细胞与分子生物学
Survivin异常表达对前列腺癌转移及TGF-β/Smad
通路的调节作用
徐子寒1，2，彭云2，董世强2，侯定坤2，王海涛2△
摘要：目的探讨生存素（Survivin）异常表达在前列腺癌（PCa）转移中的作用及机制。方法（1）通过TCGA数据库分析Survivin mRNA在正常前列腺组织和PCa组织中表达差异，分析有无淋巴结转移、Gleason分级以及预后信息。（2）采用免疫组化染色检测15例良性前列腺增生（BPH）活检标本和60例PCa活检标本中Survivin蛋白表达，比较患者不同临床特征间Survivin蛋白表达的差异。（3）常规培养人前列腺增生细胞系BPH和人PCa细胞系LNCaP、Du-145、PC-3，Western blot检测Survivin蛋白表达。利用LNCaP细胞构建Survivin稳定过表达组（Survivin-OE组）和相应对照组（Vector组），同时在PC-3细胞中构建Survivin稳定敲低组（Survivin-KD组）和相应对照组（NC组）。CCK-8增殖实验与Transwell实验检测敲低和过表达Survivin后细胞增殖、侵袭能力的变化。Western blot检测2种细胞中Survivin、上皮间质转化（EMT）特征分子上皮细胞钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin），以及转化生长因子（TGF）-β/Smad通路相关蛋白TGF-β1、磷酸化Smad2/3（pSmad2/3）、Smad2/3、Smad4蛋白表达水平的改变。结果（1）TCGA数据库分析结果显示，Survi
vin在PCa组织中异常高表达，出现淋巴结转移的患者Survivin表达水平高于无淋巴结转移者（P＜0.01）；且随着Gleason分级的升高，Survivin表达水平越高（P＜0.01）；同时Survivin高表达的PCa患者的无进展生存时间明显短于Survivin低表达的患者（P＜0.01）。（2）免疫组织化学证实，PCa标本中Survivin蛋白高表达比例明显高于BPH组织（60.0%vs.26.7%，χ2=5.357，P＜0.05）。且临床分期T3+T4期、局部淋巴结转移和远处转移者Survivin高表达比例明显升高（P＜0.05）。（3）体外实验结果显示，LNCaP、Du-145、PC-3细胞中Survivin表达水平均高于BPH（P＜0.05）。LNCaP细胞过表达Survivin后，细胞增殖和侵袭能力增强，上皮标志物E-cadherin表达下降、间质标志物N-cadherin表达升高，同时TGF-β1、pSmad2/3和Smad4蛋白表达水平增加。而PC-3细胞敲低Survivin 后，细胞增殖和侵袭能力减弱，上皮标志物E-cadherin表达增加、间质标志物N-cadherin表达降低，TGF-β1、pSmad2/3和Smad4蛋白表达水平降低。结论Survivin在PCa中异常高表达，其可以通过调节TGF-β/Smad通路来促进肿瘤细胞EMT，进而提高PCa的转移与侵袭能力。
关键词：前列腺肿瘤；肿瘤转移；转化生长因子β；Smad蛋白质类；钙黏着糖蛋白类；上皮-间质转化；生存素
中图分类号：R737.25文献标志码：A DOI：10.11958/20201912
The regulation role of abnormal expression of Survivin on metastasis and TGF-β/Smad
pathway of prostate cancer
XU Zi-han1,2,PENG Yun2,DONG Shi-qiang2,HOU Ding-kun2,WANG Hai-tao2△1Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin300070,China;2Department of Urology,the Second Hospital of
Tianjin Medical University,Tianjin Institute of Urology
△Corresponding Author E-mail:*********************
Abstract:Objective To investigate the role and mechanism of abnormal expression of Survivin in the metastasis of prostate cancer(PCa).Methods(1)The difference of Survivin mRNA expression between normal prostate tissue and PCa tissue was analyzed by TCGA databa,and the lymph node metastasis,Gleason grade and prognosis were analyzed.(2) Immunohistochemical staining was ud to detect the expression of Survivin protein in15cas of benign prostatic hyperplasia(BPH)biopsies and60cas of PCa biopsies,and the differences of Survivin protein expressions were compared between different clinical features of the patients.(3)The expression levels of Survivin in routine culture of human benign prostatic hyperplasia cell line BPH and human PCa cell lines LNCaP,Du-145and PC-3were detected by Western blot
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81572543）
作者单位：1天津医科大学研究生院（邮编300070）；2天津医科大学第二医院肿瘤科，天津市泌尿外科研究所
作者简介：徐子寒（1993），男，硕士在读，主要从事前列腺癌耐药和转移的相关研究。E-mail：***************
△通信作者E-mail：*********************
前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性第2大常见恶性肿瘤，2018年全球新确诊PCa患者127.6万例，死亡35.9万例［1］。中国男性的PCa发病率也在快速上升［2］。大多数PCa患者在确诊时已经出现远处转移，治疗手段局限于内分泌治疗和放疗。凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）在调控细胞周期和肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用［3］。生存素（Survivin）是IAPs家族中分子质量最小的成员，在结直肠癌［4］、胰腺癌［5］、肝癌［6］等多种肿瘤组织中广泛表达。早期研究发现Survivin在PCa中参与去势抵抗［7-8］，抑制细胞凋亡［9-11］。目前已发现在卵巢癌［12］和肾癌［13］中，Survivin通过促进肿瘤细胞上皮-间质转化（EMT）进程来增加肿瘤的侵袭性。转化生长因子（TGF）-β/Smad作为参与肿瘤细胞EMT 进程的经典通路［14-15］，在乳腺癌［16］、肺癌［17］中发挥促进转移的作用。因此，笔者推测Survivin可通过调节affiner
TGF-β/Smad通路促进肿瘤细胞发生EMT，进而促进PCa的转移。本文旨在阐明Survivin在PCa转移中
所发挥的作用。
、
1材料与方法
1.1主要材料（1）组织标本。选取2018年1月—2019年1
月天津医科大学第二医院和天津市泌尿外科研究所收集的15例良性前列腺增生（BPH）活检标本和60例PCa活检标本，60例PCa中Gleason分级为6、7、8、9+10者各15例。（2）细胞及主要试剂。人前列腺增生上皮细胞株BPH购自天津市泌尿外科研究所，人PCa细胞株LNCaP、Du-145、PC-3均购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。RMPI-1640培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。青/链霉素（100×）、总蛋白提取试剂、PMSF溶液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western blot相关试剂购自北京索莱宝生物技术公司。兔抗人TGF-β1、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（pSmad2/3）、Smad4、GAPDH一抗购自英国Abcam公司。Survivin、上皮细胞钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、羊抗兔二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）试剂盒购自美国罗氏生物科技公司。CCK-8试剂盒购自MCE公司。Transwell小室与基质胶（Matrigel）购自美国Corning公司，SP-9001免疫组化通用试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。
1.2方法
1.2.1生物信息学分析TCGA数据库中Survivin表达登录TCGA数据库（portal.v/），进入Repository 界面，选择文档类型为RNA-q，选择病例类型Prostate Gland，共有496例PCa数据。排除数据库中肿瘤纯度低于0.7的标本、福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）和重复标本
assay.LNCaP cells were ud to construct Survivin stable overexpression group(Survivin-OE)and corresponding control group(Vector).At the same time,Survivin stable knockdown group(Survivin-KD)and corresponding control group(NC) were constructed in PC-3cells.CCK-8proliferation assay and Transwell assay were ud to detect the changes of cell invasion and proliferation after knocking-down and overexpressing Survivin.Western blot assay was ud to detect the expression of Survivin,E-cadherin,N-cadherin and proteins related to TGF-β/Smad pathway such as phosphorylated Smad2/3,TGF-β1and Smad4in two kinds of cells.Results(1)The results of TCGA databa analysis showed that Survivin was abnormally high in prostate adenocarcinoma,and the expression levels of Survivin were higher in patients with lymph node metastasis than tho in patients without lymph node metastasis(P＜0.01).The expression levels of Survivin incread with the increa of Gleason score(P＜0.01),and the progression-free survival time was significantly shor
cet4考试时间ter in PCa patients with high expression of Survivin than that of patients with low expression of Survivin(P＜0.01).(2) Immunohistochemistry confirmed that the high expression ratio of Survivin protein was significantly higher in PCa samples than that in BPH tissues(60.0%vs.26.7%,χ2=5.357,P＜0.05).The proportion of high expression of Survivin was significantly incread in patients with clinical stage T3+T4,local lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0.05).
(3)In vitro experiment results showed that Survivin levels were higher in LNCaP,DU-145and PC-3cells than tho in BPH (P＜0.05).The overexpression of Survivin incread the proliferation and invasion ability in LNCaP cells.The expression of epithelial marker E-cadherin decread,the expression of interstitial marker N-cadherin incread,and the expression levels of pSmad2/3,TGF-β1and Smad4incread after overexpressing Survivin.However,the underexpression of Survivin decread the proliferation and invasion ability in PC-3cells.The expression of epithelial marker E-cadherin incread,the expression of interstitial marker N-cadherin decread and the expression levels of pSmad2/3,TGF-β1and Smad4 decread after knocking-down Survivin.Conclusion Survivin is abnormally highly expresd in prostate adenocarcinoma, which can promote EMT progress to improve tumor metastasis and invasion by regulating TGF-β/Smad pathway in prostate cancer.
Key words:prostatic neoplasms;neoplasm metastasis;transforming growth factor beta;Smad proteins;
cadherins; epithelial-menchymal transition;survivin
后，共收集PCa标本467例，癌旁组织标本52例。利用R程序（www.r-project/）对Survivin在PCa组织与癌旁组织、有无淋巴结转移、不同Gleason分级中的表达情况和预后进行分析。
1.2.2免疫组化染色将石蜡包埋的组织标本切片于65℃孵育2h，二甲苯中脱蜡复水后枸橼酸盐进行抗原修复，
3%H2O2溶液孵育10min以阻断内源性过氧化物酶活性。进一步用Survivin单克隆抗体（1∶2000稀释）4℃孵育过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000稀释），室温放置15min，最后用苏木素与二氨基联苯胺作显色剂进行复染。由3位病理科医生独立对BPH、PCa标本的免疫组化结果进行评分。综合组织染色强度和染色比例进行半定量分析，染色强度评分：0分（无色，无表达）、1分（浅黄色，弱表达）、2分（深黄色，中度表达）、3分（棕褐色，高表达）。阳性肿瘤细胞百分率评分：1分（0~25%）、2分（26%~50%）、3分（51%~ 75%）、4分（76%~100%）。最后用染色强度积分与阳性细胞比例评分的乘积评价阳性程度，根据总得分将组织免疫组化评分，分为低表达（1~4分）和高表达（5~12分）。
1.2.3细胞培养、转染及分组BPH细胞与PCa细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中常规培养，每1～2d更换培养液，待细胞生长至80%～90%时用胰蛋白酶消化传代。
Survivin过表达（NM_ 001168.3）、敲低慢病毒质粒载体购自北京合生基因公司。取对数生长期的LNCaP细胞和PC-3细胞，以1×106个/孔接种于6孔板中，待细胞密度为30%~50%时，LNCaP细胞分别转染Survivin过表达慢病毒（Survivin-OE）组和对照慢病毒（Vector）组；PC-3细胞分别转染Survivin敲低慢病毒（Survivin-KD）组和对照慢病毒（NC）组。Survivin shRNA序列：5'-CACCGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGACGAATCTTGA⁃CAGAAAGGAAAGCGC-3'。NC序列：5'-CACCGGTTCTCC⁃GAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-3'。
1.2.4Western blot检测TGF-β/Smad通路相关蛋白表达水平用细胞总蛋白试剂提取4组细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度后取20μg上样，进行12%SDS-PAGE电泳，分离后电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭，洗膜，加入兔抗人一抗（1∶2000稀释）及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5000稀释），ECL发光显色，以GAPDH蛋白作为内参照，用Image J软件对Survivin、TGF-β/Smad信号通路相关蛋白TGF-β1、pSmad2/3、Smad2/3、Smad4和EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin条带的光密度（OD）值进行分析，相对表达量=目标灰度值/内参灰度值。通过Western blot检测PCa 细胞PC-3转染Survivin敲低慢病毒与LNCaP转染Survivin过表达慢病毒的效率。
1.2.5细胞增殖能力检测采用CCK-8法检测细胞增殖能力。慢病毒转染实验分组同1.2.3，将细胞按照2000个/孔接种至96孔板上，每组设3个复孔；于转染后24、48、72、96h向每孔加入CCK-8试剂各10μL，继续培养2h后在酶标仪上检测450nm处的OD值，并绘制增殖曲线。
1.2.6细胞侵袭能力检测采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。在小室中铺基质胶，用不含血清的RMPI-1640培养
基悬浮细胞，按照PC-3细胞2×104个/mL，LNCaP细胞5×104个/mL接种于上室中，下室中加入500μL完全培养基，继续培养36h后取出。用4%多聚甲醛固定位于下室中的细胞，用苏木素染色后在显微镜下拍照并计数穿膜细胞数。
1.3统计学方法利用GraphPad Prism8软件进行数据分析并绘图。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2样本均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析，两个分类变量的关联性用χ2检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1TCGA数据库中Survivin表达与PCa临床特征及转移的关系TCGA数据库分析结果显示，相较于癌旁组织，PCa组织中Survivin的mRNA水平升高（t=8.840，P＜0.01）。在PCa患者中，出现淋巴结转移的患者Survivin表达水平高于无淋巴结转者（t=
4.725，P＜0.01）；且随着Gleason分级的升高，Survivin表达水平越高（F=4.780，P＜0.01）；Survivin 高表达的PCa患者的无进展生存时间明显短于Survivin低表达的患者（Log-rankχ2=17.814，P＜0.01）。见图1。
2.2PCa组织标本中Survivin蛋白表达与患者临床特征的关系免疫组化染色显示，PCa标本中Survivin蛋白高表达比例（60.0%，36/60）明显高于BPH组织（26.7%，4/15），差异有统计学意义（χ2= 5.357，P＜0.05）。Survivin在BPH和PCa中的表达情况见图2。不同临床特征患者Survivin表达水平比较发现，Survivin高表达比例T3+T4期患者高于T1+ T2期，局部淋巴结转移患者高于无淋巴结转移者，有远处转移者高于无远处转移者，见表1。
2.3PCa和BPH细胞系中Survivin蛋白表达水平比较BPH细胞中Survivin蛋白表达水平（0.323±0.053）低于PCa细胞系LNCaP（0.445±0.053）、Du-145（0.568±0.045）和PC-3（0.792±0.044），差异有统计学意义（n=3，F=49.850，P＜0.01），见图3。
2.4敲低和过表达Survivin后PC-3和LNCaP细胞中Survivin蛋白表达变化在PC-3细胞中，Survivin在Survivin-KD组（0.599±0.029）表达低于NC组（0.923±0.025），差异有统计学意义（n=3，t=14.770，P＜0.01）；在LNCaP细胞中，Survivin-OE组（0.989±0.015）Survivin表达水平高于Vector组（0.633±0.020），差异有统计学意义（n=3，t=24.770，P＜0.01），见图4。2.5敲低和过表达Survivin后PC-3和LNCaP细胞的增殖和侵袭能力变化CCK-8实验结果显示，在PC-3细胞中，与NC组相比，Survivin-KD组细胞增
童趣 翻译殖能力明显下降（n=3，F
组间=2033.000，F时间=
（n =45）P ＜0.001
C L o g 2R P K M
24（n =226）678910
（n =63）（n =129）（n =4）
Gleason 评分
8
1012癌旁组织
（n =52）癌组织（n =467）
哈尔滨电脑学校
P ＜0.001L o g 2R P K M
reputation意思
A
8
1012无淋巴结转移（n =370）
淋巴结转移（n =74）
P ＜0.001
B L o g 2R P K M
0.00
0.250.500.751.000
1000
2000
3000
a
b
a:low
b:high
D 累积生存率
P ＜0.001
无进展间期（d ）
无进展间期（d ）
A ：PCa 组织与癌旁组织中Survivin 的mRNA 表达；
B ：有无淋巴结
转移患者Survivin 的mRNA 表达；C ：不同Gleason 分级患者中
Survivin 的mRNA 表达；D ：不同Survivin 表达水平PCa 患者的无进展生存曲线，以Survivin mRNA 表达水平中位数1.25为界分为高表达和低表达Fig.1
Expression levels of Survivin mRNA in TCGA databa of
PCa patients
图1TCGA 数据库中PCa 患者Survivin mRNA 表达水平
BPH
-PCa
+++
Fig.2Expression levels of Survivin in BPH and PCa (Immunohistochemistry staining,×100)longdistance
图2
Survivin 在BPH 和PCa 中的表达情况（免疫组化染色，×100）
临床病理特征
年龄<75岁≥75岁
前列腺特异性抗原＜4μg/L 4~10μg/L ＞10μg/L 临床分期T1+T2T3+T4手术切缘
阴性
阳性血管受累阴性阳性局部淋巴结转移
无有远处转移无有
n
34261123
262832
243628322733
3525
Survivin 表达
低表达14（41.2）10（38.5）6（54.5）
8（34.8）10（38.5）15（53.6）9（28.1）10（41.7）14（38.9）12（42.9）12（37.5）18（66.7）6（18.2）20（57.1）4（16.0）高表达
20（58.8）16（61.5）5（45.5）
15（65.2）16（61.5）13（46.4）23（71.9）
14（58.3）22（61.1）16（57.1）20（62.5）9（33.3）
27（81.8）
15（42.9）21（84.0）χ2
loud0.045
1.256
4.029
＊
0.319
0.407
14.540＊＊
10.280＊＊
Tab.1Comparison of Survivin expression between PCa
patients with different clinicopathological features 表1
不同临床病理特征PCa 患者Survivin 表达水平比较
例（%）
＊
P ＜0.05，＊＊
P ＜0.01
Fig.3Expression levels of Survivin in human benign prostatic hyperplasia and prostate cancer cell lines
图3
人前列腺增生细胞系和PCa 细胞系中Survivin 蛋白表达水平
头像英文Survivin
（16ku ）GAPDH
（36ku ）BPH LNCaP
Du-145
PC-3
Survivin low
Survivin high
577.900，F 交互=125.700，P ＜0.01）；在LNCaP 细胞中，Survivin-OE 组细胞增殖能力明显高于Vector 组（n =3，F 组间=1794.000，F 时间=396.500，F 交互=82.130，P ＜0.01），见图5。Transwell 实验结果显示，Survivin-KD 组细胞侵袭数量明显少于NC 组［（43.67±4.73）个/视野vs.（101.67±7.64）个/视野，t =11.190，P ＜0.01］；而Survivin-OE 组细胞侵袭数量明显多于Vector 组［（63.67±5.03）个/视野vs.（33.33±3.51）个/视野，n =3，t =8.561，P ＜0.01］，见图6。
2.6敲低和过表达Survivin 后PC-3和LNCaP 细胞
hurricane
EMT 相关蛋白表达变化Western blot 检测发现，在PC-3细胞中，与NC 组相比，Survivin-KD 组间质标志物N-cadherin 表达减少，上皮标志物E-cadherin 表达增加。在LNCaP 细胞中，与Vector 组相比，Survivin-OE 组E-cadherin 表达减少，N-cadherin 表达增加，见图7、表2。
2.7敲低和过表达Survivin 后PC-3和LNCaP 细胞
TGF-β/Smad 通路相关蛋白表达变化进一步探索Survivin 调控肿瘤细胞EMT 进程的机制发现，在PC-3细胞中，与NC 组相比，Survivin-KD 组TGF-β1、pSmad2/3和Smad4表达减少（P ＜0.01）；在LNCaP 细胞中，与Vector 组相比，Survivin-OE 组TGF-β1、pSmad2/3、Smad4均表达增加（P ＜0.01），见图8、表3。
Vector
Survivin-OE
LNCaP
B
NC
Survivin-KD
Survivin
（16ku ）GAPDH
（36ku ）
PC-3A A ：PC-3细胞系中NC 组和Survivin-KD 组Survivin 蛋白表达；B ：LNCaP 细胞系中Vector 组和Survivin-OE 组Survivin 蛋白表达
Fig.4
Changes in Survivin expression after knocking-down and
overexpressing Survivin
图4
敲低和过表达Survivin 后其蛋白表达变化
0.5
2.52.01.51.00.0
时间（h ）
24
480
O D 450
7296
Vector Survivin-OE
B
LNCaP
0.52.5
2.01.51.00.0时间（h ）
24
480
O D 450
72
96saluki
NC Survivin-KD
A PC-3A ：敲低Survivin 后PC-3细胞增殖曲线；
B ：过表达Survivin 后LNCaP 细胞增殖曲线
Fig.5
Thel proliferation curves of Survivin overexpression and
knockdown in PCa cells
图5
敲低和过表达Survivin 后PCa 细胞增殖曲线
Vector
Survivin-OE
LNCaP
B
NC
Survivin-KD
PC-3
A
A ：敲低Survivin 后对PC-3细胞侵袭能力的影响（×200）；
B ：过表
达Survivin 后对LNCaP 细胞侵袭能力的影响（×200）Fig.6Transwell results in PCa cells after knocking-down and overexpressing Survivin
图6敲低和过表达Survivin 后PCa 细胞Transwell 实验结果
A ：敲低Survivin 后PC-3细胞中EMT 标志蛋白表达；
B ：过表达
Survivin 后LNCaP 细胞EMT 标志蛋白表达Fig.7
Expression levels of EMT-associated proteins after knocking-down and overexpressing Survivin
图7
敲低和过表达Survivin 后EMT 相关蛋白表达Survivin-KD
GAPDH
（36ku ）
N-cadherin （120ku ）A PC-3
NC
E-cadherin （120ku ）B
Survivin-OE
Vector
LNCaP
