张咪，赵文静，赵亚男，等.盐碱土壤修复菌剂的微生物筛选[J].农业环境科学学报,2022,41（12）：2622-2628.
ZHANG M,ZHAO W J,ZHAO Y N,et al.Microbial screening of saline-alkali soil remediation agents [J].Journal of Agro-Environment Science ,2022,41（12）：2622-2628.
betweenlegs开放科学OSID
高中英语作文常用句型盐碱土壤修复菌剂的微生物筛选
张咪1，赵文静1，赵亚男2，王琦2，张丽霞1*
（1.中农绿康（北京）生物技术有限公司，北京102101；2.中国农业大学，北京100193）
Microbial screening of saline-alkali soil remediation agents
ZHANG Mi 1,ZHAO Wenjing 1,ZHAO Yanan 2,WANG Qi 2,ZHANG Lixia 1*
（1.Sino Green Agri-Biotech Co.Ltd,Beijing 102101,China;2.China Agricultural University,Beijing 100193,China ）
Abstract ：In this study,salt and alkali resistant plant growth promoting rhizobacteria were screened to provide high quality strains for the restoration of saline-alkali soils.The rhizosphere of saline-alkali
plants was sampled to screen the strains with growth-promoting effect,saline-alkaline resistivity,ability to produce exopolysaccharides,and solubilize phosphate and potassium.The final strains were identified
bad on their morphology,physiology,and biochemistry.A sunflower experiment was carried out in saline-alkali soils to investigate
whether the screened strains were effective.Plant growth and soil indexes were collected as indicators.B25and B43were screened and identified as Bacillus megaterium de Bary and Bacillus amyloliquefaciens,respectively.In the sunflower experiment,the plant height,stem diameter,grain weight,ed tting rate,and yield of treatment group were higher than the control group by 1.53%,8.44%,7.23%,3.40%,and 12.37%,respectively.Soil pH was found to be lower by 0.4.The content of the organic matter,total nitrogen,and the available phosphorus and potassium in the soil were reported to be higher by 42.48%,15.04%,41.52%,and 31.13%,respectively.Salt content of the
treatment group was lower by 1.76%.In conclusion,B25and B43have strong ability to produce exopolysaccharides,can promote sunflower growth,and repair saline-alkali soils,while also acting as good quality strains for saline-alkali soil remediation.we were soldiers
Keywords ：growth-promoting bacillus;saline-alkali soil remediation;exopolysaccharide;phosphate solubilizing;potassium solubilizing 收稿日期：2022-11-12录用日期：2022-12-06作者简介：张咪（1991—），女，山东济宁人，硕士研究生，主要从事植物保护研究。E-mail ：*****************通信作者：张丽霞E-mail ：**********************基金项目：北京优秀青年工程师创新工作室项目Project supported ：Beijing Excellent Young Engineer Innovation Studio Project
摘要：为盐碱土壤修复菌剂提供菌种资源，本研究从盐碱地植物根际土壤中筛选具有促生耐盐碱、产胞外多糖、解磷、解钾等能
力的芽孢杆菌，并通过形态、生理生化、分子鉴定确定菌株种类，通过向日葵盐碱地种植试验，考察耐盐碱芽孢杆菌发酵液对植物生长状况和土壤理化性质的影响。本研究从7株促生芽孢杆菌中筛选出两株耐盐碱、产胞外多糖、解磷、解钾的菌株B25、B43，经鉴定为巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在向日葵盐碱土壤种植试验中，增施土壤修复菌剂的处理比常规施肥株高、茎粗、盘粒重、结实率、产量分别增加1.53%、8.44%、7.23%、3.40%、12.37%；土壤pH 降低0.4，有机质、全氮、有效磷、速效钾含量分别增加42.48%、15.04%、41.52%、31.13%，含盐量减少1.76%。巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌具有较强的胞外多糖产生能力，在盐碱土
壤中，促进向日葵生长和改良土壤的效果显著，可用于盐碱土壤改良菌剂的研制。关键词：促生芽孢杆菌；盐碱土壤修复；胞外多糖；
解磷；解钾中图分类号：S156.4
文献标志码：A
文章编号：1672-2043（2022）12-2622-07
doi:10.11654/jaes.2022-1158
目前全世界盐碱化土壤面积已达10亿hm ，我国
盐碱化和次生盐碱化土壤总面积约3.5亿hm 2[1-3]，其中可以改造利用的盐碱土壤面积约1300万hm 2[4]。盐碱地的改良是增加耕地面积、修复耕地生态的重要突破口，治理潜力巨大[5]。相比于化学改良和物理改良，生物修复具有节约能源、高效经济、持久性强、改良效果稳定等优点，是盐碱土改良的重要研究方向[6]。
植物根际促生菌（PGPR ）被越来越多地用于盐碱土壤改良的研究。PGPR 可以通过分泌植物生长激素吲哚-3-乙酸（IAA ），促进植株生长[7]；能够产生胞外多糖，与土壤颗粒形成土壤团聚体，增加土壤的透气性，改善土壤结构[8-11]；还能够解磷解钾，提高土壤养分利
用率[8，10]
。其中，芽孢杆菌生长快、营养需求简单，能
产生抗逆性极强的芽孢，这使得芽孢杆菌制剂批量生产工艺简单，发酵生产成本较低，制剂施用方便且产品储存期长，是一种理想的盐碱土壤修复微生物制剂[12]。
本研究从盐碱地植物根际土壤分离筛选出促生芽孢杆菌，通过液体发酵和平板活性测试筛选鉴定出具有耐盐碱、解磷、解钾、产胞外多糖的菌株，并验证其改善盐碱土壤理化性质、促进向日葵生长等效果。本研究期望为盐碱土壤修复菌剂的研制提供优质菌种资源。
1材料与方法
1.1收集土壤样品
土壤样品取自巴彦淖尔市农牧业科学研究院干
召庙试验基地，选取长势良好的向日葵，挖出向日葵根，轻微振动，以去掉根上松散的土壤，用小刷子轻轻刷下牢固粘附在根表面的土壤，4℃保存。1.2主要培养基
细菌培养采用NA 营养肉汤培养基：牛肉膏3g ，氯化钠5g ，蛋白胨10g ，水1000mL ，pH 7.0。
细菌培养采用LB 固体培养基：胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g ，氯化钠10g ，琼脂20g ，水1000mL ，pH 7.0。
细菌平板培养采用GNA 培养基：葡萄糖10g ，蛋
白胨10g ，牛肉浸膏3g ，酵母浸膏1g ，琼脂20g ，水1000mL ，pH 7.0。
解磷菌的筛选采用无机磷培养基：葡萄糖10g ，
硫酸铵0.5g ，酵母粉0.5g ，钠0.3g ，氯化钾0.3g ，解钾菌筛选采用的培养基：蔗糖5g ，葡萄糖5g ，
硫酸铵0.5g ，酵母粉0.5g ，七水合硫酸镁0.5g ，磷酸氢二钠2.0g ，七水合硫酸铁0.03g ，七水合硫酸锰0.03g ，钾长石2g ，水1000mL ，pH 7.2。
耐盐耐碱菌的筛选采用营养肉汤培养基，在其基
础上调整培养基的含盐量为0.5%、1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%；调整营养肉汤培养基的pH 分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。1.3方法
1.3.1芽孢杆菌分离培养
取植物根际土壤样品10g ，放入90mL 无菌水
中，于30℃、200r·min -1振荡30min 制成土壤液，振荡
混匀后进行梯度稀释，将装有10-4~10-2稀释液的离心
管封好放到水浴锅中，80℃、20min 以杀死绝大部分非芽孢杆菌。水浴后将各个梯度的稀释液吸取100µL 分别涂布于LB 培养基上，每个处理重复3次，
37℃培养。根据观察到的菌落形态挑取不同的单菌落，纯化后将菌液与30%的甘油1∶1混合后保存于菌种管，放入超低温冰箱中。1.3.2产IAA 芽孢杆菌的筛选
将分离纯化后的细菌分别接种于含L-色氨酸
（100mg·L -1）的LB 液体培养基中，于30℃、180r·min -1的摇床中黑暗振荡培养1d ，取50μL 菌悬液滴于白色陶瓷板上，加上50μL Salkowski 比色液（50mL 35%HClO 4+1mL 0.5mol·L -1FeCl 3）。并加入50μL 未接菌的液体培养基与等体积的混合溶液为对照。将充分混合的白色陶瓷板放置于室温避光处，voa常速英语
30min 后观察结果，颜色变红者表示能够产IAA 。1.3.3耐盐碱能力测定
将菌株分别接种到含氯化钠0.5%（对照），1%、
3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%的NA 固体培养基上，划线，35℃培养3d ，观察生长情况，以确定细菌的耐盐程度。
将对数期的菌液以2%的接种量接种于pH 为1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的盛有5mL 营养肉汤培养基的50mL 试管中，32℃，180r·min -1培养24h ，分别测取OD 600值。1.3.4解磷能力测定
在盛有10mL 无机磷培养基的50mL 试管中，接
入2%的1×108-1振荡培养
无机磷含量。
1.3.5解钾能力测定
在盛有10mL 解钾培养基的50mL 试管中，接入2%的1×108CFU ，32℃，180r·min -1振荡培养3d 后，用离心机12000r·min -1，5min 分离菌液，取上清液待测。
用原子吸收分光光度法测钾离子含量。1.3.6菌株产胞外多糖能力
产胞外多糖标注曲线确定：葡萄糖0.100g ，加蒸馏
水溶解并定容至100mL ，精密移取10mL ，再次定容至100mL ，此时终浓度为0.10mg·mL -1。精密吸取葡萄糖标准溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00mL 于10mL 具塞试管内，补充水至2.00mL ，另取一支空管加入2.00mL 蒸馏水作为对照。每管各精密加入60g·L -1的苯酚溶液（新鲜配制）1mL ，浓硫酸5mL ，混匀，放置5min ，60℃水浴加热显色30min ，冷水浴冷却15min 至室温；测定OD 490，以葡萄糖含量为
横坐标，以OD 490
将芽孢杆菌接种至LB 培养基中，37℃、200r·
min -1培养24h ，按照苯酚硫酸法结合标注曲线，比较
测定7株菌的胞外多糖产生能力。取4mL 菌液，加入
2mL 质量分数30%三氯乙酸（TCA ），4000r·min -1离心15min 除去蛋白。收集上清液，加入3倍体积的无
水冷乙醇，沉淀过夜。4000r·min -1离心20min ，收集沉淀物，并用蒸馏水溶解，即为胞外多糖水溶液。测定吸光值OD 490。根据标准曲线，折算出胞外多糖的含量[13]。
snake是什么意思1.3.7菌株鉴定
（1）形态特征
将终筛芽孢杆菌接种到GNA 培养基上，37℃倒
置培养24h ，考察其菌落形态。采用革兰氏染色法，用显微镜查看其菌体形态[14]。
（2）生理生化特性
将终筛芽孢杆菌在GNA 培养基进一步培养后，
根据《伯杰细菌鉴定手册》[13]
中的生理生化检测方法，
对该菌进行生理生化特性测定。
（3）分子鉴定
将终筛两株芽孢杆菌进行基因组DNA 的提取，并分别用引物27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCT⁃CAG-3′）和1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rDNA 片段基因扩增，根据需要结合gyrA 片段基因引物gyrA-42F （5′-CAGTCAGGAAATGCG⁃TACGTCCT
T-3′）和gyrA-1066R （5′-CAAGGTAAT⁃
GCTCCAGGCATTGCT-3′）进一步鉴定到种，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，将所获序列
在NCBI 数据库中进行BLAST 搜索同源序列进行比对，通过MEGA 5.0软件构建系统发育树，结合形态学和生理生化特征确定菌株种属。
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1.3.8对盐碱土壤的改良修复及作物促生作用
将最终筛选的两株菌接种到LB 液体培养基中，
37℃、200r·min -1振荡培养，菌含量≥10×108CFU·mL -1停止发酵，等量混合，获得微生物发酵菌液，作为土壤修复菌剂使用。
于2021年4月—10月在巴彦淖尔市农牧业科学研究院干召庙试验基地进行，供试作物为向日葵，种植前试验地pH 为8.7。试验共设置两个处理，CK ：常规施肥，基肥施二铵375kg·hm -2，50%硫酸钾75kg·hm -2；T1：常规施肥的基础上，施基肥时加入土壤修复菌剂300L·hm -2。
在收获时，测量向日葵株高、茎粗、盘粒重、结实率、产量。检测土壤pH 、有机质、全氮、有效磷
、速效钾、可溶性盐含量。pH 使用PB-10型pH 计测定；有机质采用重铬酸钾容量法测定；全氮采用凯氏法测量；土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；土壤速效钾通过火焰光度计法测定；土壤可溶性盐含量采用电导法测定。
2结果与讨论
2.1产IAA 芽孢杆菌的筛选
经分离培养共筛选出63株芽孢杆菌，经过
Salkowski 比色法测试，筛选出7株产IAA 芽孢杆菌，编号分别是B18、B21、B25、B43、B56、B58、B60。2.2促生芽孢杆菌耐盐性
平板耐盐实验确定7株促生芽孢杆菌均具有良
好的耐盐性，如表1所示，其中B21、B25、B43、B56、B58表现良好，最高可以承受11%的含盐量。B18、
图1胞外多糖含量标准曲线
Figure 1Standard curve of exopolysaccharide content
490
2.3促生芽孢杆菌耐碱性
菌株在不同pH 下的生长情况不同（图2），过酸
或过碱都会在一定程度上抑制细菌生长，以pH 为7时的菌密度为参照判断菌株在不同pH 下的生长情况，7株促生芽孢杆菌在pH 4~8的范围内均长势良好。其中B25、B43、B60的耐碱性良好，其中B25、B60最高可承受pH 为11的碱性培养基，B43最高可在pH 为10的碱性培养基上生长。2.4促生芽孢杆菌解磷能力
将菌体定量接入无机磷液体培养基中，经培养
后，测得可溶磷的含量（表2），其中菌株B25解磷能力最强，显著高于其他菌株，可达到6.8mg·mL -1，B43解磷能力次之，为3.45mg·mL -1。2.5促生芽孢杆菌解钾能力
用原子吸收分光光度计测定发酵液中的全钾含
量，结果见图5，B43发酵液中可溶性钾离子含量最高，为7.82mg·L -1，与B25可溶性钾离子含量无显著差异，这两者都显著高于其他菌株。
测定株菌的胞外多糖含量，结果如图6所示，其中
phubbing
B25、B43两株菌分别可产2232.22、2182.70mg·L -1胞外多糖，这两株菌之间无显著差异，产胞外多糖能力
显著强于其他菌株（P <0.05）。
表1菌株耐盐性比较
B18B21B25B43B56B58B60
*********************
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注：***表示菌株生长良好，**表示菌株长势受到轻微限制，*表示菌株长势明显受到限制，*—代表有菌体生长，但生长受到严重限制，—表示
菌株未在平板上生长。
Note ：***means bacteria grows well ，**the growth of bacteria is verely limited ，—means 图2菌株耐碱比较
Figure 2Comparison of alkali resistance among the strains
王迈迈表2菌株解磷能力比较
Table 2Comparison of phosphate-solubilizing ability among
B18B21B25B43B56B58B60
1.80±0.00Cc
0.61±0.02Dd 6.80±0.06Aa 3.45±0.35Bb 0.41±0.21Dd 1.91±0.01Cc
0.80±0.08Dd
注：同列不同小写和大写字母分别表示处理间差异显著（P <0.05）和极显著（P <0.01）。下同。
Note ：Different lowerca and upperca letters in the same column indicate significant differences among treatments at P <0.05and P <0.01levels ，respectively.The same below.
图5可溶性钾离子含量Figure 5Soluble potassium ion content
可溶性钾离子含量
-1）
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2.7.1B25、B43形态特征
综合上述研究，最终筛选出B25、B43这两株具有
较强耐受性及溶磷解钾能力的菌株进行鉴定。菌株B25在营养琼脂培养基上菌落为圆形，如图7a 所示，开始半透明，后成乳白色，扁平内凹，随时间延长呈浅褐色。菌体如图7b 所示，杆状，末端圆，单个或呈短
链排列。革兰氏阳性，可形成芽孢中生到端生。芽孢从椭圆形到圆形不等。B43菌落如图7c 所示，淡黄色不透明菌落，表面粗糙，有隆起，边缘不规则，革兰氏染色呈阳性；菌体如图7b 所示，杆状，可形成内生芽孢，呈椭圆形，两端钝圆，芽孢囊不膨大。2.7.2B25、B43生理生化特征
将B25、B43菌株在LB 培养基进一步培养后，根
据《伯杰细菌鉴定手册》中的生理生化检测方法，对该
菌进行生理生化特性测定，结果如表3所示。B25接触酶阳性，不能厌氧生长，乙酰甲基甲醇（V-P ）反应阴性。B43V-P 试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，苯丙氨酸脱氨酶试验、吲哚试验均为阴性。
2.7.3B25、B43分子鉴定
B25菌株经PCR 对16S rDNA 扩增得到了一段基
因序列，测序后与NCBI 数据库进行Blast 比对。使用MEGA 5.0软件构建的系统发育树见图8a ，B25菌株
与菌株Bacillus megaterium IAM 13418T 、Priestia mega⁃terium BHS1、Priestia megaterium YB-8B （MT081301.1）和Priestia megaterium FORT 10（MG561340.1）同源性较高，聚为同一分支。结合B25菌株的形态学特征和生理生化鉴定结果，进一步证明B25菌株为巨大芽孢杆菌。
B43菌株经PCR 对16S rDNA 和gyrA 片段基因扩
增得到序列，测序后与NCBI 数据库进行Blast 比对，使用MEGA 5.0软件构建的系统发育树见图8b 和图8c ，B43菌株与模式菌株Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535T 、Bacillus amyloliquefaciens MPA 1034T 、Bacillus amyloliquefaciens BCRC 11601T 和Blast 比对结
果Bacillus amyloliquefaciens pfn41和Bacillus amyloliq⁃uefaciens HZ-6-3聚为同一分支，结合形态学特征和
生理生化鉴定结果，进一步证明B43菌株为解淀粉芽孢杆菌。
已有研究表明，巨大芽孢杆菌具有强大的解磷功
容光焕发
图7B25、B43菌落与菌体形态
Figure 7Morphology of colonies and cells of B25and B43
图6菌株产胞外多糖能力比较
Figure 6Comparison of exopolysaccharide production capacity
among the strains
接触酶Contact enzyme 厌氧生长Anaerobic reaction V-P 反应VP reaction 葡萄糖Dextro 木糖Xylo 甘露醇Manno 明胶Gelatin 淀粉Amylum 柠檬酸盐Citrate reaction
苯丙氨酸脱氨酶Phenylalanine deamina 硝酸盐还原反应Nitrate reduction test reaction
吲哚反应Indole reaction
pH5.7
pH6.8
7%NaCl 生长反应7%NaCl growth reaction +--++++++++-+++++-++++++---+++表3B25、B43生理生化特征
胞外多糖含量
-1）
a b
c
d
