
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reduces
scopoletin
glucoside
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克隆和生物信息学分析［J ］.药学学报，2012，47（08）：1085-1091.
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中国新通信，2018，20（02）：171.————————
作者简介：孙宇蛟（1997—）
，女，生物工程专业。陈欣（1995—），男，生物工程专业。李悦（1999—），女，生物科学专业。徐慧莹（1997—），女，生物科学专业。董源（1997—），女，生物科学专业。王左（1998—），男，生物工程专业。康雨琦（1999—），女，生物工程专业。
〔编辑：白洁〕
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