广东医学2020 年丨丨月第 41 卷第 22 期Guangdong Medica丨Journa丨Nov. 2020, Vo丨.41，No. 22•2279 •
米诺环素对缺血性脑卒中血脑屏障重塑的
语音教学影响及其机制$
李蕊蕊、林园凯\张格\李姣' 黄薇园1A
海南省人民医院（海南医学院附属海南医院）1放射科，2病理科（海南海口570311 )
【摘要】目的探索米诺环素（minocycline, MC)对大鼠局限性脑缺血再灌注后血脑屏障（W ood -brain bairier，BBB)重塑及神经保护的作用机制及影像可视化方法48只SD大鼠随机分为4组：早期给药组、晚英语作文 我的家庭
期给药组、生理盐水组及假手术组，每组12只其中早期给药组于手术后即刻尾静脉注入MC(3 mg/kg)；晚
期给药组于拔线后恢复再灌注6丨1后大鼠尾静脉注入MC(3 mg/kg)；生理盐水组于再灌注即刻注入相同
体积
的生理盐水；假手术组除了不插入线栓外，其余处理同生理盐水组:，再灌注24 h后进行神经功能评分，并采
用HE、免疫组化、Western blot、免疫荧光及磁共振成像等方法观察MC对脑缺血再灌注后BBB重塑的影响及
喝咖啡睡不着怎么办影像学改变.结果缺血再灌注24 h后各组神经功能缺损评分差异有统计学意义（/^〈O.OOl)，其中生理盐
水组神经功能缺损评分高于给药组；早期给药组神经功能缺损评分低于晚期给药组：磁共振图像显示各组
最终梗死体积差异有统计学意义（P <0.001):，早期给药组及晚期给药组梗死体积显著小于生理盐水组，早
期给药组小于晚期给药组，假手术组未显示梗死灶。给药组脑组织中肿瘤坏死因子-a( TNF - a)、白细胞介stahl
素（IL) -i p、CDl II)的表达低于生理盐水组，且早期给药组低于晚期给药组；给药组脑组织中转化生长因子-p
(T G F-p)、IL- I0、YM1、R E C A-1、P D G FR-p的表达高于生理盐水组，且早期给药组高于晚期给药组.■给
药组血清中IL-1(3、I L-6和TM F-a含量低于生理盆水组，且早期给药组低于晚期给药组Western blot结
果显示给药组I l.-i p、基质金属蛋白酶-3(M M P-3)、T N F-a的表达低于生理盐水组，且早期给药组低于
晚期给药组；给药组claudin -5、occludin、Z0 -丨、IL - 10、TGF - (3和YM1的表达高于生理盐水组，且早期给药
组高于晚期给药组结论MC可有效减轻缺血再灌注损伤促发BBB重塑，立即给药对神经功能障碍的改善
作用更明显。
【关键词】米诺环素；血脑屏障；缺血性脑卒中；磁共振
【中图分类号】R978. 1+4;R743.3 【文献标志码】A
DOI ： 10. 13820/j. cnki. gdyx. 20200140
Effect of minocycline on remodeling of blood - brain barrier in ischemic stroke and its mechanism. U R u i-
rui, LI I S Yuan -k a i, ZHANG Ge, L! Jiao, HUANG Wei - yuan. Department o f Radiotherapy^ Hainan General Hospital {Affiliated Hainan Hospital o f Hainan Medical University), Haihou570311 , Hainan y China
Corresponding author：HUANG Wei - yuan ^E - m ail：weiyiuinhuang@163. com
【Abstract】Objective To investigate the effect of minocycline ( MC) on remodeling and protecting of the blood —
brain banier ( BBB) in focal cerebral ischemia - reperfusion and its mechanism in rats. Methods Forty - eight SD rats
were randomly divided into 4 groups, early administration group, late administration group, saline group, and sham opera
tion group. The effect of MC on B B B remodeling after cerebral ischemia - reperfusion and MR images changes were ob深圳瑜伽学习班
rved by HE, inimunohistochemistry, Western blotting, immunofluorescence and magnetic resonance imaging. And neu
rological function scores were evaluated after 24 hours of reperfusion. Results There was a significant difference in the neurological deficit score among the three reperfusion groups 24 hours after ischemia — reperfusion (P <0. 001 ) ；in which
the neurological deficit score in the saline group was higher than the administration group. The neurological deficit score in
the early administration group was lower than that in the late administration group. Magnetic resonance images showed that
there was a significant difference in the final infarct volume among the three groups (P <0. 001 ). The infarct volume of
the early administration group and late administration group was significantly smaller than that of the
saline control group；
and that of the early administration group was smaller than that of the late administration group. There was no infarc t in the *
*基金项目：国家自然科学基金资助项目（81660285)
△通信作者：黄薇园，副主任医师，硕士研究生导师,E - mail:weiyuan丨*************
sham operation group. The expressions of TNF - a, 11^ —1p and GDI 11) in the brain tissues of the treatment group were lower than tho of the saline group；and tho of the early administration group were lower than tho of the late administration group. The expressions of TGF - p, IL -10, \ Ml , RECA -1and PDGFR - p in ihe brain tissues of the treatment group wert1higher than tho of the saline group；and tho of the early administration group were higher than tho of the late administration group. The contents of rum IL -1p, IL - 6 and TNF -a in the treatment group were lower than tho in the saline group; and tho in the early administration group were lower than tho in the late administration group. The results of Western blot showed that the expressions of IL -1 p, MMP -3and TNF - a in ihe treatment group were lower than tho in the saline group；and tho in the early administration group were lower than tho in the late administration g r o u p.认’hi
le the expressions of claudin - 5，occluclin，ZO -1，IL -丨0，TGF — p an(l YM1in the administra-tion group were higher than tho in the saline group；and the expression in the early administration group were higher than tho in tlie late administration group. Conclusion MC can effectively alleviate ischemia — reperfusion injury and promote HI5B remodeling, and immediate administration can improve the improvement of neurological dysfunction.
【Key w ord s】minocycline; blood - hrain barrier; ischemia stroke；magnetic resonance imaging
血脑屏障（丨>l〇()d - brain lian'ier,BBB)是脑微血 管特有的屏障结构。微血管内皮细胞及微血管内皮 细胞之间的紧密连接是形成屏障作用的最主要结构 基础。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinas，MMP)家族通过降解细胞外基质及基底膜成分，在 脑缺血微血管损伤中扮演着重要角色脑缺血再灌 注促进了 MMP-9活性增强，破坏了神经血管基质，从而破坏了 BBB的完整性，诱发了不可逆的神 经细胞凋亡，并与血管源性脑水肿以及出血性转化 等预后不良因素密切相关^2]。拮抗MMP可减轻 BBB破坏，减轻缺血再灌注损伤及出血性转换的发 生，减少梗死体积，保证功能血管恢复血流灌注，促 发以丨iBB重塑及血管再生为基础的神经及轴突再 生，最终改善缺血性脑卒中预后[>3]。米诺环素 (minocycline,MC)是一种能通过BBB的四环素类 抗生素，在急性脑缺血的动物模型中具有广谱的抗 炎、抗凋亡、抗氧化及血管保护作用1^51。MC通过 及小胶质细胞/巨噬细胞促发脑缺血再灌注后 的BBB重塑3然而最新研究显示MMP作用机制较 为复杂，MMP在缺血性脑卒中中具有双重
功效，即早期破坏了紧密连接，引起BBB破坏，而恢复期却 促发了 重塑及新生血管再生[6\具体的机制还未完全阐明，并且既往研究MC神经保护机制的方 法均为病理学方法，运用影像学方法无创性动态监 测脑卒中后内源性重塑过程及疗效的研究还未见报 道。为了深入探讨MC对缺血性脑卒中BBB重塑作 用机制及影像可视化。2018年5月至2019年3月，本研究拟建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，并联 合运用磁共振（magnetic resonance imaging，MRI)成 像技术，观察不同给药时相MC在大鼠局灶性脑缺血 再灌注损伤中的神经保护作用并探讨其作用机制。
1材料与方法
1.1材料实验选取SPF级雄性SD大鼠48只，体重(265 ± 15)g，购于上海西普普克实验动物有限 公司。
1.2 动物短暂性大脑中动咏闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型实验动物随机分为4 组（早期给药组、晚期给药组、生理盐水组及假手术 组），每组12只。其中早期给药组于手术后即刻尾 静脉注人MC(3 mg/kg)；晚期给药组于拔线后恢复 再灌注后6 h后大鼠尾静脉注人MC(3 mg/kg)；生 理盐水组于再灌注即刻注人相同体积的生理盐水；
假手术组除了不插人线栓外，其余处理同生理盐水
组。大鼠在手术前禁食8 h，自由饮水,_350 mg/kg 的水合氯醛腹腔注射麻醉，颈部正中切口，钝性分
离 皮肤和皮下组织等结构，暴露出右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈夕卜动脉（external carotid artery，EC A)以及颈内动脉（internal carotid artery.ICA)。ICA暂时血管夹夹闭，于CCA的近端 打一个活结，在ECA的远端插人0.22 mm线栓，打 开丨CA的血管夹，线栓进深距CCA分叉处约18 ~ 20 mm稍有阻力感时则停止。结扎线栓及血管，松 开CCA活结，此时开始记录缺血的时间。阻断血流 2 h后，拔出线栓使大脑中动脉恢复血流再灌注，随 后缝合手术切口。大鼠麻醉清醒后出现对侧肢体偏 瘫及M RI - DWI序列显示右侧大脑半球高信号梗 死灶，即表示模型制备成功。假手术组仅仅分离
holle
CCA、丨CA、ECA，不插入线栓。
丨.3神经功能缺损评分缺血再灌流24 h后，依 据Longa等[7]的方法对假手术组、生理盐水组和药 物干预组分别进行神经功能缺损评分。评分标准
为:〇分，没有任何神经功能缺损征象；I分，左侧前 肢出现向内收;2分，行走时向瘫痪一侧转圈;3分，
行走时向瘫痪一侧倾倒;4分，不可自行走动、意识 障碍或死亡。1分者视为模型制造成功，〇分者、4分者、表现有癫痫发作者以及取脑组织的时候发
现有脑出血者都给予排除并且随机补充。
1.4 大鼠脑组织苏木精-伊红（Hematoxylin - eo-sin,HE)染色每组选取3只行染色。实验结束后 水合氯醛麻醉动物，断头处死，迅速选取缺血侧视交 叉附近约1mm厚度冠状切片脑组织，10%甲醛溶 液固定，按照常规H E实验步骤进行染色：
1.5免疫组化染色每组选取3只行免疫组化。免疫组化指标包括:IL_ 1P、TNF- a、IL- 10、YM1、RECA- 1、PDGFR- p、CDl lb，染色步骤按照说明书 进行。将组织在4%多聚甲醛中41保存24 h以上，切片（5 p m厚）脱蜡后进行免疫组织化学染色。然后用二甲苯洗涤玻片，在不同浓度的乙醇中水合。收集切片，置于3%H202中，室温甲醇中放置15 min，然后浸泡在柠檬酸缓冲液（0.01 mol/L，pH = 6.0)中95X下20 min，用PBS洗涤玻片多次，在1%牛血清中预孵育。初级抗体在室温下孵育45 min，然后在4T下孵育过夜。切片用聚合物增强剂孵育 20 min，用酶标记的抗兔/小鼠聚合物再活化30 min用 3，4 -二氣基联苯胺（Vector Laboratories Ltd,UK)处理玻片，在光学显微镜下进行观察。
1.6 血清中细胞因子的检测采用商品化测定 ELISA试剂盒测定血清中白细胞介素（IL) —6、IL- 1(3和肿瘤坏死因子-«(TNF-c〇的含量，按照试 剂盒说明书操作。
1.7 Western l)lo t法检测脑组织中相关蛋白的表达 1.7. 1脑组织中总蛋白的提取每组选取3只行 Western blot。取冻存的脑组织样本，称重，加入RI-PA裂解液及PMSF，置碎冰上裂解组织30 min。收 集裂解液，4丈12 000 r/m in离心10 min。用移液器 吸取上清液，按4: 1(上清液:5 x SDS - PAGE L
oading Buffer)的比 例加人 loading 缓冲液 '留取 5 |xL 上清液与E P管中测O fl值。装标记好的EP管装人 密封袋，置于- s o t冰箱保存。
1.7.2样品蛋白浓度测定（BCA法）用BCA蛋 白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量，操作步骤按 照试剂盒说明进行，酶标仪测定标准品以及样品吸 光度，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。
1.7.3 SDS- PAGE电泳根据待测蛋白的分子量选择制备1〇%浓度的分离胶，胶凝固后，制备5%浓 缩胶，灌人分离胶上端，插人上样梳。当浓缩胶完全 聚合后（约30 min)，放人电泳槽中固定，加入适量 的电泳缓冲液=按相同体积加人各蛋白样品及预染 蛋白marker，使蛋白含量不低于20 |xg/孔。样品在 浓缩胶中泳动时电压为80 V，30 ~40 min后当溴酚 蓝进人分离胶后，将电压增至120 V，继续电泳直到 溴酚蓝接近分离胶底部、根据跑胶指标的kD值切相应位置的胶。PV D F膜以甲醇活化10 s，然后与 滤纸一起浸入转移缓冲液中。按海绵-双层滤纸- 胶-P V L)F膜-双层滤纸-海绵的顺序组装凝胶转移夹层，放人转移槽中：加入转移缓冲液，接通电 源，300 m A恒流电转移不同时间（根据转移蛋白分 子量的大小来确定具体的转移时间）。
frosted1.7.4 免疫印迹杂交电转移完毕，取出PVDF 膜，放入5%脱脂奶粉封闭液中，置摇床上室温封闭 2 h。封闭过的膜放入杂交袋中，加人一抗4丈孵育 过夜，使抗原抗体充分结合。隔天，将膜从杂交袋中 取出，用TBST洗涤3次，10 min/次；再放人新杂交 袋中，加人HRP标记的二抗以结合一抗，置摇床上 室温孵育2 h后取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，10 min/次。
1.7.5 Western blot结果检测 ECL化学发光法检 测，将混合好的发光液滴加到膜上，用凝胶成像系统 拍照成像。
1.8免疫荧光法检测Iba-1+小胶质瘤细胞数量 每组选取3只行免疫荧光。免疫荧光标记法检测小 胶质细胞活化。脑组织的石蜡切片置于58T烤箱 中，烤切片15 ~20 m in左右，室温冷却。石蜡切片 用二甲苯脱蜡（二甲苯I和二甲苯D各浸泡15 min)，然后再分别置于梯度浓度乙醇中进行水化，浓度依次为 100%、90%、75%、50%，各 10 min，随 后在双蒸水中浸泡5 mi»，再在中性磷酸盐缓冲液 (PBS)浸泡，并置于摇床上缓慢清洗3次，5 min/ 次。采用3%H202封闭内源性过氧化物酶10 min，此过程注意避光。切片浸泡在1x EDTA -柠檬酸 钠抗原修复液中，用微波中火加热6 min，在室温条 件下冷却。使用10%山羊血清371下封闭30〜60 min。滤纸吸去多余液体，加人丨ba - I —抗混合稀 释液,4尤过夜。PBS缓慢清洗3次，加入稀释好的 二抗，室温避光孵育1h，再用PBS洗3次。抗荧光 衰减淬灭剂封片。
1.9 MRI扫描每只模型于处死前行MR丨扫描。采用德国Siemens 3.0 T扫描仪（Verio,Siemens Medical Solutions,Erlangen，Germany)和专用动物线 圈，大鼠头置线圈中央，扫描序列包括DWI及SWI。DWI 采用 EPI 序列，TE/TR:83 ms/4 _ms;F0V: 94 m m x94 mm，b 值分别为 0、1 _s/mm2。SWI, TE/Tli:20 ms/28 ms;FOV:128 m m x l28 mm；矩阵：256 x256；翻转角：15°。各序列扫描层厚2 mm，间距〇，层数均为9层。
丨〕W I产生的ADC图用以显示梗死灶并测量梗 死体积。SWI图像用以显示新生血管，SWI结果判 读由两名有经验的影像诊断医生完成，梗死灶区域
出现连续层面条状低信号影，判定为新生血管；不连 续斑点状、片状低信号影判定为出血灶。
1. 10统计学方法采用SPSS 20. 0统计软件，各组间数据采用单因素方差分析，两两比较采用LSI)法。以P <0. 05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 各组的神经功能恢复情况及梗死体积行为学实验结果显示，与假手术组比较，生理盐水组、早 期给药组和晚期给药组出现明显的神经功能障碍，提示造模成功。与生理盐水组相比，早期给药组(P= 0.008)显著改善手术引起的神经功能障碍，晚 期给药组没有明显的改善现象（P= 〇•360)。DW1的ADC图显示除了假手术组，其余各组均显示明显 低信号的梗死灶，证明手术成功诱导了大鼠脑梗死。与假手术组比较，生理盐水组、早期给药组和晚期给 药组大鼠出现大面积梗死区域。与生理盐水组相 比，早期给药组和晚期给药组的脑梗死面积明显低 于生理盐水组（/"<〇. 〇〇1)。见表1、图1。
表I各组的神经功能恢复情况及梗死体积.V±.、'
项目神经功能缺损评分梗死体枳（mm3 )
超低价qq业务自助下单平台假手术组00
生理盐水组 2.417 ±0.79244.74 ±22.07
早期给药组 1.667 ±0.78207.71 ± 11.79
晚期给药组 2. 167 ±0.72222.80 ±8.02
續32.4389.686
P值<0.001<0.001
注:A：假手术组;B：生理盐水组；C：早期给药组;D：晚期给药组
图I各组大鼠颅脑MIH(ADC图）表现
2.2 各组脑组织病理学的改变 H E染色结果显 示：假手术组大鼠神经元，胶质细胞及毛细血管形态正常，核仁清晰可见，神经纤维密集，排列整齐；生理 盐水组神经元结构变得疏松，排列紊乱，细胞外间隙 呈网状增大，神经元肿胀，有程度不同的神经元变 形，核固缩，细胞坏死等现象；M C组别明显减少缺 血再灌注对大鼠脑组织损伤，细胞肿胀和间质水肿 明显缓解〇见图2。
A ，B
D 注：A：假手术组；B：生理盐水组;C：早期给药组；D：晚期给药组 图2各组大鼠脑后组织H E染色图（x l00>
2.3 各组脑卒中后的血清炎症因子水平与假手术 组比较，生理盐水组大鼠血清IL-6、IL- 1P、TNF- a含量显著性升高；与生理盐水组比较，给药组大鼠 血清促炎因子IL-6、IL-i p、TNF-a含量显著性 降低（P<0.05)。早期给药组较晚期给药组差异无 统计学意义（P>〇.〇5)。见表2。
表2各组脑卒中后血清炎症因子水平U_±s)pg/mL
项目IL-6IL - 1P T N F-a
假手术组43.41 ±15.6512.67 ±3. 1077,46 ±49.45
生理盐水组280. 12 ±15. 62*33.32 ±2.35*689.35 ±75.43 *
早期给药组137.41 ±10.30AA 24. 18 ±2.88A280.15 ±27.56aa 晚期给药组143.79 ±8.94aa26.51 ±2.29a337.51 ±74.40aa F值168.86530.98853.886
續<0.001<0.001<0.001
注：*与假手术组比较P cO.O O h与生理盐水组比较A PcO.O S,
A A P<0.01
failure2.4各组脑卒中后免疫组织化学分析
2.4.1促炎因子及抗炎因子与假手术组比较，生 理盐水组大鼠组织促炎因子IL- 1p、TNF- a升高，抗炎因子丨丨.-10、TGF- p、YM1降低；与生理盐水组 比较，MC治疗组大鼠组织促炎因子丨L- i p、TNF-a 降低，抗炎因子i l-i〇、t g f-p、y m i升高，其中，早期给药组较晚期给药组改善炎症的作用更为明 显。见图3
。
广东医学2020 年丨丨月第 41 卷第 22 期Guangdong Medical Journa丨Nov. 2020, Vo丨.41，No. 22•2283 •TNF-a
TGF-P
IL-10
YM1
假手术组生理栊水飢¥期给药飢晚期给药组
图3各组大鼠脑组织中促炎因子和抗炎因子的表达（免疫组化，x丨00)
2.4.2新生血管及小胶质细胞标记物与假手术组比较，生理盐水组大鼠组织标记血管新生的RE-CA-1和PDGFR -(3强度变弱，表达明显减少，与 生理盐水组比较，MC治疗组大鼠组织RECA - 1和 PDGFR- p表达明显上调，其中，早期给药组较晚期 给药组促进血管新生的作用更为明显（图4)。SW I 同样证实治疗组梗死灶内新生血管数量高于生理盐 水组，早期给药组梗死灶内新生血管数量高于晚期 给药组（图5)。
tingeCD11b阳性细胞为棕黄色，脑缺血可诱导小胶 质细胞从静息状态快速向活化状态转变。免疫组化 结果显示生理盐水组CD1l b标记的阳性细胞明显 增多且形态大小不均一；MC治疗组CD1l b染色强 度变弱，数量减少；早期给药组较晚期给药组对CD1l b的抑制作用更为明显（图4)。
2.5 各组脑卒中后相关蛋白表达
2.5.1紧密连接蛋白生理盐水组紧密连接蛋白Z0- 1、occludin、claudin - 5表达显著降低；
与生理
