•论著.
座硫平减轻精神分裂症小鼠脑内
胶质细胞增生研究☆
邵园”王建*朱俊*毕建强”冯飞*许海云
【摘要】目的研究I®硫平(quetiapine,QTP)对精神分裂症模型小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的作用，探讨唾硫平抗精神病的受体外药理作用机制。方法48只雄性C57BL/6小鼠分为QTP+铜腺(cuprizone, CPZ)组、生理盐水(normal saline,NS)+CPZ组、QTP组、NS组等4组，每组12只。通过旷场实验评测小鼠的自发活动，用免疫荧光标记的anti-胶质纤维样酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)抗体和anti-钙离子连接蛋白分子-1(calcium bingding adaptor molecule-1,Iba-1)抗体分别检测脑内脐月氐体、皮质和海马CA1区星形胶质细胞和小胶质细胞的数量。结果旷场实验中QTP+CPZ组小鼠总路程比NS+CPZ组减少(P<0.01);NS+CPZ组与NS组相比总路程增多(P<0.05)o QTP+CPZ组和NS+CPZ组比较，脑内GFAP(P<0.05)和Iba-1(P<0.01)阳性细胞均减少;NS+CPZ组与NS组相比，脑内GFAP(P<0.01)和Iba-l(P<0.01)阳性细胞增多。结论QTP能够减轻CPZ诱导的精神分裂症小鼠脑内胶质细胞增生。
【关键词】精神分裂症铜腺唾硫平星形胶质细胞小胶质细胞
【中图分类号】R749.3【文献标识码】A
hiveQuetiapine attenuates the proliferation of gliocyte in cuprizone-induced mice brain.SHAO Yuan,WANG Jiarif ZHU Jun,Bi Jianqiang,Feng Fei,XU Haiyun.Shenzhen Kangning Hospital,ShenZhen Mental Health Center, Shenzhen518000,China.Tel:*************.
[Abstract]Objective This study aimed at examining effects of quetiapine(QTP),an atypical antipsychotic,on the behaviors and brain gliocyte proliferation in cuprizone(CPZ)-induced mice.Methods Forty eight male young(6-weeks old)C57BL/6mice were randomly assigned to four groups:QTP+CPZ,NS+CPZ,QTP and NS groups.The mice first had the diet with or without CPZ(0.2%,w/w)for7days and then receiving injection of QTP(10mg/kg/d)in the saline or sterilized saline(1mL/100g)for additional two weeks.The mice were subjected to the open-field tests one day after the last injection.After sacrifice,their brains were procesd for morphological analys(immunofluorescence staining)»Results CPZ-fed mice traveled a longest total distance(TD)among the four groups(P<0.05),Statistic revealed significant differences between QTP+CPZ and NS+CPZ groups(P<0.01).Mice in NS+CPZ group showed significant increas in the number of GFAP(P<0.01)and Iba—1(P<0.01)positive cells compared to NS group,which was attenuated by QTP.Conclusions Quetiapine can attenuate the gliocyte proliferation by CPZ-exposure.
[Key words]Schizophrenia Cuprizone Quetiapine Astrocyte Microglia
doi:10.3969/j.issn.1002-0152.2020.11.007
☆汕头大学医学院科研启动基金；深圳市医疗卫生三名工程伦敦国王学院项目(编号.SZSM201812052)；广东省自然科学基金(编号: 2020A1515011469)
*深圳市康宁医院老年认知科，深圳市精神卫生中心(深圳518000)
△汕头大学精神卫生中心
®通信作者(E-mail:)
近年有研究提出精神分裂症患者脑内存在星形胶质细胞和小胶质细胞增生激活-2]。唾硫平(quetiapine,QTP)是临床常用抗精神病药。既往认为QTP通过阻断多巴胺受体治疗精神分裂症。最近有研究发现，唾硫平可减轻小鼠脑内胶质细胞增生叫但是，唾硫平治疗精神分裂症的机制是否有减轻胶质细胞增生的作用发挥其中，目前尚不清楚。铜腺(cuprizone,CPZ)暴露1周的小鼠表现出精神分裂症样行为，同时还产生脑内星形胶质细胞、白介素(interleukin-6,IL-6)激活等反应，可作为精神分裂症的动物模型之一-%本研究应用CPZ暴露1周小鼠作为精神分裂症动物模型，研究QTP对小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的作用，为精神分裂症的治疗提供新思路和理论依据。
1材料与方法
材料成型及控制工程考研
1.1动物模型建立及分组SPF级成年健康雄性6周龄C57BL/6小鼠48只，由广东省实验动物中心提供。实验前在汕头大学医学院实验动物中心适应1周。之后小鼠随机分成QTP+CPZ组、生理盐水(normal saline,NS)+CPZ组、QTP组、NS组等4组。实验时每只小鼠腹腔注射QTP(10mg/kg/d，加拿大AstraZeneca公司)或NS(1mL/100g)，连续2周。实验第1周时，所有小鼠均喂食普通饲料。第2周时，小鼠喂食含CPZ(0.2%,w/w，美国Sigma公司)的饲料或普通饲料。QTP、CPZ、NS的剂量根据参考文献及前期研究叫实验动物的操作和处理过程均遵守汕头大学医学院饲养和使用实验动物的相关规定。
tunes怎么读1.2旷场实验应用Noldus动物行为视频跟踪分析系统检测，观察箱长X宽x高=50cmx50cmx 35cm0通过摄像系统记录小鼠在10min内的自发活动。由计算机分析小鼠10min内的总路程、中央路程。
1.3免疫荧光检测GFAP.Iba-1表达用免疫荧光标记的anti-胶质纤维样酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)抗体检测星形胶质细胞的变化，用免疫荧光标记anti-钙离子连接蛋白分子-1(calcium bingding adaptor molecule-1,[ba_])抗体检测小胶质细胞的变化。行为学实验结束后第2天，所有小鼠灌注取脑，冰冻后25pm连续切片，脱水、固定、4七保存。切片取出，PBS洗5minx 3次；30%H2O2和甲醇按1:50混合，室温静置30min,PBS洗5minx3次；0.1%TritonX-100浸泡,4°C10min,PBS洗5minx3次；山羊血清工作液浸泡30min；—抗孵育(兔抗GFAP多克隆抗体，英国Abacam公司；兔抗Ib
a-1多克隆抗体，日本wako公司)，空白对照加PBS,^过夜；室温复温1h,PBS洗5minx3次；加HRP标记的二抗,37X.孵育30min,PBS洗5minx3次；DAB显色3~ 5min.PBS洗片；贴片，常规脱水、透明、封片。用荧光倒置显微镜拍照，采用Image-Pro Plus(IPP) 6.0软件分析免疫荧光图片，分析GFAP和Iba-1阳性细胞的积分光密度(integrated option density, I0D)值。
既往结果显示，小鼠脑内胶质细胞增生主要集中在皮质(cortex,CTX)及海马CA1区叫另外，CPZ选择性损伤脑白质，多集中在脐月氐体(corpus callosum,CC)[8]，因此本研究观察CC、CTX、CA1区GFAP和Iba-1阳性细胞I0D值。
1.4统计学方法采用SPSS17.0进行统计分析。数据采用双因素(QTP用药和CPZ建模两个因素)方差分析主效应和交互效应，用Fisher's LSD法进行两两比较。检验水准a=0.05，双侧检验。
acth2结果
2.1小鼠自发活动对于旷场实验总路程，双因素方差分析显示QTP(F=22.88,P<0.01)和CPZ(F= 7.19,P=0.01)主效应均有统计学意义，两因素之间没有交互作用(F=2.11,P=0.16)。两两比较显示，QTP+CPZ组比NS+CPZ组总路程减少(P< 0.01),NS+CPZ组小鼠总路程比NS组增多(P< 0.01)，差异有统计学意义。见表1。
饼干英文对于中央路程，QTP主效应(F=1.36,P= 0.26).CPZ主效应(F=0.29,P=0.59)以及两者交互作用(F=3.99,P=0.06)均无统计学意义。对于中央路程/总路程，QTP主效应(F=0.34,P=0.57)、CPZ
主效应(F=0.04, P=0.84)以及交互作用(F=2.42, P=0.14)均无统计学意义。见表1。
2.2小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞激活对于
GFAP 阳性细胞，在CC 区，QTP 与CPZ 交互作用 无统计学意义(F=3.97,P=0.06),QTP 主效应(F=
6.58,P=0.02)和 CPZ 主效应(F=46.84,P<0.01)有 统计学意义。两两比较显示，QTP+CPZ 组与NS+
CPZ 组相比(P=0.04),NS+CPZ 组与NS 组相比
(P<0.01)，差异有统计学意义。在CTX，交互作用
(F=9.09 ,P=0.01)、QTP 主效应(F=7.48 ,P=0.01)
和CPZ 主效应(F=21.94,P<0.01)均有统计学意
义。在CA1区，交互作用(F=7.88，宀0.01)、QTP 主
效应(F=11.01,P<0.01)和 CPZ 主效应(F=29.76, P<0.01)均有统计学意义。两两比较，在CTX 和 CA1区均显示，QTP+CPZ 组与NS+CPZ 组相比小傻瓜英文
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(P<0.01),NS+CPZ 组与 NS 组相比(P<0.01)，差异
有统计学意义。见图1及表2。
对于Iba-1阳性细胞，在CC 区，两因素交互 作用(F=29.97 ,P<0.01)、QTP 主效应(F=23.83 ,P<
0.01)和 CPZ 主效应(F=140.88,P<0.01)均有统计
学意义。在CTX 区，交互作用(F=9.02,P=0.01)、 QTP 主效应(F=9.02,P=0.01)及 CPZ 主效应(F=
43.45,P<0.01)均有统计学意义。在CA1区，交互
作用(F=20.00,P<0.01)、QTP 主效应(F=21.23 ,P<
表1隆硫平和铜腺对小鼠自发活动的影响
组别
71
总路程(m)中央路程(in)中央路程/总路程
QTP+CPZ 组1236.09±4.171) 4.91±1.540.14±0.05NS+CPZ 组12
47.82±5.102) 6.88±3.570.19±0.05
QTP 组
1240.93±4.02
6.31±2.29
0.18±0.07NS 组12
41.20+4.93 6.80+2.26
0.16+0.04
1)与NS+CPZ 组比较，经LSD 法检验,P<0.01 ； 2)与NS 组比较，经LSD 法检验,P<0.01 …
图1各组小鼠脑内GFAP 阳性细胞表达(100x) A 为CC 区，B 为CTX 区，C 为CA1区。免疫荧光
。
0.01）和CPZ主效应（F=111.42,P<0.01）均有统计学意义。两两比较显示，在CC、C1X、CA1区,QTP+ CPZ组比NS+CPZ组减少（P<0.01）,NS+CPZ组比NS组增加（P<0.01）o见图2及表3。3讨论
本研究发现，CPZ暴露1周增加C57BL/6小鼠的自发活动，同时小鼠脑内胶质细胞增生明显。
表2哇硫平和铜腺对小鼠脑内GFAP阳性细胞IOD值的影响
组别n CC CTX海马CA1 QTP+CPZ组12 3.46±0a) 2.31±0.293) 3.69±0.133) NS+CPZ组12 3.60±0.101) 2.81±0.14】) 3.94±0.081) QTP组12 3.13±0.14 2.00±0.45 3.54±0.07
NS组12 3.06±0.06 2.00±0.18 3.57±0.13 1）与NS组比较，经LSD法检验,P<0.01；2）与NS+CPZ组比较，经LSD法检验,P<0.05；3）与NS+CPZ组比较，经LSD法检验,P<0.01o
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图2各组小鼠脑内Iba-1阳性细胞表达（100x）A为CC区，B为CTX区，C为CA1区。免疫荧光。
表3隆硫平和铜腺对小鼠脑内Iba-1阳性细胞IOD值的影响
组别n CC CTX海马CAI QTP+CPZ组12 4.40土0.06】)2) 1.76±0.02D2) 3.44±0.081)2) NS+CPZ组12 4.66±0.03】) 1.80±0.03!) 3.65±0.061) QTP组12 4.52±0.05 1.73±0.02 3.19±0.12
NS组12 4.38+0.03 1.71+0.03 3.21±0.06 1）与NS组比较，经LSD法检验，/><0.01；2）与NS+CPZ组比较，经LSD法检验,P<0.01。
并发现座硫平能改善小鼠的行为学改变，具有减轻CPZ诱导胶质细胞增生的作用。这提示唾硫平减轻脑内胶质细胞增生可能是其受体外的作用机制之一，为精神分裂症治疗带来了新的靶点和理论依据，具有重要意义。
本研究旷场实验结果显示，小鼠经CPZ暴露1周后总路程增加，提示小鼠自发活动增多。既往也有研究表明，CPZ暴露的小鼠可能存在中枢神经系统多巴胺系统激活％但是TEZUKA等W]研究显示CPZ暴露1周的C57BL/6小鼠自发活动无明显变化。两项研究实验方法仅敞箱大小及实验时间不同:TEZUKA等內研究中敞箱大小为45.5cm x25cmx35cm，实验时间5min；本研究的敞箱大小为50cmx50cmx35cm，实验时间10min o这可能是实验结果不一致的原因，但需要进一步研究验证。不过这提示CPZ暴露小鼠其自发活动具有动态变化的特征，这与精神分裂症患者的症状复杂性一致，有的患者表现易激惹、活动多，有的却表现淡漠、懒语少动㈣。QTP+CPZ组与NS+CPZ组小鼠相比，自发活动减少，提示QTP可以缓解CPZ诱导的自发活动增多。
本研究还显示，CPZ暴露1周引起小鼠脑内CC、CTX、海马CA1区的星形胶质细胞和小胶质细胞增生，这与TEZUKA等內的研究结果一致。也有其他研究表明CPZ暴露引起神经胶质细胞的激活阿。更重要的是，本研究发现，座硫平在减轻CPZ诱导小鼠脑内胶质细胞增生的同时，还改善TCPZ诱导的自发活动增多。既往研究表明，座硫平通过促进星形胶质细胞释放脑源性神经营养因子来预防A025-35诱导的神经元细胞死亡问，因此推测，QTP具有减轻脑内胶质细胞增生作用，可能通过此作用改善CPZ暴露小鼠的异常行为。但是本研究尚不能明确其因果关系，后续研究将对其进一步验证、完善。
需要指出的是，脑内星形胶质细胞和小胶质细胞功能复杂，参与炎症反应等很多过程。既往有研究表明，CPZ模型小鼠脑内星形胶质细胞增生激活，并释放大量IL-6JL-1|3等炎症因子问。小胶质细胞释放
的炎症因子在多发性硬化网、精神分裂症画等疾病中具有重要意义。可见，星形胶质细胞和小胶质细胞激活在一定程度上可反映神经炎症反应，但不能完全等同。遗憾的是，本研究未进行脑内相关炎症因子的检测。后续将对此进行深入研究，进一步验证精神分裂症胶质细胞增生与免疫炎症假说之间的关联。
本研究没有进一步探讨QTP减轻脑内胶质细胞增生的作用机制，但是QTP的药理作用和本课题组既往研究问可以提供一些线索。QTP通过抑制核因子-k B(nucleus factor kappa B,NF-k B)途径减弱APP/PSI转基因小鼠的神经胶质细胞激活和促炎细胞因子升高阿。另一个可能的作用机制是,QTP通过抗氧化作用发挥减轻胶质细胞增生的作用。有研究表明，小鼠脑内胶质细胞增生与氧化应激反应有密切的关联呵。本课题组既往研究也发现,CPZ暴露使脑内抗氧化物酶活性下降，表明出现氧化应激反应问。本研究小鼠经同样处理后表现出脑内胶质细胞增生。可认为CPZ暴露的小鼠线粒体氧化应激和胶质细胞增生可能存在因果关系。既往也有研究表明氧化应激可以激活氧化还原反应及NF-k B，而NF-k B可促进胶质细胞增加炎症介质的表达闻。因此推测，QTP可能通过抗氧化作用改善CPZ短期暴露所致的胶质细胞增生。
QTP减轻胶质细胞增生的作用为精神分裂症治疗提供了新方向，对精神疾病研究具有重要意义。后续研究将观察脑内胶质细胞增生与精神分裂症的关联，以及座硫平减轻胶质细胞增生的作用机制，为精神疾病临床治疗提供更全面的帮助。
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