论著•DOI：10.3969/j.issn.1672-7770.2021.03.013"
脐血间充质干细胞外泌体对APP/PS1小鼠
海马神经元的保护作用及其机制
王涵，刘卫平，龙乾发，李俊辰，黑悦，刘宇琪，季丞
!摘要】目的研究脐血间充质干细胞外泌体（MSC-7XO）对阿尔茨海默病（AD）小鼠海马神经元的保护
作用及其机制。方法将20只APP/PS1小鼠随机分为ADv saline组和AD+EXO组，每组10只；将10只野生
型C57小鼠作为正常对照组）AD+EXO组小鼠经尾静脉注射EXO悬液,AD+saline组和对照组小鼠注射等体
can you feel that
积的生理盐水）30E后取脑，用免疫组织化学染色检测脑内A"负荷，尼氏染色检测神经元的数量及尼氏小体,
透射电子显微镜观察海马神经元的超微结构,Western bit检测海马N92、Ke：l及HO-1的表达量）结果与
对照组相比,AD valine小鼠脑内有大量A"沉积,A"阳性面积明显增多，海马DG区神经元数量减少&P<
0.01）+并且海马神经元的线粒体出现明显肿胀、空泡化等损伤表现）与AD+saline相比,AD+EXO小鼠皮层与
海马组织的A"负荷降低，海马DG区的神经元数量显著增多&C<0.05），线粒体水肿、空泡化减轻）与对照组
相比,AD+-line组小鼠海马N9、HO7蛋白的表达量升高,Ke：l蛋白的表达量降低（均P<0.05）；而AD+
EXO组与AD+saline组相比,N92和HO7蛋白的表达量降低,Ke：l蛋白的表达量升高（均C<0.05）。结论
MSC-7XO可能通过调节N9/Kepl通路，而发挥对APP/PS1小鼠海马神经元的保护作用）
!关键词】阿尔茨海默病+海马组织+APP/PS1小鼠；外泌体；间充质干细胞
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中图分类号】R651；Q421［文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2021）037299-06 Neuroprotective effect of umbilical cord blood menchymal stem cell-derived exosomes on
APP/PS1mice and its possible mechanism WANG Han,LIU Wei-ping,LONG Qian-fa,et al. Department of Neurosurgery,First"fi—ated Hospital of Fourth Military Medical University,Xian
710000,China
Correspooding author:LIU Wei-ping
Abstraci:Objective To study the protective effect of umbilicai cord blood menchymai stem
celi exosomes（MSC-EXO）on hippocampai neurons of AlzheimerO diesa（AD）mica and iis mechanism.Methods Twenty app/PS1mica were randomiy divided inte AD+saline group and
AD+EXO group,with10mica in each group.Ten wild-type C57mica were ud aa noanai control
g ooup.Th=m ca cn AD+EXOgooup wo cn.aed wceh EXOauap=nacon iclelciicn,lnd eh=mca=
in AD+saline group and canhol group weo injected with the same volume of normai saline.After
30daya,the braic waa taken ou and the expression of A"in braic waa detected by immunohistochemisto The numbeo of neurona and Nissl bodiea wero detected by Nissi staining.
Th=uieoaaeouaeuo othcppoaampain=uoonawaaobaovd byeoanamc a con=iaeoon mcaooaaop=.Th=
exp^osiona of Nrf2,Kedpl and HOE wero deleted by Western blcO.Results Compared with
controO group,AD+saline mica had a laroe number of A"deposition.A"The positive ard incread signincantiy and the numbeo of neurons in DG n decreed signincantiy（P<0.01）.The mitochondric of hippocampai neurons showed obvious swelling and vvcuolation.Compared with AD+
saline,the A"of cortex and hippocampus in AD+EXO mica decread.The numbeo of neurons i
DG are of hippocampus1.0X11signnlcantly（P<0.05）,and mitochondriai edema and vvcuolation 基金项目：国家自然科学基金重大仪器项目（81627806）；西京医院军事医学提
升计划（2016TSB021）+西京医院学科助推计划（XJZT19MJ22）
作者单位：710000西安（空军军医大学第一附属医院神经外科（王涵（刘卫平，
李俊辰（黑悦（刘宇琪（季丞）+西安市中心医院神经外科（龙乾发）
通信作者：刘卫平,E-maii：liuwp@fmmu.edu
decread.Compared with control group,the expressions of N92and HO-1protein in hippocampus of AD+saline group were incread,while the expression of Keapl protein was decread(：i P< 0.05).Compared with AD+saline group,the expression of Nrf2and HO-1protein in AD+EXO group was decread,whiie the expression of Keapl protein was incread(H P<0.05).Conclusion MSC-EXO may protect hippocampai neurons of APP/PS1mica by regulating NO2/Kapl pathway.
Key words:AlzheimeOs dia;hippocampus; menchymal stem celis
阿尔茨海默病(AlzhCmSs dia,AD)是一种
隐匿起病的进行性神经退行性疾病，目前机制尚不清楚；虽然在AD的研究方面已投入巨大，但仍然缺乏有效的预防及治疗措施⑴2-。间充质干细胞(menchymai stem celi,MSC)具有抗炎、免疫调节、
血管生成、清除病理蛋白以及基质重构等功能[3])
而间充质干细胞外泌体(menchymai stem celi-derived exosome,MSC-EXO)不仅具有与间充质干细胞相似的功能，并且具有更好的安全性⑷)本研究
以APP/PS1小鼠作为AD的疾病模型，给予尾静脉注射MSC-EXO处理，通过免疫组织化学染色观察小
鼠脑内淀粉样蛋白(amyloid"-protein,A")的沉积，并通过Nissl染色观察海马组织的神经元数量；并对NF-E2相关因子(nuclear factor-erythroid2-related factor2,Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1 (kelch-like ECH-essociated peotein-1,Keap1)及血红素氧合酶1(heme oxyyena-1,HO-1)蛋白的表达水平进行检测；以探讨MSC-EXO对海马神经细胞的保护作用及其机制，为AD的治疗提供一种新的思路。
1材料与方法
1-1材料
1.1.1实验动物SPF级APP/PS1雄性小鼠以及
年龄匹配的野生型C57BL/6小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006)，饲养于空军军医大学动物中心，生产许可证号：SCXK(陕)2019-001；小鼠在12：12白昼交替的
环境中自由饮食饮水。本研究方案得到空军军医大
学动物伦理委员会的批准。diary的复数
1-1.2主要试剂间充质干细胞专用培养基(友康恒业生物科技有限公司)；4，,6-二眯基-2-苯基H引嗥(DAPI)(Sigma,D9542-10MG)；兔抗ACTB(Abclonai, AC026)；兔抗Nrf2(Abmart,T55136S)；兔抗keap1 (Proteintech,10503-2-AP)；兔抗HO-1(Proteintech, 10701-1-AP);6e10抗体&Biolegend,SIG-39320)；辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠(Thermo Fishee Scientific,
A16078)，辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔(Thermo APP/PS1tranenic mid;exosome;
Fishee Scientific,A16096),CD9单克隆抗体(Abcam, S92726);TSG101单克隆抗体(Abeam,S125011); Alexo FlourTM594C5Maleimide(Invitrogen,A10256)) 1.2方法
1.2.1MSC培养及外泌体(exosome,EXO)分离、鉴定本课题组前期已形成成熟的MSC培养和EXO 分离与鉴定的方法[5])使用干细胞专用培养基培养间充质干细胞，细胞融合至80%时，更换无血清培养基继续培养24~48h，收集细胞上清，于-80q冻存备用，或者直接进行EXO的分离。采用超速离心法在4q下进行EXO的分离，依次300gmin离心10min、2000g/min离心10min、10000g min离心20min去除细胞及细胞碎片，100000g/min离心70min得沉淀，PBS重悬；再次100000g/min离心70min，沉淀以100&L PBS重悬，-80°C保存。采用蛋白质免疫印迹法检测EXO的表面标志物CD9和TSG101，电子显微镜(电镜)观察EXO的形态。
1.2.2EXO的标记与示踪按本课题组前期研究的方法,6-。将Alexo Flour™594C5Maleimide加入EXO悬
液中，避光常温孵育1h;EXO旋转柱(MW3000,Invitrogen)中的树脂粉末在常温下水化15-30min，离心去除多余的水分，将旋转柱放入1.5mL离心管中，孵育完毕的EXO加入树脂中，750g离心5min，收集标记的MSC-EXO。将标记的MSC-EXO通过尾静脉注射入APP/PS1小鼠体内，24h后麻醉小鼠，灌注取脑固定，行免疫荧光染色，用共聚焦显微镜对小鼠大脑切片进行观察拍照。1.2.3动物分组及处理将20只培养至9个月大的APP/PS1小鼠随机分为模型组(AD+saline)和治疗组(AD+EXO)，每组10只；将年龄匹配的10只野生型c57小鼠作为正常对照组。治疗组小鼠通过尾静脉注射50&g/150&L EXO悬液,AD+saline组和对照组小鼠注射等体积的生理盐水。30d后，每组4只小鼠直接取海马组织做免疫印迹实验，每组3只小鼠4%多聚甲醛灌注后取海马行免疫组化染色，每组3只小鼠取海马用4%戊二醛固定后电镜下观察。
1-2.4蛋白质免疫印迹法3组小鼠在注射EXO
或生理盐水后30 E 处死，于冰上快速剥离海马组织，加 入RIPA 裂解液，超声裂解后，12 000 9min 离心 10 min ，取上清液进行BCA 定量，然后加入上样缓冲
液,95 °C 加热10 min ，制备蛋白样品。10%琼脂糖凝胶 电泳&SDS-PAGE ）分离蛋白,300 mA 恒流转膜2 h ,5% 脱脂奶粉封闭2h o TBST 缓冲液洗膜,4 C 下一抗孵育 过夜；次日复温1 h,TBST 洗膜，常温下二抗孵育2 h ,
学粤语
加入发光液于发光仪中曝光。用Image Lab 分析条带。 1.2.5免疫组化和免疫荧光染色 小鼠麻醉后用 4%多聚甲醛灌注，剥离脑组织置于4%多聚甲醛溶
液中固定，石蜡包埋，切片（厚度4〜10 &m ）。将切 片依次浸入二甲苯及梯度乙醇中进行脱蜡和水化；
之后放入枸椽酸缓冲液中沸水浴100 s 进行抗原修
复；在3%的过氧化氢溶液中室温孵育30 min , TBS 冲洗3次；二抗来源的血清室温下封闭1 h ，加一抗
在湿盒中孵育过夜；次日用TBS 冲洗切片，室温下孵
育二抗2 h （免疫组化用HRP 偶联的二抗，免疫荧光
用Alex 488偶联的二抗）。免疫组化染色：二抗洗涤
后,DAB 显色，自来水终止；苏木素复染30〜60 s ，水
洗后用1%盐酸乙醇分化，自来水返蓝，脱水固定封 片。免疫荧光染色：二抗洗涤后,DAPI 染色10 min ,
洗涤后，封片。在显微镜下观察切片，并采集图像。
1.2.6透射电镜观察 取脑剥离海马组织，浸泡在
spl4%戊二醛固定液中将海马切成组织块（1 mm X 1 mm x 2 mm ），继续在4%戊二醛溶液中固定24 h ,
PBS 缓冲液冲洗;1%娥酸中后固定，漂洗；梯度乙醇及
丙酮脱水；依次使用不同比例的丙酮与包埋剂进行渗 透；使用812树脂进行包埋，将包埋板放入恒温干燥箱
中37 C 4 h 、45 C 6 h 、60 C 12 h 依次干燥后，进行超 薄切片，片厚50〜100 nm ；醋酸双氧铀和柠檬酸铅分别
染色30 min 、10 min ，蒸憎水漂洗，干燥，电镜下观察。1.2.7 尼氏染色（Nissl staining ） 取材及石蜡包
埋、切片等步骤同上。石蜡切片依次在二甲苯和梯
度乙醇中脱蜡和水化，用1%焦油紫溶液染色 20 min ，蒸憎水清洗切片，用70%乙醇分色，之后梯
度乙醇脱水，固定封片，显微镜下观察。
1.3统计学方法 采用SPSS24.0软件对数据进行
统计分析。计量资料用均值土标准差（%±8表示， 组间均数比较采用单因素方差分析；以C <0.05为 差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1间充质干细胞及EXO 鉴定、示踪 流式细胞
仪检测培养的间充质干细胞的表面标志，发现其高 表达干细胞及基质细胞标记CD29、CD90、CD44，阳 性率均在90%以上，低表达造血干细胞及内皮细胞
标志CD34和CD45，阳性率均低于2% （图1 ）。免 疫印迹检测结果显示,EXO 表面标志蛋白TSG101、
CD9呈阳性；电镜观察MSCPXO 为类圆形双层膜囊
泡状结构，呈盘状或茶托状，膜结构完整，直径在30〜
150 nm 之间，具有EXO 的典型特性。对给予A549标
记EXO 的小鼠脑组织进行NeuN 免疫荧光染色，电镜
下被NeuN 标记的神经元为绿色。结果显示，海马区
神经元中出现红色荧光，表明MSCPXO 经尾静脉注 射后，可通过血-脑屏障进入海马神经元。
2.2 3组小鼠海马及皮层的A "阳性面积 免疫组
化染色后细胞核为蓝色，神经元内或胞外组织间隙
中存在的棕黄色或棕褐色颗粒及斑块即为A "免疫
染色阳性反应。结果显示,AD +saline 组小鼠海马
及皮层的A "阳性面积比对照组小鼠明显增多,
A ： MSC 表面标志物鉴定；
B ：免疫印迹检测MSCPXO 特异性表面标记CD9和TSG101;
C ：电镜观察MSC-PXO （ x 43 000）;
D ：MSC-PXO 示踪（NeuN 免疫荧光染色，x 400）
图1 MSC 及MSC-EXO 的鉴定、示
踪
AD+EXO 组小鼠海马及皮层的A"阳性面积较
AD + saline 组小鼠减少（图2 ）。
officially2.3 3组小鼠海马DG 区神经元数量比较 见图
3O Niss l 染色显示，对照组小鼠海马DG 区神经元排 列整齐均匀，胞内尼氏小体丰富，未见明显的神经元
缺失。AD + saline 组小鼠海马DG 区的神经元数量
减少，胞内尼氏小体大量脱失;DG 区细胞层厚度与对
照组相比显著减小（C <0.01 ）。AD+ EXO 组小鼠海马 DG 区的神经元数量较AD + saline 组增多,DG 区细胞
层厚度与AD + saline 组相比显著增厚（C <0.05）。
2.4 3组小鼠海马神经元线粒体的改变与对照
组小鼠相比,AD + saline 组小鼠海马神经元的线粒
体出现肿胀、空泡化、悄结构改变等现象；而AD + EXO 组小鼠海马神经元的线粒体仅有轻微肿胀,#
结构也近乎正常（图4 ））
bbc
2.5 3组小鼠海马N92、Keap1及H0-1表达量比较
见图5。与对照组相比,AD+ saline 组小鼠海马组织
的N02、H0-1蛋白表达量显著升高，而Keap1表达量
显著降低（均C < 0. 05 ）o 与AD + saline 组相比, AD+EXO 组小鼠海马组织的NO2、HO-1蛋白表达量
显著降低，而Keap1表达量显著升高（均P<0.05）o
3讨论
AD 是以认知障碍、记忆障碍、人格和行为改变
为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病：7-
，已 被世界卫生组织认定为全球公共卫生重点疾病。据
报道,1990年至今中国AD 的患病率约为3.4%，预 计到2050年中国AD 患者将达到2010年的2. 52
倍。目前AD 的治疗以对症处理为主［8-
，但临床效
果不佳，亟待研发新的治疗思路和手段。
随着再生医学的发展，间充质干细胞越来越受到
重视，因其不仅有免疫原性低、成瘤性低的特性，还能
发挥免疫调节、抗炎作用，且具有多向分化潜能，可
以预见其在治疗AD 方面有着良好的前景〔9
一
13
研
naive
AD+saline
AD+EXO
A B
D E F
A 、8、C ：免疫组化染色x40； D 、E 、F ：免疫组化染色x 100
图2 3组小鼠海马区的A #阳性面积
AD+saline
AD+EXO
naive
30(
Q
B
' A
111
naive AD+saline AD+EXO
离乱A ：神经元的形态和数量（Niss l 染色，x30, x400 ）； 8：细胞层厚度比较（*与AD+saline 组比较C<0.05 ； **与对照组比较C<0.01）
图3 3组小鼠海马DG 区神经元的数量、形态及细胞层厚度比较
AD+EXO
42 KD
68 KD
70 KD
P-actin
NRF2
KEAP1
(<
d a
-=5u
%) jo
u o w s
fD
Jdxo
启
B O J d
A 、8、C ： x8 200； D 、E 、F ： x 16 500)bring的过去式和过去分词
图4 3组小鼠海马区神经元线粒体电镜观察
A ：蛋白免疫印迹实验；8蛋白表达水平半定量分析 图5 3组小鼠海马组织的N"2&Keapl 及HON 表达量比较
究表明，间充质干细胞通过旁分泌的方式发挥作
用：⑷，可分泌包括生长因子、集落刺激因子、神经源 性营养因子在内的多种生物活性物质。EXO 作为
细胞分泌的囊泡状结构，不仅携带有丰富的生物活
性物质等，无成瘤风险，更易保存和运输，在多种神
fdd经退行性疾病的治疗研究中已显现出很好的疗
效：15，16-，但在AD 的治疗应用研究报道较少。
目前的研究报道,AD 的发病原因除了比较公认
的A"蛋白的生成和代谢紊乱假说之外,Tau 蛋白异 常磷酸化、氧化应激和自由基损伤、神经炎症、胆碱能
假说等也在AD 的发生发展中起到了十分重要的作
用口卩18- o 本研究主要针对AD 的A"异常堆积的病
理机制及氧化应激和自由基损伤假说进行探讨。
本研究采用免疫组化技术对APP/PS1小鼠脑内
的A"沉淀进行检测，结果显示经MSC-EXO 处理H
AD 小鼠脑内的A"沉积明显减少；表明MSC-EXO 减
少了 A"蛋白在小鼠脑内的聚集。并采用尼氏染色
对3组小鼠海马DG 区神经元进行观察，显示与对照
组相比,AD+saline 组小鼠海马DG 区神经元尼氏小
体大量缺失，神经元密度明显降低，而AD+EXO 组
小鼠海马DG 区神经元则缺失明显减少。这与本研
究前期的实验结果，即MSCs-EXO 可以靶向修复神经 元并促进损伤脑组织中的神经元再生：19：相一致；最
近的研究结果也证实了这一点,20-o 这些研究结果表
明MSCs-EXO 可能在AD 早期发挥延缓发病的作用。
在AD 发病过程中，氧化应激作为发病中的关
键一环，可导致神经元突触膜及树突棘的氧化损伤，
影响突触可塑性，进而导致认知功能障碍。氧化损
伤还会导致包括能量代谢在内的多种生理过程的酶
活性的改变，造成神经元损伤。Nrf2/Keap1是重要
的氧化应激信号调节通路，在维持体内的氧化物和 过氧化物平衡方面发挥着十分重要的作用：21-o 前 期研究已证明，在癫痫小鼠模型中MSC-EXO 可以改
善炎症诱导的星形胶质细胞转化；此过程就涉及了 N92/Keap1通路⑸)本研究发现MSC-EXO 可调控
氧化应激相关N92/Keap1信号通路；推测MSC-EXO
可能是通过调控N92/Keap1信号通路影响线粒体氧
化应激，以达到改善神经元和认知功能的作用。
此外，氧化应激会损伤线粒体膜，造成线粒体的 形态损伤和功能失调。线粒体级联损伤在AD 发病 过程中也发挥着十分重要的作用,22-o 本研究通过电
镜观察发现,AD+saline 组小鼠海马神经元线粒体有 明显损伤，而经EXO 处理的AD + EXO 组小鼠海马神
经元线粒体损伤则明显减轻。这也进一步佐证了 MSC-EXO 可能通过改善氧化损伤发挥治疗作用。
总之，本研究结果表明MSC-EXO 在修复AD 的
神经元损伤方面有良好的效果；因此，MSC-EXO 未
来可能为AD 的临床治疗提供新的途径。
[参考 文 献]
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