·论著·
唯爱的英文基金项目：国家自然科学基金（31160221），云南省应用基础研究项目（2010CD085），大理学院博士科研启动基金（KYBS200902）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310679003），云南省大学生创新创业训练计划项目（201310679003）。
1大理学院2011级医学影像学专业2班，云南大理671000*共同第一作者
通信作者：朱建华，E-mail ：zjhynbc＠163．com
基底前脑是一个高度异质性的区域，含有胆碱能神经元在内的多种神经元，与学习记忆等许多高级神经活动有关。近年发现成年大鼠和成人的基底前脑区域都有一群巢蛋白免疫反应阳性的
神经元［1，2］。这群神经元发出纤维投射到海马、丘脑及前额叶皮质，与大鼠的学习记忆密切相关，而且具有较强的神经可塑性［2－3］。通过膜片钳技术与单细胞RT-PCR 技术，免疫荧光三标与激光共聚焦扫描术研究证实，nestin 阳性是胆碱能神经元的一种亚型［4－5］。研究表明，与巢蛋白阴性胆碱能神经元相比，巢蛋白阳性胆碱能神经元具有较大的超极化激活的内向电流和兴奋性突触后电流，因此，在学习记忆过程中可能发挥着不同的作用［4］。但是，这群神经元的来源不清，功能未明。本课题通过5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷掺入法及双皮
基底前脑巢蛋白免疫反应阳性神经元的来源探索
朱丹青
1*
，任新*，王戚君1，尹海燕1，王钦1，朱建华
（大理学院人体解剖学教研室，云南大理671000）
【摘要】
英语学习格言目的
探索基底前脑巢蛋白免疫阳性神经元的来源，为进一步研究巢蛋白免疫阳性神经元的功能及利用巢
蛋白表达改善学习记忆能力提供基础。方法
用免疫荧光法研究巢蛋白免疫阳性神经元与5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷
（EdU ）阳性细胞的关系、用免疫组化法研究巢蛋白免疫阳性神经元与双皮质素阳性神经元的关系。结果EdU 阳性细胞
主要分布于海马齿状回及侧脑室的室管膜及室管膜下区的细胞，在内侧隔核、斜角带核等区域无明显的EdU 阳性细胞，巢蛋白免疫反应阳性神经元与EdU 阳性细胞无共定位表现。双皮质素阳性细胞主要分布于海马齿状回及侧脑室的室管膜及室管膜下区的细胞，巢蛋白免疫反应阳性神经元与双皮质素阳性神经元之间无双标。结论基底前脑巢蛋白免疫反应阳
性神经元不是一种新生的神经元，可能是成熟胆碱能神经元的一种功能状态。可能是巢蛋白表达赋予了胆碱能神经元特
殊的功能。
【关键词】
基底前脑；
巢蛋白；
双皮质素；
迈克尔杰克逊歌曲新生神经元；
5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷
Exploring of the origination of nestin-immunoreactive neurons in the basal forebrain ZHU Dan-qing ，REN Xin ，WANG Qi-jun ，
YIN Hai-yan ，WANG Qin ，ZHU Jian-hua．Department of Human Anatomy ，Dali University ，Dali ，Yunnan 671000，China
Corresponding author ：ZHU Jian-hua ，E-mail ：zjhynbc＠163．com英语答题卡
【Abstract 】
Objective
To explore the origination of nestin-immunoreactive neurons in the basal forebrain ，and provide
bas for further functional studying of the nestin-immunoreactive neurons in the basal forebrain and enhancing learning and memory ability by altering nestin expression．Methods
Study the relationship of nestin-immunoreactive neurons and 5-ethynyl-2′-deoxyuri-dine （EdU ）positive neurons by immunofluorescence ，and study the relationship of nestin-immunoreactive neurons and doubelcortin-immunoreactive neurons using immunohistochemical method．Results
EdU positive neurons mainly distribute over dentate gyrus of
hippocampus ，ependyma and subventricular zone of the lateral ventricle ，but not over the medial ptum ，vertical and horizontal limbs of the diagonal band neucleus．No colocalization of nestin-immunoreactive and EdU positive neuron was found．Doublecortin-positive neurons mainly located at dentate gyrus of hippocampus ，ependyma and subventricular zone of the lateral ventricle and no double staining of nestin-immunoreactive and doublecortin-positive neurons．Conclusion The nestin-immunoreactive neurons in
the basal forebrain are not newborn neurons．They may be cholinergic neurons of a special functional stage．Maybe nestin expression
gives the cholinergic neurons special features．
【Key words 】
Basal forebrain ；
Nestin ；
Doublecortin ；
Newborn neurons ；
5-ethyny l-2′-deoxyuridine
质素与巢蛋白免疫组化法研究基底前脑巢蛋白免疫阳性神经元的来源，为进一步研究巢蛋白免疫阳性神经元的功能及利用巢蛋白表达改善学习记忆能力提供基础。
1材料和方法
1．1实验动物
由昆明医科大学实验动物中心提供，共使用SD大鼠5只，体质量（230±10）g，BALB／c小鼠5只，体质量（23±2）g，许可证编号：SYXK（滇）2011-0004。实验动物使用常规饲料喂养，自然明暗周期，自由进食进水。
1．2实验试剂
Flour488标记巢蛋白单克隆抗体（Rat401，pharmegine），双皮质素（Doublecortin，DCX）单克隆抗体（sc-8066，Santa Cruz Biotechnology，Inc．），5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-de-oxyuridine，EdU）试剂盒（C10341-1，广州市锐博生物科技有限公司）。常规免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），其它试剂为国产分析纯。
1．3EdU注射
取BALB／c小鼠5只，按100mg／kg体重，经腹膜腔一次性注射EdU，96h后常规灌注取脑［6－7］。脑组织用4％多聚甲醛后固定4h，然后置于15％和30％的蔗糖磷酸缓冲液脱水，直至组织块沉底，以防冰冻切片时产生冰晶。用Leica SM2100R切片机进行冰冻切片，片厚30μm，隔5片取1片。1．4EdU显色及巢蛋白免疫荧光染色
切片用0．01mol／L PBS（pH7．4）漂洗5min×3次，入含0．5％Triton X-100的PBS中孵育30 min，0．01M PBS漂洗5min×3次，然后加入按试剂盒说明书配制E dU反应液，30min后用0．01 mol／L PBS漂洗终止反应。巢蛋白免疫荧光染色一抗为Flour488标记鼠抗nestin单克隆抗体（1∶100，Pharmingen）。操作步骤如下：1％BSA（含0．3％Triton X-100）37℃30min；一抗37℃孵育2h后置4℃冰箱过夜。次日，切片经漂洗后贴片，置阴暗处晾干，用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下进行观察。以上除1％BSA封闭后直接入一抗外，其余各步骤间均用0．01mol／L PBS（pH7．4）漂洗5min×3次。用未注射EdU的正常小鼠脑切片作阴性对照，除不注射EdU外其它实验方法完全一致，同步进行。
1．5Nestin及DCX免疫组化实验
nestin一抗为小鼠抗nestin单克隆抗体（1∶10000，Pharmingen），双皮质素一抗为羊抗DCX单克隆
抗体。操作步骤如下：切片入0．3％H2O237℃孵育30min；1％BSA（含0．3％Triton X-100）37℃30min；一抗37℃孵育2h后置4℃过夜；二抗、三抗（1∶400，Boster）分别37℃孵育2h；0．05％DAB（含0．01％H2O2）室温显色约5min。以上除1％BSA封闭后直接入一抗外，其余各步骤间均用0．01mol／L PBS（pH7．4）漂洗5 min×3次。贴片后常规梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
2结果
EdU在脑内分布EdU阳性产物呈红色强阳性颗粒，无细胞形态，可为单一的实心颗粒，也可表现为分散排列的较小颗粒，与文献描述相似［6－7］。主要分布于海马齿状回、侧脑室前角外侧壁的室管膜上及室管膜下区，在海马CA1区偶见阳性颗粒。用相同的荧光强度观察，基底前脑的内侧隔核（medial ptum，MS）、斜角带核垂直支（vertical limb of diago-nal band，vDB）和水平支（horizontal limb of diagonal band，hDB）均未见明显的阳性反应产物（图1）。阴性对照切片上海马及侧脑室均无EdU阳性颗粒。
Nestin免疫阳性细胞主要分布于内侧隔核及斜角带核的垂直支和水平支，在MS处阳性细胞较小，呈长椭圆性，多垂直分布；在vDB和hDB处细胞较大多呈椭圆形或近似圆形。斜角带核水平支处细胞长轴多与脑组织的下表面平行。
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Nestin免疫荧光与EdU荧光双标观察，在侧脑室前角的室管膜处可见EdU与nestin共定位情况。在内侧隔核、斜角带核的垂直支和水平支处均未见EdU与nestin共定位表现。
Nestin与DCX常规免疫组化实验显示nestin 阳性神经元主要分布于内侧隔核、斜角带核和垂直支和水平支（图2）。在室管膜及海马的齿状回也有nestin阳性细胞分布［8］。DCX阳性细胞主要分布于海马齿状回，细胞边界清晰，发出较长的突起。在侧脑室前角的室管膜上有较多的阳性细胞，成群分布，室管膜下区有少量阳性细胞散在分布。MS、vDB和hDB等区域无明显的DCX阳性细胞分布（图3）。即在MS、vDB和hDB无DCX阳性神
B
C
A D
图2Nestin免疫阳性神经元在基底前脑的分布。B、C、D为A中相应区域放大。箭头所示为nestin免疫阳性细胞。A．Bar＝200μm；B、C、D．Bar＝20μm
B
A C
图3DCX在侧脑室及基底前脑的分布。B，C为A中相应区域放大。箭头所示为DCX免疫阳性细胞。A．Bar＝200μm；B，C．Bar＝20μm
神经元与nestin阳性神经元重叠分布。
3讨论
Nestin属于Ⅵ型中间丝蛋白，其表达始于神经胚形成时期，随着细胞分化成熟，逐渐被vimentin 和α-internexin等其它中间丝蛋白取代［9－10］。由于表达的时空模式与神经前体细胞的发生和分化过程相一致，nestin常被作为神经前体细胞的特异性标记物，广泛应用于神经前体细胞鉴定［11］。以往的研究表明在成年大鼠的脑区nestin主要存在于有神经发生的区域，是神经前体细胞的特异性标记物。在成年大鼠的脑区只有SVZ和SGZ、血管内皮细胞以及激活的神经胶质细胞表达［12］。中枢神经系统及骨骼肌肿瘤细胞、各种损伤条件下的反应性星形胶质细胞也nestin的表达，故nestin也可作为肿瘤和中枢神经系统损伤的标志物［13－15］。
EdU是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，能在细胞增殖期替代胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性化学反应检测DNA的复制活性。经过EdU处理的标本可长期放置，不受高温处理的影响。实验过程无需DNA变性，无需抗体，操作时间短（小于3 h），更方便、更准确。不仅可用于细胞增殖检测，也可用于细胞示踪［6－7］。
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本实验也证实在室管膜下区及海马齿状回存在nestin阳性细胞。这些神经元与EdU阳性反应物有双标，提示海马和室管膜的nestin阳性细胞可能是新生的神经前体细胞。但MSDB虽有大量nestin 阳性细胞，却无EdU阳性产物。从另一个角度证实MSDB的nestin阳性细胞不是新生的神经元。
三月英语
为了进一步证实nestin阳性神经元与新生神经元的关系，本实验还研究了nestin阳性神经元与DCX阳性细胞的关系。DCX也是一种微管相关蛋白，为神经元的迁移和分化所需，在发育期整个神经系统的迁移神经元中都有表达［16－17］。DCX阳性细胞具有早期神经元特异性抗原，但不表达胶质细胞、未分化细胞及凋亡细胞的特异性抗原，因而DCX特异性地在新生的健康神经元中表达，近年来常被用作成年大鼠齿状回新生神经元的标志。DCX仅在神经元形成后的前3周有表达，因此可作为新生神经元的标记物［18－19］。本实验发现，海马齿状回的颗粒细胞层及侧脑室的室管膜及室管膜下区有大量的DCX表达，但在内侧隔核及斜角带核的垂直支和水平支均无DCX表达。提示基底前脑的nestin阳性神经元不表达DCX，不是新生的神经元，而是一种成熟的神经元。
前期的研究也发现，基底前脑的nestin阳性神经元，具有成熟神经元的电生理特征。通过单细胞RT-PCR、免疫荧光及电生理研究发现，基底前脑的nestin阳性神经元是胆碱能神经元的一个亚群［4－5］。与nestin阴性的胆碱能元相比，巢蛋白阳性胆碱能神经元具有较大的超极化激活的内向电流和兴奋性突触后电流，因而提示这群神经元在维持海马电生理活动方面可能具有不同的功能［4］。另外，也有研究发现库贾病（Creutzfeldt-Jakob dia）患者小脑的浦肯野细胞［20］及神经损伤后
的背根节［21］细胞会表达nestin，作者认为这些神经元表达nestin意味着神经元处于一个保护性反应的阶段，以延长神经元的生存或增强神经元分化以对抗神经元死亡。
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总之，基底前脑巢蛋白免疫反应阳性神经元不是一种新生的神经元，而是成熟胆碱能神经元的一种功能状态。可能是巢蛋白赋予了胆碱能神经元特殊的功能，使神经元具有更强的生理活性和神经可塑性。关于nestin阳性神经元生理机能的特殊性及其机制需要从神经生理、神经药理及基因转染等各个方面进行更加深入的研究。
（本文图1见封底）
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图版说明：
图1Nestin与EdU双标染色。A1-D1：nestin免疫荧光；A2-D2：Appollo567EdU荧光染色，示EdU注射后新生细胞；A3-D3：为A1-D1与A2-D2的叠加图像，示nestin阳性神经细胞与新生细胞的关系。A1-A3：短箭头显示室管膜区，nestin阳性细胞与EdU阳性细胞有重叠。B1-B3、C1-C3、D1-D3：分别显示内侧隔核、斜角带核垂直支、斜角带核水平支nestin阳性神经元不与EdU阳性细胞重叠。长箭头：nestin阳性神经元。Bar：50μm
恭祝各位编委、广大读者作者新春愉快！
