switzerSEC2在莱茵衣藻中的表达及免疫学活性分析
李建成;彭世清;胡章立
【摘 要】A superantigenic gene (c2t) of the attenuated enterotoxin C2 was obtained by the site-directed mutagenesis of enterotoxin C2 in Staphylococcus aureus. The c2t was inrted into the pH124 vector with Hsp 70A-RBCS2 promoter and RBCS2 terminator to construct the expression vectors pH124 clt for transformation in Chlamydomonas reinhardtii. The pH 124 clt vectors were transformed into the algal cell by the glass-bead method in Chlamydomonas reinhardtii CC-849. A number of transformants appeared in the TAP plates with 10 μg/mL of Zeomycin in 3 ~4 weeks. The transgenic strain Tran-c2t was further screened by PCR and RT-PCRanalysis. Southern blot and Western blot analysis showed that c2t gene had been integrated into the nuclear genome of Tran-c2t, and a 26 kDa( 1 Da = 1 u) SEC22T protein had been expresd in the Tran-c2t. In order to detect the immunological activity of Tran-c2t, the saline (0. 9% ) and cultures (106/ mL) of CC-849 and Tran-c2t were ud to feed the three groups of Balb/c mice respectively. The
CD3 + , CD4 + and CD8 + of experimental mice were detected by flow cytometry. The results show that T lymphocytes proliferation of mice is stimulated by the SEC2T expresd in Tran-c2t. To compare with T-cell respon of CC-849, the Tran-c2t leads to the increa of CD3+ and CD8+ significantly, but it decreas the ratio of CD4 + /CD8 + in the experimental mice.%通过将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)基因进行定点突变,获得具有超抗原性的减毒C2基因序列c2t,把该基因插入含Hsp 70A-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH124载体上,构建莱茵衣藻表达载体pH124c2t,采用“珠磨法”将该载体转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-849中,经含10 μg/mL Zeomycin的抗性平板筛选、PCR及RT-PCR分析,获得转基因莱茵衣藻Tran-c2t. Southern blot和Western blot分析表明,c2t基因已整合入莱茵衣藻核基因组中,且能表达相对分子质量为26 kDa(1 Da=1 u)的目的蛋白.分别以CC-849和Tran-c2t两种藻细胞培养液(每毫升106个细胞)喂食Balb/c小鼠,并用流式细胞仪检测分析小鼠CD3+、CD4+和CD8+细胞,结果发现,可表达减毒超抗原SEC2T的转基因莱茵衣藻Tran-c2t能刺激小鼠T淋巴细胞的产生；与对照相比,CD4+与CD8+细胞数目比值有所降低,但CD3+和CD8+细胞有明显提高.研究结果有助于利用转基因藻生产抗肿瘤制剂和动物免疫增强剂.
【期刊名称】《深圳大学学报（理工版）》
【年(卷),期】2012(029)002
【总页数】intact6页(P159-164)
苏州英语翻译【关键词】基因工程;金黄色葡萄球菌;肠毒素C2;莱茵衣藻;超抗原;转基因藻;抗肿瘤;定点突变
【作 者】李建成;彭世清;胡章立
【作者单位】海南大学农学院,海口570228;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室,海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室,海口571101;深圳大学生命科学学院,深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室,深圳518060
【正文语种】中 文
【中图分类】Q37;R392.1
超抗原 (superantigen)是一类可与抗原呈递细胞 (antigen prenting cell，APC)上主要组织相容性复合物II(major histocompatibility complex class II，MHCII)和 T淋巴细胞受体 (T cell receptor，TCR)的Vβ区结合而刺激T细胞活化增殖的抗原［1］.金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus，S.aureus)肠毒素 C2(staphylococcal enterotoxin C2，SEC2)是一种外源性超抗原，仅需微量 (ng级)就能产生强烈的免疫应答，刺激非特异性T细胞大量增殖，提高机体免疫能力［2］.然而，微量的SEC2即可引起人体及动物多种组织和器官的损伤［3-4］，严重制约了SEC2在抗肿瘤生物制剂和动物免疫增强剂等方面的应用.Wright A等［5］发现，SEC2基因的第118位组氨酸 (Histidine，His)是重要的毒素位点，与其催吐机制密切相关.为获得既具有超抗原特性，又不会严重损伤机体组织器官的减毒肠毒素C2，本研究通过对c2基因序列进行定点突变，获得具有超抗原性的c2t基因.
贮蓄>s off是什么意思莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻，生长迅速，光合效率高，且遗传背景清晰，是目前少数3套基因组 (细胞核、叶绿体和线粒体)都能进行遗传转化的生物［6］.由于莱茵衣藻蛋白质和糖类等营养物质含量高且不产生内毒素，作为可食性疫苗生物载体具有重要意义.本研究将c2t基因转入莱茵衣藻，并分析转基因莱茵衣藻Tran-c2t的免疫学特性，为进一步利用转基因藻生产抗肿瘤制剂和动物免疫增强剂奠定基础.
1 实验方法
1.1 材料和试剂
大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)Top10、质粒pH124(含ble基因，可使宿主细胞具有腐草霉素和Zeomycin抗性)，野生型莱茵衣藻均由本实验室保存.克隆载体PMD18-T simple购自宝生物工程(大连)有限公司.分泌SEC2的金黄色葡萄球菌标准株由深圳市疾病预防控制中心惠赠.Balb/c小鼠购自广东省医学实验动物中心.测序工作由北京六合华大基因科技股份有限公司完成.限制性内切酶HindⅢ、NheⅠ、PmacⅠ 和 T4连接酶均购自 MBI Fermentas.点突变试剂盒 (Mutaan BEST kit)和DNA聚合酶LA Taq均购自宝生物工程 (大连)有限公司.
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1.2 引物设计与合成
根据Genbank已知的金黄色葡萄球菌SEC2基因登录号 (Genbank登录号AY450554)分别设计点突变及克隆所需特异性引物:P1:5'-AAGTTATGTATGTAGATAAATTTTTGGCACATG-3'，P2:5'-TAGTTGCTGATACATAATGATCATCATATAAAT-3';C1:5'-CATGCTAGCGAGAGTCAACCACCAGACCCTACGCCAG-3'，C2:5'-CGCACGTGTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGG-3'.
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1.3 克隆金黄色葡萄球菌c2基因
浩瀚的意思利用试剂盒(Takara mini BEST bacterial genomic DNA extraction kit ver.2.0)提取金黄色葡萄球菌标准株总DNA，以C1和C2为引物，进行PCR扩增(反应体系为:反应酶 LA Taq 0.5 μL、10×LA PCR 缓冲液5 μL、dNTP Mixture 8 μL、模板基因组DNA 1 μL、引物C1和 C2各0.5 μL，补水至总体积50 μL).PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃反应30 s，55℃反应30 s，72℃反应1min，30个循环;72℃延伸5 min.PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳 (琼脂糖质量浓度为10 g/L)，并将电泳片段利用胶回收试剂盒(Takara agaro gel DNApurification kit ver.2.0)切胶回收.回收产物与T载体在16℃水浴条件下连接过夜，然后转入E.coli Top10中，再将转化菌液涂抹在有氨苄抗性的LB平板上，培养12～16 h后，将生长良好的单克隆接种于含氨苄抗性的LB液体培养基中，培养过夜.采用十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)碱裂解法提取质粒，并对质粒进行PCR和酶切鉴定.
1.4 金黄色葡萄球菌SEC基因的定点突变
motorvehicle以c2基因为模板，P1和P2为引物，采用点突变试剂盒 (Mutaan BEST kit)进行PCR扩增.扩增产物经平末端处理后，连接并转入感受态细胞E.coli Top10中，挑取阳性克隆进行验证，
同时送北京六合华大基因科技股份有限公司测序.
1.5 构建含c2t基因的莱茵衣藻表达载体
将突变成功且已连接到T载体上的c2t基因和pH124载体同时用NheⅠ和PmacⅠ酶切，然后进行切胶回收，得c2t基因片段和线性化的pH124载体，将两者的回收产物用T4连接酶连接，并转入E.coli Top10中，挑取阳性克隆进行PCR和酶切鉴定.
1.6 莱茵衣藻的遗传转化
采用“珠磨法”进行莱茵衣藻遗传转化.具体方法如下:①将细胞壁缺陷性莱茵衣藻CC-849接种于新鲜TAP培养基中，连续光照条件下培养至对数生长期 (细胞浓度为1×106～2×106/mL);室温条件下5 000 r/min离心6 min，弃上清，收集藻细胞;②用新鲜无菌的TAP培养液重悬沉淀，调整藻细胞浓度至2×108/mL.取悬浮液300 μL于1.5 mL的EP管中 (含灭菌的玻璃珠);③将目的DNA酶切成线状，加入EP管中，快速振荡25 s，使玻璃珠、藻株和外源DNA充分混匀;④将混合液转移到50 mL已灭菌的培养管中，加入10 mL无菌新鲜TAP培养液，100 r/min摇床培养过夜，使细胞恢复;⑤室温离心，去上清，收集藻液，用0.8 mL
TAP培养液轻轻重悬，加入3.5 mL TAP培养基(琼脂糖质量浓度为5 g/L)，均匀涂布在TAP平板上 (含Zeomycin抗生素)，静置30 min后，转移至22°C光照培养箱中倒置培养3～4周，平板上长出的绿色单克隆即为转基因莱茵衣藻.
1.7 转基因莱茵衣藻的分子检测
1.7.1 PCR和RT-PCR分析wana
将获得的转基因莱茵衣藻接种于新鲜TAP培养基中，光照培养至对数生长期，使用Takara universal genomic DNA extraction kit ver.3.0提取总DNA，以提取的总DNA为模板进行PCR扩增;采用反转录试剂盒 (Takara prime scrip RT reagent kit with gDNA erar)对转基因莱茵衣藻总RNA进行RT-PCR扩增.PCR和RT-PCR引物均为C1和C2.PCR反应体系为:Premix Ex Taq 10 μL、引物C1和C2各0.5 μL、模板 1 μL，补水至总体积 20 μL.PCR 反应条件为:97℃预变性5 min;94℃反应30 s，60℃反应30 s，72℃反应1 min，30个循环;72℃延伸5 min.反应后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖质量浓度为10 g/L)检测.
