2021年4月
第31卷㊀第4期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE
April,2021
Vol.31㊀No.4
宋建敏，陈灿，宋波.沙库巴曲缬沙坦通过调控心力衰竭大鼠TGF-β1/Smad3和NF-κB 信号通路抑制心肌损伤[J].中国比较医学杂志,2021,31(4):115-122.
Song JM,Chen C,Song B.TGF-β1/Smad3and NF-κB signaling pathways in rats with heart failure [J].Chin J Comp Med,2021,31(4):115-122.
doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2021.04.017
[作者简介]宋建敏(1980 )，女，硕士，主治医师，主要从事急性冠脉综合征及心力衰竭的临床研究㊂E-m
ail: [通信作者]陈灿(1980 )，男，硕士，副主任医师，主要从事常见心血管疾病及胸外科疾病的微创化治疗㊂E-mail:
沙库巴曲缬沙坦通过调控心力衰竭大鼠TGF-β1/Smad3和NF-κB 信号通路抑制心肌损伤
英语口语视频教程宋建敏1，陈㊀灿2∗，宋㊀波1
(1.湖北医药学院附属随州医院心血管内科，湖北随州㊀441300;2.湖北医药学院附属随州医院心胸血管外科,
湖北随州㊀441300)
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀研究沙库巴曲缬沙坦对心力衰竭大鼠心肌损伤和心脏重构的影响，并探讨其对TGF-β1/
Smad3和NF-κB 信号通路的调控作用㊂方法㊀通过结扎大鼠左前降支冠状动脉(LAD)诱发心力衰竭动物模型㊂建模后每天用10mg /kg 的沙库巴曲缬沙坦治疗大鼠(沙库巴曲缬沙坦组,n =15)㊂假手术组(n =15)和模型组(n =15)大鼠用等体积的生理盐水处理㊂共治疗4周㊂通过超声心动图和组织学检查分别评估大鼠心脏功能和
纤维化㊂转化生长因子-β1(TGF-β1)㊁磷酸化Smad3(p-Smad3)㊁磷酸化Smad7(p-Smad7)㊁胶原蛋白I(Collagen I)㊁α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)㊁肿瘤坏死因子-α(TNF-α)㊁白介素-6(IL-6)㊁核因子κB(NF-κB)和磷酸化的κBα(p-IκBα)的蛋白水平用Western blot 分析法测定㊂结果㊀与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组的左心室射血分数(EF)和左心室缩短分数(FS)显著升高，而LVIDs 和LVIDd 显著降低(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙
坦组Collagen I 的表达显著降低(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组TGF-β1的蛋白表达以及Smad3的磷酸化水平显著降低，而Smad7的磷酸化水平显著升高(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组TNF-α和IL-6的蛋白表达显著降低(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组NF-κBp65和p-IκBα的蛋白表达显著降低(P <0.05)㊂结论沙库巴曲缬沙坦通过抑制心力衰竭大鼠TGF-β1/smad3和NF-κB 信号通路来抑制心肌纤维化和炎症反应㊂
ʌ关键词ɔ㊀沙库巴曲缬沙；心力衰竭；心肌纤维化；炎症
ʌ中图分类号ɔR-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2021)04-0115-08
Sacubitril /valsartan inhibits myocardial injury by regulating
TGF-β1/Smad 3and NF-κB signaling pathways in rats with heart failure
SONG Jianmin 1,CHEN Can 2∗,SONG Bo 1
(1.Department of Cardiovascular Medicine,Suizhou Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Suizhou 441300,China.
2.Department of Cardiothoracic and Vascular Surgery,Suizhou Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Suizhou 441300)㊀㊀
ʌAbstract ɔ㊀
Objective ㊀
To investigate the effect of sacubitril /valsartan on myocardial injury and cardiac
remodeling in rats with heart failure,and to investigate its regulatory effect on transforming growth factor -β1(TGF-β1)/
punchesSmad3and nuclear factor -κB (NF-κB)signaling pathways.Methods ㊀An animal model of heart failure was induced by
ligation of the left anterior descending coronary artery in rats.After modelling,rats were treated daily with sacubitril/ valsartan at10mg/kg(sacubitril/valsartan group,n=15).Rats in the sham group(n=15)and the model group(n=15) were treated with an equal volume of normal saline.Rats were treated for4weeks.Echocardiography and histology were ud to asss heart function and fibrosis,respectively.Protein levels of TGF-β1,phosphorylated Smad3,phosphorylated Smad7,collagen I,alpha smooth muscle actin,tumor necrosis factor-α,interleukiN-6,NF-κB,and phosphorylatedκBαwere determined by western blot analysis.Results㊀Left ventricular ejection fraction(EF)and left ventricular fraction shortening(FS)in the sacubitril/valsartan group were significantly higher,while LVIDs and LVIDd in the sacubitril/ valsartan group were significantly lower compared with tho in the model group(P<0.05).Collagen I expression was significantly reduced in the sacubitril/valsartan group compared with the model group(P<0.05).TGF-β1protein expression and Smad3phosphorylation levels in the sacubitril/valsartan group were significantly lower,while Smad7 phosphorylation levels were significantly higher compared with the model group(all P<0.05).Tumor necrosis factor-αand interleukiN-6protein expression was significantly reduced in the sacubitril/valsartan group compared with the model group (both P<0.05).NF-κBp65and phosphorylatedκBαprotein expression was significantly reduced in the sacubitril/valsartan group compared with the model group(both P<0.05).Conclusions㊀Sacubitril/valsartan inhibits myocardial fi
英语学习网站 voahor怎么读brosis and the inflammatory respon by inhibiting TGF-β1/Smad3and NF-κB signaling pathways in rats with heart failure.
ʌKeywordsɔ㊀sacubitril/valsartan;heart failure;myocardial fibrosis;inflammation
㊀㊀心肌梗死在全世界范围内具有较高的致残率和死亡率㊂尽管由于早期溶栓㊁经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉搭桥术明显降低了急性心肌梗死的死亡率，但幸存患者中仍会发生左心室(LV)重塑[1]㊂心肌梗死后这种不良的心脏重塑可导致心室功能障碍和心力衰竭，从而导致预后不良和死亡率升高[2]㊂心力衰竭是心肌梗死的主要并发症，其在心肌梗死患者死亡原因中位于第二位[3]㊂因此，抑制心脏重塑是治疗心肌梗死后心力衰竭的主要策略㊂
心肌梗死后左心室间质纤维化和炎性细胞浸润是心脏重塑的常见病理特征㊂转化生长因子-β1 (TGF-β1)已被确认为心脏纤维化的关键调节剂，其可影响细胞生长㊁凋亡和分化㊁增加胶原蛋白和基质蛋白的产生㊁保持成纤维细胞的活力㊂心肌梗死动物模型的结果表明，心肌梗死中TGF-β1的高表达以及使用TGF-β受体抑制剂阻断TGF-β途径可以减轻心肌梗死动物模型中的心脏纤维化[4]㊂此外，核因子κB(NF-κB)是心肌梗死后心脏重塑和心力衰竭发展的关键因素，并且在炎症和先天免疫中起着至关重要的作用[5]㊂NF-κB家族成员p65形成同二聚体或异二聚体，这些同二聚体或异二聚体与细胞质中的κB(IκB)蛋白抑制剂结合㊂IκB的降解会释放NF-κB二聚体，并使NF-κB易位进入细胞核，从而可以启动
靶基因的转录㊂NF-κB的激活可诱导趋化因子(MCP-1)㊁细胞因子(TNF-α㊁IL-6)和基质金属蛋白酶(MMPs)的转录，并进一步促进炎症和纤维化[6]㊂多项研究表明抑制NF-κB可抑制炎症反应和心脏纤维化[6]㊂因此，研究TGF-β1和NF-κB信号通路对于抑制心肌梗死后心力衰竭患者的心脏重塑具有巨大的潜在治疗价值㊂
沙库巴曲缬沙坦(sacubitril/valsartan)的商品名叫诺欣妥(entresto)，是一种血管紧张素II受体及脑啡肽酶的双重抑制剂类药物，由血管紧张素II受体拮抗剂的缬沙坦及脑啡肽酶抑制剂前体AHU377组成[7]㊂沙库巴曲缬沙坦于2015年获美国FDA批准上市,2016年被推荐为心力衰竭指南的I类药物，并且取得了较好的疗效㊂然而，沙库巴曲缬沙坦对心脏重塑的作用机制尚不明确㊂因此，本研究建立了心肌梗死后心力衰竭模型，评估了沙库巴曲缬沙坦对心脏功能㊁心脏纤维化以及TGF-β1㊁p-Smads㊁collagen I㊁TNF-α和IL-6的影响㊂并进一步探讨TGF-β1和NF-κB通路是否参与心脏重塑过程中沙库巴曲缬沙坦的保护作用㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀实验动物
007余温之恋60只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠(7周龄，体重220~250g)由湖北省实验动物中心提供[SCXK(鄂)2019-0008]，饲养于湖北医药学院屏障环境中[SYXK(鄂)2019-0031]㊂给动物饲喂标准饲料
和水，并饲养在12h光照和12h黑暗㊁(20ʃ2)ħ温度和(50ʃ2)%湿度的环境中㊂所有动物实验方案均已获得湖北医药学院附属随州医院伦理审查委员会的批准(20180211)，并符合实验室动物管理和使用规定，实验设计符合3R原则㊂新车如何保养
1.2㊀主要试剂与仪器
沙库巴曲缬沙坦(诺新妥，国药准字J20171054,Novatis Pharma Stein AG);Masson三色染色剂染色(货号:G1340，北京索莱宝科技有限公司);α-SMA一抗(免疫组化)(ab119952，英国Abcam公司);HRP-聚合物标记的抗兔IgG二抗(ab6721，英国Abcam公司);RIPA裂解缓冲液(产品编号:P0013K，碧云天生物技术研究所);TGF-β1一抗(ab215715，英国Abcam公司);p-Smad3和Smad3一抗(ab52903和ab40854，英国Abcam公司);p-Smad7和Smad7一抗(ab227309和ab226872，英国Abcam公司);TNF-α一抗(ab215188，英国Abcam公司);IL-6一抗(1ʒ1000, ab233706，英国Abcam公司);Collagen I一抗(ab138492，英国Abcam公司);α-SMA一抗(ab265588，英国Abcam公司);NF-κBp65一抗(ab183559，英国Abcam公司);p-IκBα一抗(sc-8404，美国Santa Cruz Biotechnology公司);GAPDH 一抗(ab8245，英国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(ab205718，英国Abcam公司)㊂1.3㊀实验方法
1.3.1㊀心肌梗死后心力衰竭动物模型
结扎左前降支冠状动脉(LAD)后由心肌梗死诱发心力衰竭㊂腹膜内注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，然后进行气管插管并连接呼吸机正压通气，术前记录12导联心电图㊂皮肤消毒后于胸腔开口，于左心耳根部下方2mm结扎LAD㊂假手术组的大鼠在不结扎LAD的情况下进行相同的手术操作㊂实验后记录十二导联心电图㊂将大鼠正常喂养1周㊂根据经胸超声心动图检查结果，当LVEF降低45%时表示心力衰竭模型建模成功㊂
1.3.2㊀动物分组及给药
将存活大鼠随机分为以下组：假手术组(n= 15)㊁模型组(n=15)和沙库巴曲缬沙坦组(n=15)㊂沙库巴曲缬沙坦组大鼠每天一次通过管饲法给予沙库巴曲缬沙坦10mg/kg㊂共治疗4周㊂模型组和假手术组给予等体积的生理盐水㊂
1.3.3㊀经胸超声心动图检查
采用无创经胸超声心动图方法评估左心室的形态和功能㊂在麻醉动物中进行超声心动图检查㊂记录左心室收缩末期内径(LVIDs)和左心室舒张末期内径(LVIDd)以及左心室射血分数(EF)和左心室缩短分数(FS)㊂
1.3.4㊀心肌纤维化的测量
给药4周后，收集大鼠心脏，并在磷酸盐缓冲液中洗涤，在4%多聚甲醛中固定过夜，然后包埋在石蜡中㊂将每个石蜡包埋的心脏切成4μm厚的切片，并用MASSON三色染色剂染色㊂每个切片在尼康显微镜下成像，通过Image J软件计算纤维化程度㊂
1.3.5㊀免疫组织化学染色
通过免疫组织化学染色检测α-SMA蛋白的表达㊂将心脏组织切片放在烤箱中烤片20min，然后二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化㊂使用PH9.0的Tris/ EDTA缓冲液进行抗原修复㊂在3%H2O2中孵育10min来封闭内源性过氧化物酶㊂将切片在1% PBS中洗涤3次，每次6min，并在4ħ下与1%牛血清白蛋白中的一抗(1ʒ500稀释)一起孵育过夜㊂将切片用1%PBS洗涤3次，每次6min㊂然后将切片与HRP-聚合物标记的抗兔IgG二抗(1ʒ500稀释)室温孵育1h㊂将切片再次用1%PBS洗涤3次，每次6min，然后用苏木精复染30s㊂使用OLYMPUS BX50数字显微镜㊂在ˑ400放大倍数下观察图像㊂随机选择5个视野进行阳性染色评分，阳性染色评分=阳性细胞计数评分ˑ染色强度评分㊂阳性细胞计数评分如下:<5%为0分,5~25%为1分,5~25%为1分,26~50%为2分,51~75%为3分,>75%为4分㊂染色强度评分如下：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分㊂
1.3.6㊀蛋白质印迹分析
给药4周后，对所有动物实施安乐死，立即收获心脏并保存在液氮中㊂使用RIPA裂解缓冲液裂解组织
㊂通过BCA法测定蛋白质浓度㊂蛋白质通过10%SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上，然后与以下一抗在4ħ下过夜孵育:TGF-β1(1ʒ500)㊁p-Smad3和Smad3(1ʒ500)㊁p-Smad7和Smad7(1ʒ500)㊁TNF-α(1ʒ1000)㊁IL-6(1ʒ1000)㊁Collagen I(1ʒ1000)㊁αSMA(1ʒ500)㊁NF-κBp65(1ʒ1000)㊁p-IκBα(1ʒ1000)和GAPDH(1ʒ1000)㊂将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1ʒ2000)在室温下孵育2 h㊂GAPDH作为内部对照㊂通过ECL法显影并使用Gene Gnome凝胶成像系统捕获生成的图像㊂1.4㊀统计学方法
所有实验数据均表示为平均数ʃ标准差( xʃs)㊂使用统计软件SPSS17.0进行单因素方差分析
(ANOVA)，并通过LSD 事后检验进行多重比较,P <0.05表示差异具有统计学意义㊂
2㊀结果
2.1㊀沙库巴曲缬沙坦改善心力衰竭大鼠心脏结构和功能
注:A-D：依次为EF㊁FS㊁LVIDs 和LVIDd；与假手术组比较,∗P <0.05；与模型组比较,#P <0.05㊂
图1㊀各组大鼠的EF㊁FS㊁LVIDs 和LVIDd
Note.A-D,EF,FS,LVIDs and LVIDd in quence.Compared with sham group,
∗
P <0.05.Compared with model group,#P <0.05.
Figure 1㊀EF,FS,LVIDs and LVIDd of each group of rats
da通过超声心动图评估心力衰竭大鼠治疗后的心脏功能㊂研究显示(图1)，与假手术组相比，模型组大鼠的EF 和FS 显著降低，而LVIDs 和LVIDd 显著升高(P <0.05)㊂此外，与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组的EF 和FS 显著升高，而LVIDs 和LVIDd 显著降低(P <0.05)㊂
2.2㊀沙库巴曲缬沙坦减轻心力衰竭大鼠心肌纤维化
间质纤维化是心梗后心脏重塑的主要特征㊂通过Masson 对间质纤维化进行的三色染色显示(图
2)，与假手术组相比，心肌梗死组的左室壁结扎部分梗死区域边界出现明显的间质纤维化，胶原蛋白染色区域显著增加(P <0.05)㊂此外，与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组的胶原蛋白染色区域显著降低(P <0.05)㊂
图3和图4显示，与假手术组相比，模型组大鼠心脏组织中肌成纤维细胞标志物α-SMA 的表达显著升高(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组α-SMA 的表达显著降低(P <0.05)㊂α-SMA 阳性的肌成
纤维细胞可促进细胞外基质(ECM)的合成㊂本研究检测了Collagen I 的表达，这是心脏成纤维细胞产生的主要胶原蛋白亚型㊂研究显示(图3)，与假手术组相比，模型组的Collagen I 表达显著升高(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组Collagen I 的表达显著降低(P <0.05)㊂
remarkably2.3㊀沙库巴曲缬沙坦抑制心力衰竭大鼠心肌TGF-β1/Smad3信号通路
TGF-β1/Smad3信号通过参与调控心肌梗死后
心肌纤维化的原因，本研究显示(图5)，与假手术组相比，模型组大鼠心脏组织中TGF-β1的蛋白表达以及Smad3的磷酸化水平显著升高，而Smad7的磷酸化水平显著降低(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组TGF-β1的蛋白表达以及Smad3的磷酸化水平显著降低，而Smad7的磷酸化水平显著升高(P <0.05)㊂
2.4㊀沙库巴曲缬沙坦抑制心力衰竭大鼠细胞因子的表达
细胞因子(TNF-α和IL-6)的表达在心脏重塑和心力衰竭中起着关键作用㊂本研究显示(图6)，与假手术组相比，模型组TNF-α和IL-6的蛋白表达显著升高(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组TNF-α和IL-6的蛋白表达显著降低(P <0.05)㊂
2.5㊀沙库巴曲缬沙坦抑制心力衰竭大鼠心肌NF-κB 信号通路
先前的研究表明，促炎细胞因子诱导IκB 的磷酸化和降解，然后诱导NF-κB 从抑制性信号小体中释放出来，转移到细胞核并诱导许多基因的转录，从而导致炎性因子如TNF-α和IL-6的表达㊂本研究显示(图7)，与假手术组相比，模型组NF-κBp65和p-IκBα的蛋白表达显著升高(P <0.05)㊂与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组NF-κBp65和p-IκBα的蛋白表达显著降低(P <0.05)㊂3㊀讨论
心脏重塑是一个复杂的过程，有许多连续和重
chloe zhao
注:A:Masson 三色染色图像;B：胶原染色区域百分比；与假手术组比较,∗P <0.05；与模型组比较,#P <0.05㊂
图2㊀大鼠心脏组织的Masson 三色染色
Note,A,Masson three-color staining image.B,Percentage of collagen staining area.Compared with sham group,∗
P <0.05.
Compared with model group,#P <0.05.
Figure 2㊀Masson trichrome staining of rat heart
tissue
注:A:Collagen I 的蛋白相对表达量;B:α-SMA 的蛋白相对表达量;C:Western blot 代表性条带；与假手术组比较,
∗橙子的英文
P <0.05；与模型组比较,#P <0.05㊂
图3㊀Western blot 检测大鼠心脏组织Collagen I 和α-SMA 的蛋白表达
Note.A,Relative protein expression of Collagen I.B,Relative protein expression of α-SMA.C,Reprentative Western blot bands.Compared with sham group,
∗
P <0.05.Compared with model group,#P <0.05.
Figure 3㊀Western blot detection of collagen I and α-SMA protein expression in rat heart tissues
叠的生物过程[8]㊂在早期阶段，心脏重塑是坏死区域纤维化修复并形成疤痕的结果㊂接下来，重塑过程由存活心肌的结构重排所驱动，包括心肌细胞肥大㊁心肌纤维化以及进行性左心室扩张㊂心肌梗死
后的心室扩张是心脏衰竭的代偿反应之一㊂但是，过度扩张会引起心室收缩和舒张功能障碍，从而导致心力衰竭㊂预防不良的心室重塑对于降低心肌梗死后心力衰竭的发病率和死亡率非常重要㊂已经证实，间质纤维化是心力衰竭后心脏重塑的典型特征，其特征在于细胞外基质(ECM)的过度积累[9]㊂Collagen I 和Collagen III 是最丰富的ECM 成
分㊂在心脏纤维化模型中,Collagen I 比Collagen III 表现出更强烈和更长时间的上调㊂活化的成纤维细胞是纤维化心脏中胶原蛋白的主要细胞来源㊂α-SMA 表达已被广泛用作成纤维细胞分化成活化状态的肌成纤维细胞的标记物[10]㊂在本研究中，我们观察到心肌梗死后心力衰竭大鼠心脏中Collagen I 和α-SMA 蛋白被上调，这两者均通过沙库巴曲缬沙坦治疗得以抑制，这表明沙库巴曲缬沙坦可能通过抑制成纤维细胞活化和胶原生成而具有抗纤维化作用㊂
TGF-β1是一种局部产生的细胞因子，也是组织
