高分辨熔解曲线分析技术
sinfor高分辨熔解曲线分析技术，high resolution melting，简称HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。
HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
实验前准备port什么意思
mbp在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler® 480 Control Kit和High Resolution Melting Master等。High Resolution Melting Master中含有2× Master Mix(包含热启动Taq DNA Polymera
反应缓冲液，dNTP mix，高分辨率染料),25mM MgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。
本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP 盒装吸头、冰盒，罗氏的LightCycler® 480，还有常规的离心机、水浴锅等。
HRM 体系配制
实验中用到的HRM试剂盒需要对MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA样品为例展开实验。
先加入1号管的2× Master Mix 165μl，再加入9号管的primer mix 33μl，最后加8号管的mutation突变体33μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。
2014年湖北高考录取分数线分装好做mutation样品的Mg2+浓度，以第1第2管来演示配制3.3倍体积加样。在1管中加入4μl MgCl2，再加入16μl水。同样地，在2管中加入5.3μl MgCl2
和14.5μl水，其他管按照对应的体积配制即可。同时根据说明书配制好WT野
生型和Het杂合子的样品。注意在配制过程中要吹打混匀。
配制好反应体系后，各吸取20μl于96孔板中，设置3个重复。上样完毕，盖上盖板膜，确保其密封性。将96孔板放入LightCycler® 480进行HRM的QPCR 实验。
stepbystep
程序设置
打电话的英文怎么写
打开软件，在New Experiment界面下进行反应条件设定。样品体积为20μl，预变性95°C 5min，无需采集荧光。在扩增反应中，设置45个Cycles，变性95°C 10s，退火65°C 10s，延伸72°C 20s并收集荧光。设置溶解曲线，各参数如屏幕所示。设置完毕后，即可点击保存，并开始PCR反应。
样品编辑
点击Sample Editor进入样品编辑，选择Scanning模式。选中相同的样品孔，设置名称和类型，点击Make Replicates设为复孔。按照此方法根据实际情况编辑好样品，并将本次实验的所有样品孔收编为一个子集，方便后续操作。
透明度结果分析
选择Gene Scanning，Subt选择需要分析的子集，按确认，进入HRM数据分析界面。在Negatives界面中曲线表示出了阴性样品的所在，通常不需要在这界面操作。在Normalization界面中，进行均一化处理熔解前和熔解后的曲线。根据实验的具体情况设定Pre-melt Slider和Post-melt Slider的温度范围，控制在1°C的范围内。在下方窗口可见经过处理后的曲线，在Temperature Shift界面中，横向均一化曲线。设定Threshold的值在0-5%的范围内，即可达到理想效果。在Difference Plot界面下点击Calculate，即可得到HRM分型的结果。软件会根据标准品的曲线形状，将待测样品的分型结果自动归到相应的基因型中，用不同颜色标记。
contrasted通过分型图，可以得出：3.0mM的MgCl2是该实验的最佳Mg2+浓度，并且可得到很好的分析效果。
疑问解答
实验做完了，现在进入疑难解答时间
Doctor A，我们能用SYBR Green染料来进行HRM实验吗？
Miss Q，答案明显是不能的。采用饱和的荧光染料是进行HRM 分析的必备条件之一。本次mix中所含有的高分辨染料在PCR 时以饱和的浓度加入，不会抑制PCR 反应。在进行HRM 分析时，由于饱和染料占据了DNA 双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化。饱和染料在DNA解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。而传统的荧光染料Sybr Green是非饱和染料，浓度过高会抑制PCR 反应且容易出现假阴性，特异性下降等情况。非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。使用非饱和性染料只能区分片段大小和GC含量差异较显著的序列。所以SYBR Green不适合用来做高分辨率的HRM实验。
DoctorA，染料法所固有的缺陷，那么我们该怎样优化HRM的实验质量呢？条款英文
Miss Q，这问题很好。染料法无法区分非特异性产物和引物二聚体的问题，我们可以通过引物，模板，Mg2+浓度等方面来优化HRM实验。
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对于引物设计，要保证退火温度在60℃左右，扩增片段长度小于250bp，最好是在100-150bp这个范围内。建议使用专门的引物设计软件并使用高纯度的引物。
模板的上样浓度在5-30ng/20ul为佳，这样可以保证扩增曲线的Cq值在30个循环前。确保所有样品的核酸提取方法是一样的，建议在上样前用吸光度测一下样品核酸浓度，调整模板浓度使它们的起始浓度相同。
Mg2+对浓度PCR的优化起着至关重要的作用，从上述的实验结果中我们可以看到，当Mg2+浓度过低时，PCR起跳会很晚。Mg2+浓度很高时，这个产物的扩增曲线的平台期较低。综合看来，3.0mM是这个实验最佳的Mg2+浓度。
