(10)申请公布号 CN 101738473 A
(43)申请公布日 2010.06.16C N 101738473 A
*CN101738473A*
(21)申请号 200810160026.7
(22)申请日 2008.11.13
G01N 33/571(2006.01)
(71)申请人威海威高生物科技有限公司
地址264200 山东省威海市高技区世昌大道
312号
在线中文翻译成英文(72)发明人蒙红胜 贾向阳 贾毅 周雷
赵海英
china on four wheels
(74)专利代理机构威海科星专利事务所 37202
代理人梁翠荣
(54)发明名称
梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法
(57)摘要
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及了
一种化学发光法梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其
制备方法。试剂盒由测抗-TP 反应板、测抗-TP
酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照
和阳性对照组成，本发明还公开了该诊断试剂盒
的制备方法，其采用的是化学反光免疫分析技术，
比ELISA 具有更高的灵敏度和特异性，适合于临
床梅毒的辅助诊断和献血员筛查，
填补了国内化学发光法检测梅毒螺旋体抗体诊断试剂生产的空
白。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 6 页
CN 101738473 A 1/1页
1.一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒，其包括测抗-TP 反应板、测抗-TP 酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照和阳性对照，其特征是：所述测抗-TP 反应板为48孔或96孔，载有梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47；测抗-TP 酶结合物1瓶，含有重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成的酶标记物；化学发光底物液2瓶，其是化学发光底物液A 液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl 、
2.0g/L 鲁米诺、0.5g/L 四苯硼钠，化学发光底物液B 液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl 、1.0ml/LH 2O 2；浓缩洗液1瓶，其配方为磷酸氢二钠28.6g/L 、磷酸二氢钠
3.9g/L 、氯化钠160.0g/L 、Tween-2010.0ml/L ；阴性对照和阳性对照各1瓶，阴性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合；阳性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合。
2.一种权利要求1所述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：其包括下述步骤：
(1)测抗-TP 反应板的制备按包被浓度为：TP15(1∶4000)和TP47(1∶5000)，将梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47用0.05mol/L pH9.6的碳酸缓冲液进行稀释，测抗-TP 反应板为48孔或96孔，每孔加入100μl ，置于2-8℃孵育18-24小时，洗板1次后每孔加入150μl 封闭液，于2-8℃孵育18-24小时，吸干封闭液后置相对湿度≤30％的环境干燥5小时，铝箔袋密封包装，2-8℃保存；
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(2)测抗-Tp 酶结合物的制备重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成酶标记物，反应体系为：用5mg/ml 的HRP 溶液1ml 与0.2ml 的0.1M NaIO 4溶液混匀4℃避光1小时，加入0.2ml 的乙二醇摇匀室温避光1小时，4℃透析过夜，用0.2ml 0.2M pH9.6的CB 将透析后的醛化HRP 溶液调pH 值为9.2-9.5，按醛化HRP ∶抗原质量比为1∶2的最适比例，将溶于0.01M pH9.6的碳酸缓冲液中的抗原立即加入上述醛化HRP 中于37℃反应1小时，加入0.1ml NaBH 4溶液(3.5毫克/毫升)，混匀于4℃放置2小时，用凝胶过滤层析进行纯化，得到辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47；用稀释液将辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47稀释到工作浓度HRP-TP15(1∶5000)、HRP-TP47(1∶6000)；
(3)化学发光底物液的制备化学发光底物液A 液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl 、2.0g/L 鲁米诺、0.5g/L 四苯硼钠，化学发光底物液B 液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl 、1.0ml/LH 2O 2；
(4)其他组分的制备①浓缩洗液的配方为磷酸氢二钠28.6g/L 、磷酸二氢钠3.9g/L 、氯化钠160.0g/L 、Tween-2010.0ml/L ；②阴性对照：选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合，经60℃处理1小时，除菌过滤保存于2-8℃；③阳性对照：选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合，经60℃处理1小时后，除菌过滤保存于2-8℃。
3.根据权利要求2所述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：所说的封闭液的配方为磷酸二氢钠0.39g/L 、磷酸氢二钠2.68g/L 、氯化钠8.50g/L 、蔗糖40.0g/L 、牛血清白蛋白10.0g/L 、硫柳汞1.0g/L 。
4.根据权利要求2所述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：所说的测抗-Tp 酶结合物稀释液的配方为磷酸二氢钠0.39g/L 、磷酸氢二钠2.68g/L 、氯化钠1
5.0g/L 、小牛血清100ml/L 、硫柳汞1.0g/L 。
权 利 要 求 书
梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种免疫诊断技术，具体地说是一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 我们知道，梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)引起的一种慢性系统性传染病，是经典的性病之一，性接触传染占95％，梅毒与结核、麻风并列为世界三大慢性传染病，目前在我国属十大传染病之一。本病临床表现复杂，病程较长，几乎可以侵犯全身各组织和器官。我国于1959年已经基本消除了梅毒，但是自70年代以来、改革开放以后，随着社会的发展、与国外交流的增多，性病又在我国死而复生，特别是梅毒发病人数大大增加，发病人数急剧上升，虽然我国政府采取
了大量措施控制梅毒的流行，但最近几年发病率增长的势头仍未减缓，梅毒的发展在我国已经不能再轻视了。梅毒在其他国家也在泛滥，根据世界卫生组织(WHO)的资料，在1999年全球估计有1200万成人梅毒感染者，其中90％的是在发展中国家，但在最近几年美国和西欧国家梅毒感染人数也在不断增加。[0003] 至今人们对该病原体的了解是非常有限的，仍未了解梅毒螺旋体的致病机理，还没有研制成功可以预防梅毒的疫苗，只有远离传染源才能有效避免感染梅毒。梅毒只有早期进行诊断，才能在早期进行治疗并且彻底治疗，否则将会传染给他人和使自身病情加重、影响身体健康和传给后代。因此有必要开发出一种性能较好的诊断方法，能有效地在早期就将该疾病诊断出来，及时治疗，减少因梅毒带来的健康和财产的损失。
[0004] 目前诊断梅毒的实验室方法技术主要包括非梅毒螺旋体抗原血清试验(如性病研究实验室玻片试验、快速血浆反应素试验、梅毒甲苯胺红不加热血清反应素玻片试验)和梅毒螺旋体抗原血清试验(如荧光梅毒螺旋抗体吸收试验、梅毒螺旋体血凝试验、梅毒螺旋体明胶凝集试验)，这些方法都不是最令人满意的，另外检测梅毒螺旋体特异性抗体的还有酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金法，ELISA检测梅毒抗体的方法已得到了大量的推广，该方法具有很多优点，但在检测的灵敏度方面还有待进一步提高。化学发光免疫分析在酶免疫分析基础上结合了化学发光技术使得检测的灵敏度和特异性得到大幅度提高，它是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项免疫分析技术，根据大量的实验结果以及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及其发展前景来看，在非放射性标记分析技术
中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界的发展方向和潮流，它不仅有免疫反应的特异性，而且有化学发光反应的高灵敏性。化学发光免疫分析技术具有高灵敏度、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射性免疫分析和酶免疫分析的首选。但是目前国内尚无生产用于梅毒螺旋体抗体检测的化学发光法诊断试剂，目前急需灵敏度和特异性较高的化学发光诊断试剂，可以作为ELISA试剂和其他试剂的替代品，用于梅毒的诊断。
发明内容
interim
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种具有高灵敏度和特异性，适合于临床梅毒螺旋体的辅助诊断和献血员筛查的化学发光法梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒，其包括测抗-TP反应板、测抗-TP酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照和阳性对照，其特征是：所述测抗-TP反应板为48孔或96孔，载有梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47；测抗-TP酶结合物1瓶，含有重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成的酶标记物；化学发光底物液2瓶，其是化学发光底物液A液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、2.0g/L鲁米诺、0.5g/L四苯硼钠，化学发光底物液B液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、1.0ml/
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LH
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两个感恩节的绅士2
；浓缩洗液1瓶，其配方为磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/L、氯化钠160.0g/L、
Tween-2010.0ml/L；阴性对照和阳性对照各1瓶，阴性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为
阴性的正常人血清混合；阳性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合。[0007] 本发明还提供了上述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：其包括下述步骤：
[0008] (1)测抗-TP反应板的制备将梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47用0.05mol/ L pH9.6的碳酸缓冲液进行稀释，稀释后的包被浓度为TP15(1∶4000)和TP47(1∶5000)，测抗-TP反应板为48孔或96孔，每孔加入100μl，置于2-8℃孵育18-24小时，洗板1次后每孔加入150μl封闭液，于2-8℃孵育18-24小时，吸干封闭液后置相对湿度≤30％的环境干燥5小时，铝箔袋密封包装，2-8℃保存；
[0009] (2)测抗-Tp酶结合物的制备重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成酶标记物，反应体系为：用5mg/ml的HRP溶液1ml与0.2ml的0.1M NaIO
4
溶液混匀4℃避光1小时，加入0.2ml的乙二醇摇匀室温避光1小时，4℃透析过夜，用0.2ml 0.2M pH9.6的CB将透析后的醛化HRP溶液调pH值为9.2-9.5，按醛化HRP：抗原质量比为1∶2的最适比例，将溶于0.01M pH9.6的碳酸缓冲液中的抗原立即加入上述醛化HRP中于37℃
反应1小时，加入0.1ml NaBH
4
溶液(3.5毫克/毫升)，混匀于4℃放置2小时，用凝胶过滤层析进行纯化，得到辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47；用稀释液将辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47稀释到工作浓度HRP-TP15(1∶5000)、HRP-TP47(1∶6000)；[0010] (3)化学发光底物液的制备化学发光底物液A液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、2.0g/L鲁
英文歌曲歌词米诺、0.5g/L四苯硼钠，化学发光底物液B液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、1.0ml/LH
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[0011] (4)其他组分的制备①浓缩洗液的配方为磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/ L、氯化钠160.0g/L、Tween-2010.0ml/L；②阴性对照：选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合，经60℃处理1小时，除菌过滤保存于2-8℃；③阳性对照：选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合，经60℃处理1小时后，除菌过滤保存于2-8℃。[0012] 本发明上述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，所述的配置测抗-Tp酶结合物的稀释液的配方为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠15.0g/L、小牛血清100ml/L、硫柳汞1.0g/L。
[0013] 本发明的原理是利用化学反光免疫分析技术，用特异性的梅毒螺旋体重组抗原TP15、TP47包被化学发光板、以辣根过氧化物酶(HRP)标记的相同蛋白作为标记抗原，与样福州新东方英语学校
本中的抗梅毒螺旋体抗体形成双抗原夹心复合物(包被抗原-抗梅毒螺旋体抗体-标记抗原)，标记抗原上的HRP 催化化学发光底物产生光子，通过化学发光分析仪检测相对发光单位，发光值的高低与样本中抗梅毒螺旋体抗体的含量成正比，根据临界值可判断样本中是否含有梅毒螺旋体特异性抗体。
[0014] 本发明试剂盒的优点是采用了化学反光免疫分析技术，比ELISA 具有更高的灵敏度和更好的特异性，填补了国内梅毒螺旋体抗体检测的化学发光法诊断试剂生产的空白。具体实施方式
[0015] 本发明试剂盒采用化学发光免疫分析技术，检测血清中是否存在梅毒螺旋体抗体。本实施例具体描述了梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法。一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒，其包括测抗-TP 反应板、测抗-TP 酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照和阳性对照，所述测抗-TP 反应板为48孔或96孔，载有梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47；测抗-TP 酶结合物1瓶，含有重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成酶标记物；化学发光底物液2瓶，其是化学发光底物液A 液：0.2M pH7.8Tris-Hcl 、2.0g/L 鲁米诺、0.5g/L 四苯硼钠，化学发光底物液B 液：0.2M pH7.8Tris-Hcl 、1.0ml/LH 2O 2；浓缩洗液1瓶，其配方为磷酸氢二钠28.6g/L 、磷酸二氢钠
3.9g/L 、氯化钠160.0g/L 、Tween-2010.0ml/L ；阴性对照和阳性对照各1瓶，阴性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合；阳性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合。
[0016] 本发明还提供了上述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其中原材料的选择包括：
[0017] (1)抗原的选择抗原的选择依据是：具有天然抗原的主要免疫活性区、纯度高、效价高、特异性高等。经过详细的市场调查研究，在考察抗原质量的同时也考察了抗原生产、供应单位的资质，最后我们将上海金炬生物科技有限公司提供的梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15和TP 47作为抗原来源，这两种抗原为大肠杆菌表达的基因重组蛋白，包含梅毒螺旋体膜蛋白TpN15、TpN47的主要免疫活性区
gilt域，经纯化而得。首先就该公司提供的蛋白的外观、含量、纯度、分子量、效价进行验证，并将抗原进行辣根过氧化物酶(HRP)的标记，用梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家标准品进行检测，结果抗原溶液外观澄清、无肉眼可见异物、无摇不散的沉淀，纯度较高(均＞95％)，分子量分别为15KDa 和47KDa 左右，并具有较高的效价和很好的活性，特异性和灵敏度较好，研究结果表明上海金炬生物科技有限公司提供的重组抗原完全可用于本发明诊断试剂盒的制备。
[0018]
(2)辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47质量研究首先观察标记物的外观；用
ELISA 法检测效价，方法为将TP15和TP47分别按效价的一半稀释包被酶联反应板，将相应的HRP-TP15和HRP-TP47梯度稀释，按双抗原夹心一步法检测100倍稀释的国家标准品强阳性P10，同时做不含酶结合物的稀释液的对照，以含酶结合物A 值＞不含酶结合物的A 值的最大稀释度为效价；用紫外吸收法测定蛋白质含量，测量A 280nm 和A 260nm ，根据公式计算：蛋白含量(mg/mL)＝1.45A 280nm -0.74A 260nm 。根据上述多次试验研究，本发明制备试剂盒所用HRP-TP15、HRP-TP47抗原的质量标准为外观微带棕色的澄清液体，无异物、浑浊或摇不散的沉淀；HRP-TP15应≥1∶10000，HRP-TP47应≥1∶12000；含量范围应为：1.0-2.0mg/ml 之间。
