吐温20与吐温80对小麦秸秆酶解影响的研究
连战;刘彬;刘欣;吕志飞;庄倩倩;刘同军
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【摘 要】通过NREL法对小麦秸秆进行成分分析,确定Ctec2与Htec2两种酶的添加量。使用碱过氧化氢法(AHP)对小麦秸秆进行预处理,进行不同底物浓度下的酶解,研究糖得率与底物浓度的关系以及不同酶解时间糖得率的变化趋势。结果表明,随着底物浓度升高,糖浓度逐步提高,而转化率逐步下降,且下降趋势非线性关系;酶解时间为24 h,糖转化率达到相对较高的水平。在25%底物浓度下向预处理的小麦秸秆添加一系列梯度的非离子型表面活性剂吐温20与吐温80,比较两者对酶解转化率的影响。结果显示,在一定范围内,吐温20与吐温80均能有效提升小麦秸秆酶解转化率,且吐温20优于吐温80,两者在7%添加量下获得的糖转化率最高,添加吐温20组葡萄糖转化率达到了69.39%,添加吐温80组葡萄糖转化率为68.22%,与对照组(不添加吐温)的转化率相比,分别相对提高了5.46%和3.68%。
【期刊名称】《齐鲁工业大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】2018(000)001
【总页数】5页(P37-41)
【关键词】小麦秸秆;碱过氧化氢预处理;吐温20;吐温80;糖转化率
【作 者】连战;刘彬;刘欣;吕志飞;庄倩倩;刘同军
【作者单位】威尔惠顿齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院;齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院;齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院;齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院;齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院;齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院;
【正文语种】中 文
【中图分类】Q814
小麦是我国广泛种植的粮食作物，据2010年全国作物秸秆废弃物统计，小麦秸秆产量高达每年1.5亿吨，约占我国秸秆理论资源量的18.3%。除造纸行业对小麦秸秆进行利用外，小麦秸秆的常规处理方式诸如沼气发酵、粉碎堆肥等利用率较低，且在很多地区存在大量焚烧小麦秸秆现象，加剧了农村环境的污染，合理利用小麦秸秆的研究势在必行[1]。
研究表明，小麦秸秆含有较多的纤维素与半纤维素，是良好的生物燃料炼制原料。但小麦秸秆有效的预处理方法、酶解工艺都需要进一步的研究[2-4]。碱过氧化氢法在木质纤维素预处理方面效率较高，能有效破除酶解的生物质壁障。研究表明，在pH=11.6附近，较高过氧化氢添加量下，碱过氧化氢法有效去除木质素的同时能保留纤维素，因此选择碱过氧化氢法对小麦秸秆进行预处理[5-7]。
在预处理的基础上进行酶解以将纤维素分解成单糖分子。研究表明，在酶解过程中，木质素的物理屏障作用会限制纤维素酶的渗透，且对纤维素酶存在非特异性吸附。而表面活性剂对木质纤维素酶解有一定影响。Torny等研究发现，吐温20及吐温80能降低酶解过程木质素对酶的非特异性吸附，从而提高微晶纤维素酶解效率，但该研究是基于低底物浓度云杉木，而高底物浓度下较低的水分活度、较高的黏度及抑制物浓度，与低底物浓度下存在明显差异，尚未有对高底物浓度下表面活性剂对小麦秸秆酶解影响的研究[8-12]。研究旨在确定较高底物浓度下吐温20及吐温80两种非离子型表面活性剂对小麦秸秆酶解的影响，确定酶解过程适宜的吐温添加量，最终达到降低纤维素乙醇生产酶制剂成本的目的。find my friends
1 材料和方法
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1.1 实验材料
1.1.1 小麦秸秆
小麦秸秆采集自山东潍坊，晾晒干燥后经齿爪式粉碎机粉碎并过φ1.2 mm筛网。
1.1.2 试 剂
硫酸，NaOH，H2O2(实验用到的试剂均为分析纯)。
1.1.3 酶
纤维素酶(Cellic CTecII)以及半纤维素酶(Cellic HTecII)均来自丹麦诺维信公司。
1.1.4 仪器设备
强基计划入围名单齿爪式粉碎机，9FZ～23；德国赛多利斯pH计 ，PB～10；恒温振荡培养箱，MQD～B3NR；日本岛津高效液相色谱仪，LC～20A；高速离心机，iCen24；电热鼓风干燥箱，DHG～9075A；马弗炉，SX～2；立式压力蒸汽灭菌器，LDZX～50KBS。
1.2 实验方法
1.2.1 成分分析方法
纤维素，半纤维素，木质素，还原糖及其他主要成分测定参照美国国家可再生能源实验室(NREL)《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass》。
1.2.2 碱过氧化氢法预处理小麦秸秆
称取 3.0 g 小麦秸秆于50 mL三角瓶中，称取0.3 g氢氧化钠颗粒于烧杯中，加适量蒸馏水溶解，将混合均匀的NaOH溶液加入盛有小麦秸秆样品的三角瓶，混匀后加入H2O2溶液(添加量0.1 g/g小麦秸秆)，并加水至实验设计底物浓度。置于30 ℃恒温振荡器中振摇,并调节pH至 11.7～11.9，每隔2 h用5 M NaOH调节一次，使pH保持在11.7～11.9，振摇24 h。
1.2.3 底物浓度与酶解糖得率的关系
在上述实验条件下分别考察酶解底物浓度 5%、10%、15%、20%、25%、30%(w/v)下酶解效率的变化。预处理结束后，添加72%H2SO4调节pH至5.2，按照实验设计的酶蛋白添
加量(纤维素酶/半纤维素=0.77/0.23)分别加入一定量的纤维素酶和半纤维素酶(50 mg/g总蛋白/g纤维素，酶解温度50 ℃)，置于50 ℃恒温振荡器中，170 r/min进行酶解24 h。酶解结束后，立即取出，沸水浴灭活5 min，取样1 mL于1.5 mL离心管中，12 000 r·min-1下离心3～5 min，取上清液测定葡萄糖及木糖浓度。
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1.2.4 酶解时间对糖转化率影响
2012考研英语选择25%作为实验底物浓度，称取9.0 g粉碎后的小麦秸秆于300 mL三角瓶中，在上述实验条件下进行预处理及酶解，并在酶解12 h、24 h、36 h、48 h、72 h后取样测定糖浓度。
1.2.5 吐温20与吐温80对酶解糖得率的影响
称取36.0 g小麦秸秆，设计底物浓度25%,在1.2.2实验条件下进行预处理。预处理完成后调节pH至5.2，反复搅拌均匀，分装至容量25 mL密封小瓶中，每瓶0.9 g小麦秸秆干物质，分别添加相当于底物质量0.5%、1%、3%、5%、7%、9%的吐温20与吐温80。每组实验包括三个平行样，按照实验设计加酶量添加Ctec2与Htec2，并设置不添加吐温20与吐温80组作为对照组，酶解24 h后取样测定糖浓度。
1.2.6 糖浓度测定
葡萄糖及木糖糖浓度通过高效液相色谱(美国伯乐公司Aminex-87 H)进行测定。检测器为示差检测器，流动相为0.005 mol·L-1 H2SO4 ，柱温65 ℃，流速0.6 mL/min。通过建立标准曲线对糖浓度进行确定。
2 结果与讨论
2.1 成分分析
成分分析结果如图1所示，主要成分的测定结果与其他研究大致一致。小麦秸秆较高的纤维素(35.53%)与半纤维素含量(21.27%)证实其具有较高的利用价值。龚大春[12]等使用Velp Scientifical Goodwill Technology Ltd提供的 Van Soest 方法测定小麦秸秆中半纤维素、纤维素和木质素的成分，测得纤维素含量为33%，与实验结果接近；而半纤维素含量35%，较大的差异可能与测定方法有关；而刘沙沙[13]等采用72%硫酸酸解小麦秸秆测得纤维素含量与半纤维素含量分别为33.9%和22.51%，与测定结果接近，其使用的预处理方式与NREL法大致相同。其他的一些研究也得出了类似的分析结果。相对较高的木质素含量决
定了必须经过一定的预处理对生物质壁障进行破除。根据纤维素与半纤维素含量，进一步确定了酶解的加酶量。
图1 小麦秸秆成分分析图
2.2 底物浓度与酶解糖得率的关系
图2、图3显示了底物浓度与酶解糖浓度及转化率的关系。随着底物浓度的增加，酶解液中葡萄糖与木糖浓度同步增加。底物浓度从5%增加至30%，对应的葡萄糖浓度与木糖浓度分别由17.52 g/L和11.14 g/L提升至68.33 g/L和44.58 g/L。糖浓度提高的同时，转化率逐步下降，在较低的底物浓度下(5%)，纤维素转化为葡萄糖以及半纤维素转化为木糖转化率分别高达92.11%、95.67%；而当底物浓度提高至30%，纤维素转化为葡萄糖以及半纤维素转化为木糖转化率分别下降至60.39%和64.36%，葡萄糖与木糖下降幅度基本一致。这是因为随着底物浓度的升高，逐步降低的自由水含量及水分活度，逐步升高的液体黏度以及对香豆酸、阿魏酸等酶活抑制物浓度，阻碍了转化率的提高[6]。在25%底物浓度下，糖得率水平较高，底物浓度从25%提高至30%，糖得率增速明显放缓。在25%底物浓度下，葡萄糖与木糖转化率分别达到67.11%和71.2%，且在该底物浓度下游离水较少，有利于对预
处理后小麦秸秆进行分装。故选择25%作为进一步实验的底物浓度。
图2 不同底物浓度酶解小麦秸秆的糖浓度图standup是什么意思
图3 不同底物浓度酶解小麦秸秆的转化率
2.3 酶解时间对糖转化率影响
在不同酶解时间下的糖转化率如图4所示。0～12 h，随着酶解进行，自由水逐步得到释放，糖浓度与转化率迅速升高。在12 h时，葡萄糖与木糖转化率分别达到57.69%和58.54%，逐步升高的糖浓度以及逐步释放的阿魏酸等酶活抑制物阻碍了转化率的迅速提升[7-8]。在12～24 h期间增速明显放缓，转化率达到65.80%(葡萄糖)和66.28%(木糖)。24～48 h转化率增幅进一步减小，48 h葡萄糖及木糖转化率较24 h分别提高8.13%和7.78%。72 h后转化率趋于稳定，72 ～120 h期间，葡萄糖与木糖转化率仅提高2.19%和2.17%，继续延长酶解时间意义不大。故以24 h作为酶解时间，酶解效率较高。
图4 酶解时间与转化率的关系图
2.4 吐温20与吐温80对酶解糖得率的影响
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图5 吐温20与吐温80对酶解葡萄糖转化率影响
如图5所示，在0～9%添加量范围内，随着吐温20/80添加量的增加，酶解葡萄糖得率逐步提升，两者均在7%添加量下达到最高转化率水平，分别达到69.39%和68.22%,相对于对照组的转化率，分别提高了5.46%和3.6%，优于Jessica[11]等向蔗渣添加2.5 g/L吐温20/80酶解48 h的实验结果(酶解转化率分别提升约2%、1%)。实验结果表明，添加7%的吐温20或吐温80均能有效提高小麦秸秆酶解转化率,原因可能与两种非离子表面活性剂降低了木质素对纤维素酶的非特异性吸附有关[14]。
3 结 论
碱过氧化氢法预处理小麦秸秆进行酶解能获得较高的糖得率。在高底物浓度条件下，添加吐温20与吐温80均能有效提高小麦秸秆酶解转化率。在7%添加剂量下酶解24 h，两者均获得最高糖转化率。实验结果表明，吐温20对高底物浓度下小麦秸秆酶解的促进作用要优于吐温80，在实际生产中可以通过添加适量吐温20以提高酶制剂利用效率,最终达到提高可发酵糖浓度与酶解转化率的目的。
