湖北大学
硕士学位论文
Toll-like信号途径蛋白质相互作用的研究
姓名：***
阿里巴巴 私有化
申请学位级别：硕士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：***
20070501
摘要
tweak
Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ受体识别病原相关的分子模式，主要在调控天然免疫中发挥作用。在肝脏中Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ受体激活炎症信号通路如ＮＦ—如，ＪＮＫ，ｐ３８和干扰索信号通路，并且起着调控抗病毒、抗细菌应答，病毒感染和伤口愈合的作用。
本文主要针对Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ信号途径相关蛋白筛选人类肝脏ｃＤＮＡ文库所得到的新的蛋白质相互作用进行进一步的验证。这三对待验证的相互作用对为：ＩＲＦ３和ＳＧＴＡ，ＬＢＰ和ＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２和ＴＨ＾Ｐ７。
工作主要包括以下内容：
parated（１）以ｐＣＤＮＡ３．卜ＨｉｓＡ为骨架载体，构建载体Ｍｙｃ－ｇｆｐ和Ｆｌａｇ－ｍａｎ。将编码ＩＲＦ３，ＬＢＰ，Ｐｅｌｌｉｎ０２的基因分别克隆到载体Ｍｙｃ－ｇｆｐ上，并将编码ＳＧＴＡ，ＰＲＤＸ４，ＴＲＹ７的基因克隆到载体Ｆｌａｇ－ｍａｎ。大众翻译
（２）合成超折叠绿色荧光蛋白基因，改造载体ｐＥＧＦＰ－Ｃ１，用超折叠绿色荧光蛋白基因替换
amway
ｐＥｏＦＰ－Ｃｌ上的绿色荧光蛋白基因，完成定位载体ｐＳＦＢＦＰ．Ｃ１的改造。并将编码ＩＲＦ３的基因克隆到载体ｐＳＦＧＦＰ－Ｃｌ上，将编码ＳＧＴＡ的基因克隆到载体ｐＤｓＲｅｄ．Ｃ１。
（３）将编码ＩＲＦ３，ＬＢＰ，Ｐｅｌｌｉｎ０２的基因分别克隆到载体ｐＧＥｘ上，将编码ＳＧＴＡ，ＰＲＤＸ４，ＴＨＡＰ７的基因克隆到载体ｐＥＴ２８ａ上。重组质粒ｐＧＥＸ－ＩＲＦ３和ｐＧＥＸ－ＰｅｌＩｉｎ０２转化ＸＬＩＯ－Ｇｏｌｄ。重组质粒ｐＥＴ＇２８ａ—ＳＧＴＡ，ｐＥＴ２８ａ－ＴＨＡＰ７转化ＢＬ２１（ＤＥ３），分别接种单菌落培养，并在诱导表达后进行纯化。这四种蛋白能有效地进行表达和纯化。
（４）表达质粒Ｍｙｃ－ＩＲＦ３，Ｍｙｃ—Ｐｄｌｍ０２，Ｍｙｃ—ＬＢＰ，Ｈａｇ—ＳＧＴＡ，Ｈａｇ－ＴＨＡＦ７，Ｆｌａｇ－ＰＲＤＸ４分别转染ＨＥＫ２９３细胞，并通过免疫印记检测６种蛋白的表达。免疫印记结果显示这六种蛋白都能在ＨＥＫ２９３细胞中表达。
（５）通过免疫共沉淀验证ＩＲＦ３和ＳＧＴＡ，ＬＢＰ和ＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２和ＴＨＡＰ７的之间的互作，结果显示这三对蛋白都能互作。
（６）ＧＳＴ—ｐｕｌｌｄｏｗｎ验证ＩＲＦ３和ＳＧＴＡ，Ｐｅｌｌｉｎ０２和ＴＨＡＰ７的互作。
（７）利用免疫荧光检测ＬＢＰ和ＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２和ＴＨＡＰ７在细胞中的定位，并将质粒ｐＳＦＧＦＰ．ＩＲＦ３，ｐＤｓＲｅｄ．ＳＧＴＡ共转染Ｈｅｌａ细胞验证在细胞中的定
bowling
位。结果显示ＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２，ＴＨＡＰ７，ｍＦ３，ＳＧＴＡ都定位于细胞质中，而ＬＢＰ定位于细胞质或细胞膜上。雅思口语技巧
关键词：Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受体；免疫共沉淀；蛋白质相互作用；超折叠绿色荧光蛋白
Ⅱ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｔｏｌｌ··ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲｓ）ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｐａｔｈｏｇｅｎ—－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄａｒｅｃｒｕｃｉａｌｌｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｐｒｏｍｏｔｅｐｒｏｉｎｆｉａｍｍａｔｏｒｙｓｉｇｎａｌｉｎｇｓｕｃｈａｓｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－Ｂ，ｃ－Ｊｕｎ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｋｉｎａｓｅ（ＩＮＫ）’ｐ３８，ａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐａｔｈｗａｙｓｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅａｎｔｉｖｋａｌａｎｄａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｈｅｐａｔｉｃｉｎｊｕｒｙａｎｄｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．
Ｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ，ｎｅｗｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎＴｏｌｌ－ｌｉｋｅｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙｗｈｉｃｈｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｌｉｖｅｒｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｗｉｌｌｂｅｆｕｒｔｈｅｒｔｅｓｔｅｄ．Ｆｏｒｄｅｔａｉｌｓ，ｔｈｒｅｅｐａｉｒｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｔｏｂｅｓｔｕｄｉｅｄａｒｅＩＲＦ３ａｎｄＳＧＴＡ，ＬＢＰａｎｄＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２ａｎｄＴＨＡＰ７．
Ｓｅｖｅｒａｌａｓｐｅｃｔｓｍａｉｎｌｙｉｎｃｌｕｄｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙａｒｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：动词的现在分词
（１）Ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｌｄｙｅ—ｇｆＰａｎｄＦｌａｇ－ｍａｎｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｏｒｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎＤＣＤＮＡ３．１－ＨｉｓＡ．ａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｒｅｓｔｅｄｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＩＲＦ３，ＬＢＰａｎｄＰｅｌｌｉｎ０２ｗｅｒｅｃｌｏｎｃｄｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒＭｙｃ—ｇｆｐｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＳＧＴＡ，ＰＲＤＸ４，ＴＨＡＰ７ｗｅｒｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒＦｌａｇ－ｍａｎ。
（２）Ｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，
ｔｈｅｎｐｌａｓｍｉｄｐＳＦＧＦＰ－Ｃ１Ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓｓｕｂ。ｃｌｌｕｌａｒｃｏ·－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｒｅｐｌａｃｉｎｇ啦ｇｅｎｅｏｆｐＥＧＦＰ·Ｃ１ｗｉｔｈｓｆｇ在，ｇｅｎｅ．ＴｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＩＲＦ３ｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐＳＦＧＦＰ－Ｃ１，ｗｈｉｌｅｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＳＧＴＡｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐＤｓＲｅｄ—Ｃ１．
法语考试
dgg（３）ＴｈｅｉｎｔｅｒｅｓｔｅｄｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＩＲＦ３，ＬＢＰａｎｄＰｅｌｌｉｎ０２ｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒｐＧＥＸｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＳＧＴＡ，ＰＲＤＸ４，ＴＨＡＰ７ｗｅｒｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒｐＥＴ２８ａ。ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｐｌａｓｍｉｄｓｐＧＥＸ－ＩＲＦ３ａｎｄｐＧＥＸ—Ｐｅｌｌｉｎ０２ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＸＬＩＯ－Ｇｏｌｄ．ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｐｌａｓｍｉｄｓｐＥＴ２８ａ－ＳＧＴＡａｎｄｐＥＴ２８ａ－ＴＨＡＰ７ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢ１２１（ＤＥ３）。ＴｈｅｓｉｎｇｌｅｃｌｏｎｅＷａｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｃｕｌｔｕｒｅｄ，ａｎｄｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＩＰＴＧｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｔｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅｆｏｕｒｐｒｏｔｅｉｎｓｃａｎｂｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄ．
１ｎ
（４）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓＭｙｃ－ＩＲＦ３，Ｍｙｃ－Ｐｅｌｌｉｎ０２，Ｍｙｃ－ＬＢＰ，Ｆｌａｇ·ＳＧＴＡ，Ｆｌａｇ－ＴＨＡＦ７，Ｈａｇ－ＰＲＤＸ４ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｃｅｌｌｌｉｎｅＨＥＫ２９３ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｓｐｒｏｔｅｉｎｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．
（５）ＴｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓＩＲＦ３ａｎｄＳＧＴＡ，ＬＢＰａｎｄＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２ａｎｄＴＨＡＰ７
ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐａｔｉｏｎ．ＩｔｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＩＲＦ３ａｎｄＳＧＴＡ，ＬＢＰａｎｄＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２ａｎｄＴＨＡＰ７．
（６）Ｔｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓＩＲＦ３ａｎｄＳＧＴＡ，Ｐｅｌｌｉｎ０２ａｎｄＴ卧Ｐ７ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＧＳＴ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ．
ｆ７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＬＢＰａｎｄＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２ａｎｄＴＨＡＰ７ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ
ｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｃｅ，ａｎｄｐｌａｓｍｉｄｓｐＳＦＧＦＰ－ＩＲＦ３ａｎｄｐＤｓＲｅｄ－ＳＧＴＡｗｅｒｅｃｏ－ＵａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｃｅｌｌｌｉｎｅＨｅｌａｆｏｒ
ｔｅｓｔｉｎｇｔｈｅｉｒｓｕｂ－ｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＩｔｓｈｏｗｓｔｈａｔＰＲＤＸ４，Ｐｅｌｌｉｎ０２，ＴＨＡＰ７，ⅡｔＦ３ａｎｄＳＧＴＡｌｏｃａｔｅｉｎｔｈｅＣｙｔｏｐｌａｓｍ，ｗｈｉｌｅｔｈａｔＬＢＰｌｏｃａｔｅｓｉｎｔｈｅＣｙｔｏｐｌａｓｍｏｒｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ
ＩＶ
