铁细菌的快速检测试剂瓶的研制
1前言
铁细菌在含铁的淡水中分布广泛，好气，嗜中性环境。由于它能氧化溶解于水中的氢氧化亚铁，碳酸铁成高铁形式沉积下来，起到浓缩和积累环境中铁的作用，是天然褐铁矿的参与者。另外，由于这类菌能使水中亚铁化合物氧化成红棕色粘性物(Fe2O3·xH2O)，从而在铁管中形成软泥它也是危害水系统最重要的微生物之一[1,2]。在工业用水中，如果铁细菌大量滋生，将产生大量覆盖在金属表面上的氢氧化铁鞘层。这不仅降低了热传导效率，而且会造成金属管道的管径缩小或堵塞，降低水流量，使水质变差，同时造成电腐蚀并为硫酸盐还原菌提供极为有利的生长条件。因此铁细菌是循环冷却水中的一种必检菌[3]。在油田注水开发中，由于其注水的温度和环境均适合铁细菌的生长繁殖。而该菌类的大量生长和繁殖又会造成注水管线、注水设备的腐蚀及堵塞。同时腐蚀产物、菌体及其代谢产物还会堵塞地层、降低地层渗透率、增加注水压力，对油田开发极为不利
世界上许多产油国都投入了相当的资金和技术 ,致力于铁细菌的研究。目前，铁细菌的快速
检测方法包括：测试瓶绝迹稀释法，镜检法，MPN法，荧光检测法等。其中，测试瓶绝迹稀释法是目前国内外最为常用的测定方法。铁细菌的检测方法通常是采用中石化总公司生产部、发展部编制的《冷却水分析和试验方法》中的208与GB/T 14643.6—93。两法大同小异,均是采用试管稀释法，操作繁琐、费时[4,5,6]。因此，如何快速准确地测定出铁细菌含量，以便适时采取措施，有效地控制其生长和繁殖、避免或减少铁细菌的危害,对油田生产具有非常重要的现实意义。
1.1 大小写铁细菌作用的机理
留美签证铁细菌是一种好气异养菌，在含气量小于0.5 mg/L 的系统中也能生长。铁细菌的生长需要铁。但对铁浓度的要求并不高和苛刻 ,在生长需要铁 ,但对铁浓度的要求并不高和苛刻 ，该菌以有机物为营养源 ,其生长需要有机物 ,偏爱铁与锰的有机化合物. 这类有机物被利用后 ,铁和锰被作为废物排出 ,附着于细菌的丝状体上. 铁细菌是好氧菌 ,在静止水中 ,完全缺铁的深层是很难生长和繁殖的，在流动的水中有一定的溶解氧 ,铁细菌仍能生长。凡是具有以下生理特征的为典型的铁细菌 , 即:能在氧化亚铁成高价化合物中起催化作用;可以利用铁氧化中释放出来的能量满足其生命的需要;能大量分泌氢氧化铁成基定形结构. 铁细菌偏好铁质
较多的酸环境 ,以碳酸盐为碳源: 4FeCO3 +O2 +6H2O→4Fe(OH)3 +4CO2 +能量[7]，反应产生能量和高铁维持其能量代谢. 不溶性，Fe(OH)3经菌体排出后,形成大量棕色粘泥.铁细菌在酸性环境中对其发育有利 英语阅读能力的培养碱性水中不适宜铁细菌生长circle of friends,其适宜的pH值为6～8,所需温度偏低,最适菌生长,其适宜的pH每日英语学习网站值为6～8。
1.2 铁细菌的快速检测方法
1.2.1 测试瓶绝迹稀释法
目前,测定水中铁细菌含量的方法有很多种,其中,测试瓶绝迹稀释法是目前国内外最为常用的测定方法。它被认为是目前测定方法中既简单方便又比较准确可靠的方法[8,9]。其原理是将欲测定的水样用一次性使用无菌注射器逐级注入到测试瓶中进行接种稀释,放入恒温培养箱中培养。根据细菌瓶阳性反应和稀释的倍数，计算水样中细菌的数目。具体做法是将欲测定的水样用一次性使用无菌注射器逐级注入到测试瓶中进行接种稀释后,将其放入恒温培养箱中,touristy培养温度控制在现场水温的±5℃，铁细菌培养7d后读数。如果铁细菌测试瓶中液体出现棕红色沉淀,即表示有铁细菌。其菌量依据中国石油天然气总公司行业标准SY/T5329—94计量[10,11]。
1.2.2 培养-镜检法
其基本原理为将经过短期培养的铁细菌进行染色,并依据其在生物显微镜下的特定形状、形态即可进行快速测定。铁细菌呈螺旋杆状、球状或杆状到椭圆状。待测水样中的铁细菌在测试瓶中经短期培养后,铁细菌的数量会大大增加。这时即可取出测试瓶中的培养液进行简单的染色镜检观察,而勿需等待培养液出现棕红色沉淀,从而可达到快速准确测定铁细菌量的目的。根据上述培养—镜检法的基本原理，在大量试验研究工作的基础上，选择了草酸铵—topeka结晶紫作为铁细菌的染色剂,培养温度控制在现场水温±5℃内,金钱关系测定铁细菌所需时间仅为1天[12,13]。
1.2.3 荧光原位杂交法
荧光原位杂交技术( fluorescencein situhybridization，FISH)的原理是根据已
知微生物不同分类级别上种群特异的DNA或RNA分子序列，利用荧光标记的特异寡核普酸片段作为探针，依据碱基互补原理，与待测微生物基因组中DNA或RNAoptimal分子杂交，在一定激发波长的荧光显微镜下观察，对待测微生物种群进行定性、相对定量分析。
荧光原位杂交技术作为一种在医学方面已经较为成熟的技术已经越来越多的应用到了环境微生物学当中。荧光原位杂交技术不依赖于对铁细菌微生物进行培养，而直接以铁细菌rRNA中高度保守、具有物种特异性的片断序列作为鉴别的标志[14]。设计和选择特异性探针以及荧光标记物质,通过探针与目标铁细菌的rRNA特异性片断进行杂交反应使目标铁细菌特异性地带有荧光标记。利用显微观察和计数技术,快速、直观、准确地检测目标铁细菌在水样中的存在、数量和分布.利用多种特异性探针来解析环境样品中铁细菌的群落结构和生物多样性。了解环境中优势铁细菌的种类、数量和分布，从而可以根据对优势铁细菌的种群的作用来促进、抑制和调控环境中其他微生物群落，达到指导生产的目的[15]。
目前，清华大学吴晓磊、屈睿、晏芸几人发明了涉及铁氧化细菌（Iron bacteria, IB）检测的组合基因探针及其检测方法。该组合基因探针由IB中的４个基因序列的两种或两种以上组合而成，该检测方法为取水样品，用异多醛溶液固定该水样品中的微生物细胞；滴入载玻片中，进行干燥、脱水后加入所述的组合基因探针溶液，再加入Nacl和甲酰胺的杂交溶液；杂交后，用磷酸盐缓冲溶液清洗该载玻片上的探针溶液，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品，后干燥；用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的IB苏州高新区培训中心细胞进
行计数。本发明能够对油田回注水中IB快速、全面、精确、便捷地检测，可以实现对采油过程及时、准确的调控。
1.2.4 MPN法
1915年，McCrady首次发表了用MPN法(最大可能数法)来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法[16]。目前，我国仍普遍将MPN法用于大肠菌群，大肠杆菌等微生物的检测，该法对实验室的微生物检测及食品工业和环境微生物的控制都有着重要的指导作用。
