网络出版时间：2222-16-015：04网络出版地址：https：//kvsyg vet/kcms/ketail/30.1275.R.92221204.9465.926.htmi 结缔组织生长因子/聚LpL酸纳米微球的制备
及其体外释药特性研究
程义成1，孔祥伟1，梅盛林2，尹伟1，王晨辰1，刘向辉1
摘要目的以聚L-乳酸为载体材料制备结缔组织生长因子纳米微球。方法采用复乳法制备结缔组织生长因子/聚L-乳酸纳米微球，检测微球特征，并观察微球表面形貌，最后研究微球体外释药特性。结果结缔组织生长因子/聚L 乳酸纳米微球平均粒径为（376.5士18.2）nm，包封率为（6&65±1.34）%，载药量为（34.25±0.73）py/my。微球呈现良好的球面形貌，表面圆整无明显裂纹和孔隙。该微球释药特性表现为前16h的药物快速释放和随后32d的药物缓慢释放。结论该研究制备出来的结缔组织生长因子/聚L-乳酸纳米微球是应用于牙科种植体基台表面的理想微球，具有良好的应用前景。
关键词结缔组织生长因子；纳米微球；体外释药；种植体基台
中图分类号R782.1；R944
文献标志码A文章编号1002-1492（2221）21-O. doi:12.hi.）8801000-1205.9251.91.926
种植体周围感染是引起种植失败的主要原因之一［］。牙科种植体是一个穿龈的结构，其上半部分暴露在口腔这个有菌环境中［］，因此种植体基台与软组织结合的部位成为了细菌入侵的最主要途径。种植体要维持长期稳定地行使功能，其穿龈的基台部与软组织尽快形成稳定、有效的软组织生物学封闭维持至关重要。然而目前临床上种植体基台多为光滑表面，难以形成并维持稳定的软组织生物学封闭［］。研究⑷表明结缔组织生长因子具有良好的促进成纤维细胞黏附、增殖的作用。该研究以聚L-乳酸为载体材料，拟制备结缔组织生长因子/聚L-乳酸纳米微球，对微球特性及体外释药性能进行研究，为下一步在种植体基台表面构建促进软组织封闭涂层奠定实验基础。
1材料与方法
1.6材料与仪器结缔组织生长因子（connective tiss/e growth factor,CTGF）（美国Sigma-Ald/ch公司）；聚L-乳酸［poiy（LPactic acif）,PLLA，数均相对分子质量172000］、聚乙烯醇（poiy vinyl alcoUoi, PVA）（美国Sigma-Ald/ch公司）；二氯甲烷（色谱纯，天津协和试剂公司）；CTGF ELIFA试剂盒（美国Ray Biotech公司）；其他化学试剂为国产分析纯；超声波细胞粉碎仪（JY92AIN型，宁波新芝生物科技有限公司）；场发射扫描电子显微镜（S-4800型，日本日立公司）；激光粒径分析仪（Mastersizer2200型，英国Malvem Instruments公司）；台式高速离心机（TGLA6G型，上海医用分析仪器厂）；冷冻干燥器（FDA型，北京博医康技术公司）；微量电子天平（FA135S型，上海精密科学仪器有限公司）；振荡培养箱（H ZQ a160型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；恒温定
时磁力搅拌器（上海精科仪器厂）；超声波清洗器（TNH166型，德国Elma公司）。
16方法
1.2.0CTGF//LLA纳米微球的制备采用复乳法（W1/O/W2）*5］制备CTGF/LLLA纳米微球。超声作用下将5mg CTGF溶于0.6mi去离子水中作为内水相（W1）；100mg PLLA溶于2mi二氯甲烷中作为油相（0）。将内水相逐滴加入油相中，在冰水浴中利用超声波细胞粉碎仪超声乳化（功率86W）1 min形成初乳（W/O）。在形成的初乳中加入10ml 1%的PVA水溶液（外水相W1），继续在冰水浴中利用超声波细胞粉碎仪超声乳化（功率86W）1min 形成复乳（W1/0/W1）。将得到的W1/0/W1乳液快速加入到160mi0.5%的PVA水溶液中以520 r/min转速磁力搅拌4h，以除尽二氯甲烷。微球经固化后,15000r/min转速下离心22min，分离收集微球，并用蒸馏水洗涤3次以除去微球表面残留的PVA，再经离心冷冻干燥后得到微球粉末。
2025-07-27接收
基金项目：国家自然科学基金（编号：51901047）；江苏省自然科学基
金资助项目（编号:BK25177115）；中央高校基本科研业务
费专项资金项目（编号:2zyyl2519007）
作者单位：东部战区总医院口腔科，南京210002
5西安交通大学口腔医院修复科，西安71504
作者简介：程义成，男，主治医师；
刘向辉，男，主任医师，硕士生导师，责任作者,E-maii：出国英语学习
“2540x0064234® 1.2.0CTGF/LLLA纳米微球粒径的测定取一定
量的干燥CTGF/LLLA纳米微球在去离子水中超声分散20mo后，应用激光粒度分布测试仪测定其粒径及多分散系数。
1.2.2CTGF/LLLA纳米微球包封率和载药量的测定精确称量5mg CTGF/LLLA纳米微球加入到5 mi乙晴中，超声处理以加速微球溶解，待微球完全溶解后，以5000r/mio离心5min后取沉淀加入5ml蒸馏水超声处理，用ELISA法测定所得水溶液中CTGF含量。纳米微球的载药量和包封率公式如下：
包封率（％）=微球中CTGF质量/加入CTGF的质量x 100%
载药量（w/w）=微球中CTGF质量/微球的总质量
1.2.2CTGF/LLLA纳米微球表面形貌观察取少量的CTGF/LLLA纳米微球在去离子水中超声分散20min后，均匀滴在清洁玻片上，干燥喷金后场发射扫描电镜观察微球表面形貌。
1.2.2CTGF/LLLA纳米微球释药特性研究本实验选择磷酸盐缓冲液（phosphate-6ufferea saline, PBS,,H=5.4）溶液作为释药介质。精密称取CTGF/LLLA纳米微球20mg（约含有CTGF0.059mg）超声使其悬浮于5mi PBS缓冲液中，再转移到透析袋（截留物质相对分子质量>1000）内，放入盛有50mi PBS缓冲液的三角烧瓶内，密封后置于振荡培养箱中恒速振荡（35°C,50r/min），在预定的时间点从袋外缓冲液中取样1mf并立即补加等量同质同温PBS o同样用ELHA法测定取样中CTGF含量，从而计算其释放浓度和累计释放百分率，并绘制释药曲线。作为对照组，将含有6.059mg CTGF粉末的5mi PBS转移至透析袋中，也在同样的条件下进行实验。
1.2.2CTGF/LLLA纳米微球降解形貌观察按照C2.5方法将CTGF/LLLA纳米微球放入透析袋内置于PBS中，分别在516、26、32d时从透析袋里取出少量悬浊液，超声分散在去离子水中后均匀滴在清洁玻片上，干燥喷金后场发射扫描电镜观察微球降解形貌。
1.3统计学处理采用SPSS2
2.0统计软件进行分析，实验结果用x±s表示（n=6），释药实验各时间点组间比较采用t检验，以a=0.05为检验水准。
2结果
2.2CTGF/PLLA纳米微球粒径应用激光粒度分布测试仪测定CTGFLPLLA纳米微球平均粒径为（376.5±182）nm，多分散系数为（0.52±0.009）-其粒径分布图见图5
O
.O
O
(％)
悭
障
黑
除
5
5
7
5
2
图
10.0100.01000.0
粒径(nm)
1CTGF/PLLA纳米微球粒径分布图
2.6CTGF/PLLA纳米微球包封率和载药量根据公式计算,CTGF/PLLA纳米微球包封率为（6&62±）.32）%，载药量为（34.20±0.96）Mg/mg。
2.3CTGF/PLLA纳米微球表面形貌图2为载药微球经干燥喷金后经场发射扫描电镜观察到的表面形貌照片。低倍镜下（图2A）可见所有微球均呈现良好的球面形态，彼此无任何粘连和聚合，粒径分布比较
均匀，与粒径测试结果一致；高倍镜下（图2B）可见微球外形圆整，无明显的裂纹和孔隙。
B
20.0kV9.4mm xlOOk SE(M)
图2CTGF/PLLA纳米微球扫描电镜图
A：低倍镜下x0000；B：高倍镜下X50000
2.4CTGF/PLLA纳米微球释药曲线CTGF/LL-LA纳米微球释药曲线见图3，可见微球释药特性表现为初期CTGF的快速释放和随后的缓慢释放。快速释放主要集中在前5-而随后的药物缓慢释药时间长达30d o在各时间点，CTGF粉末中CTGF累积释药量均显著高于载药纳米微球（P<0.05。作为对照组，在前5-有90.9%的CTGF自CTGF粉末中释放。
2.3CTGF/PLLA纳米微球降解形貌图4为CTGFkPLLA纳米微球降解过程中的扫描电镜图片
可见在降解1d后微球表面变得粗糙（图4A）；降解5d后微球表面变得更加粗糙并且出现了较多的皱褶（图4B）；降解20d后微球的球面形貌出现了明显的变形（图4C）；而降解30d后微球已经完全变形，基本丧失了球状形貌（图2D）
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A100-80-20-10-0
-70- W
诵60 _ 梆50-黑40-30-
90-
0 2
4 6 8
10 12 14 16 18 20 22 24
——
CTGF/PLLA 纳米微球 --CTGF 粉末
B 100
9080G 70
tgt
話60 樓50 來40 瞰30
2010
时间(h)
CTGF/PLLA 纳米微球CTGF 粉末
3
6 9 12
15 18 21 24 27 30
时间(d)
图3 CTGF/PLLA 纳米微球与CTGF 粉末释药曲线
A ：前2 h
B ： d ；与CTGF 粉末组比较:** P<0. 01
图4 CTGF/PLLA 纳米微球降解扫描电镜图 x 160 000
A ：1 d 后；
早教英语儿歌B ：16 d 后；
C ：25 d 后；Da d 后
3讨论
近20年来，牙科种植体已经越来越广泛应用于
口腔医学临床，虽然临床长期随访研究表明种植体
成功率已达到98.8% ~95%［6］，但种植体周围感染
的发生率仍高达16% ~30%［4］o 牙科种植体是一
个穿龈的结构，细菌最初在穿龈的基台处黏附和堆 积并形成菌斑［］，随着基台处菌斑的成熟和其中致
病菌比例的增高，种植体基台周围软组织出现了炎
行尸走肉第四季第二集
性浸润导致结缔组织降解，致病菌也随之逐步向种 植体基底迁移，破坏种植体与骨组织的骨结合［］, 且持续的炎症导致起支持作用的骨组织丧失，并最
终影响种植体的成功率和使用寿命。因此，如何处
理种植体基台表面来促进基台与软组织形成更快
更有效的生物学封闭，从而抵御细菌的侵袭，预防种 植体周围感染是提高种植体成功率和使用寿命的关
键问题之一。该研究选择了具有明确促进软组织生 长的CTGF ［16］来制作纳米级微球，对微球特性及体
外释药性能进行研究，为下一步在种植体基台表面
构建促进软组织封闭涂层奠定实验基础。
以PLLA 为载体材料将CTGF 制成微球不仅可
以根据特定的治疗需要实现药物的缓慢释放和局部 释放，还可以提高其生物利用度。由于CTGF 水溶
性较好，在微球制备过程中选择了复乳法，从制备结 果来看包封率达到了令人满意的62 62% o 本研究
制备载CTGF 微球的目的是后期在微弧氧化的基台
表面构建促进软组织封闭的涂层，而微弧氧化处理 后在钛表面会形成孔径1 ~3 p m 的微孔［16］，如果微 球粒径太大，就无法嵌合在这些微孔中。激光粒度
分布测试仪检测制备出来的CTGF/LLLA 微球平均
粒径为376.5 nm，粒径上符合后期应用要求，并且
多分散系数为0. 132，小的多分散系数对纳米微球
的长期稳定非常重要。场发射扫描电镜观察纳米微 球形貌可见微球外形圆整，无明显裂纹和孔隙。研 究［1］表明微球的表面形貌对微球的释药性能有极
大影响一一粗糙多孔的表面会增大微球的亲水性并 使得药物更易扩散，从而加大药物的突释现象。
透析袋扩散法是载药微球体外释药研究的常用 方法［16］，其具有操作简单，重复性好的优点。体外
释药曲线显示CTGF/LLLA 纳米微球释药特征表现
为典型的两相曲线：初期的突释以及随后的药物缓
慢释放。造成药物突释的原因主要为吸附在微球表 面或接近表面的药物迅速溶解至释放介质中［I3 ］ O
在药物的缓慢释放阶段，随着PLLA 的降解，微球中
包裹着的CTGF 也随之释放出来进入释放介质中。
从载药微球的降解扫描电镜照片可见，微球的降解
最初表现为表面的降解变形，随着降解的进行微球 的球面形貌出现了塌陷，最终丧失了球面的形貌。
综上所述，该研究采用复乳法制备出了粒径较
小，分布比较均匀，具有较高包封率的CTGF/LLLA
纳米微球，其体外释药时间长达30d，是应用于牙科种植体基台表面的理想微球。该研究为下一步在种植体基台表面构建促进软组织封闭涂层奠定实验基础。
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Preyardtion and io vitro reley behavior of connective tissue growth factor-loaded poly(L-lactio aciO)nanoparhclee
Chexo YO/wo1,Kong Xis/wW1,Mvi SUwmhk2,W ai
(1Depi of Stomatology,Genesl Hospitcl of Easters Theater,Nanjing910002；
2Depi of Prothofootics,CoUgr of Stomatology,Xt m JiafoTig University,Xian710004)
Abstroct Objective Tv pappo nanopaaiclvs containino connective tiss/v growth factor with polp(L-lactlc aciO) (PLLA).MetSonu Thv connective tiss/v growth factor-OaPed PLLA nanopaaiclvs were prepared bp dopUO emu-i sion method.Thv c/aracteasticr of thv nanopaVicOs were detevnined,sk thv movhoOpp of thv nanopaVicOs was odaed.Finalip,thv aOco bedavior of thv nanopaaiclvs was examined in vitrs.Results Thv averapp diametvr ch the prepared copnective tiss/e growth fCctcr-loaPed PLLA nanopaaicles was(376.5±5.2)nm,the匚―。/。/-tion eWicienco and dau OSOg were(60.62±1.30)%sk(34.26±0.56)|xp/mg,asyectiveip.The mcmppa ticles showed good sphWcal moahoOpy without agprepation or aPdesion.The aOso pafiie consisted of an initiai fsi aOso in the first5h sk a more c optinuous slow aOso ir30d.Conclusion The connective tissue growth factor-OaPed PLLA nanopaaicles prepared in this study are iOeai nanoparticOs tv be applied on dextai io-plst aPutmexi s/Vaco.
Key wordt connective iOs/e growth factor;nanoparticles;aOso bedavior in vitrs；ioplani aPutmexi
