第37卷第9期2022年9月
Vol.37No.9
Sept.2022
液晶与显示
Chine Journal of Liquid Crystals and Displays
聚苯乙烯微球的表面等离子体共振
图像处理与分析
mc什么意思吴静宁1，2，刘紫威1，2，杨博1，2，蔡宸1，祁志美1，2，3*
（1.中国科学院空天信息创新研究院传感技术国家重点实验室，北京100190；
2.中国科学院大学电子电气与通信工程学院，北京100049；
越女剑小说3.中国科学院大学光电学院，北京100049）
摘要：使用高光谱SPRi传感器对聚苯乙烯微球进行SPR显微成像，并对不同偏振条件下采集的高光谱SPR图像数据进行了处理，有效削弱了SPR高光谱图像中固有污点的对比度，使得聚苯乙烯微球样品的位置与轮廓更加清晰。处理后的单像素SPR光谱变得平滑，降低了光源光谱本身特性以及随机噪声对SPR共振信息提取的影响。对比聚苯乙烯微球的SPR图像与反射式明场显微图像，发现二者存在明显区别，主要是由于消逝场穿透深度的限制。结果表明，相较于反射式明场显微图像，SPR图像可以明显反映出消逝场内微粒与金属表面的接触情况，但无法量化超出消逝场穿透深度的物体的真实尺寸。
关键词：表面等离子体共振成像；光谱成像；聚苯乙烯微球；图像处理
中图分类号：TH744；TP391文献标识码：A doi：10.37188/CJLCD.2022-0057
Processing and analysis of surface plasmon resonance
image of polystyrene microspheres
WU Jing-ning1，2，LIU Zi-wei1，2，YANG Bo1，2，CAI Chen1，QI Zhi-mei1，2，3*（1.State Key Laboratory of Transducer Technology，Aerospace Information Rearch Institute，
Chine Academy of Sciences，Beijing100190，China；
2.School of Electronic，Electrical and Communication Engineering，University of
Chine Academy of Sciences，Beijing100049，China；
3.School of Optoelectronics，University of Chine Academy of Sciences，Beijing100049，China）
Abstract：The hyperspectral SPRi nsor was ud to perform microscopic analysis of polystyrene microspheres，and the hyperspectral SPR data collected under different polarization conditions were procesd，resulting in effective suppression of the contrast of inherent stains in the SPR hyperspectral images and making the position and outline of the polystyrene microsphere sample clearer.The procesd SPR spectra become smooth，reducing the influence of the spectral characteristics of the light source and 文章编号：1007-2780（2022）09-1174-08
收稿日期：2022-02-16；修订日期：2022-03-09.
基金项目：国家自然科学基金（No.62121003，No.61931018，No.61871365）
Supported by National Natural Science Foundation of China（No.62121003，No.61931018，No.61871365）*通信联系人，E-mail：zhimei-qi@mail.ie.ac
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第9期吴静宁，等：聚苯乙烯微球的表面等离子体共振图像处理与分析
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random noi on the SPR resonance information extraction.By comparing the SPR image of polystyrene microspheres with the reflection bright field microscopic image，it is found that there are obvious differences between the two images.The main reason is the limitation of the penetration depth of the evanescent field.The results show that SPR images can clearly reflect the contact between particles and metal surfaces in the evanescent field，but cannot quantify the true size of objects beyond the penetration depth of the evanescent field compared with reflection bright field microscopy images.
Key words：surface plasmon resonance imaging；spectral imaging；polystyrene microspheres；image processing
1引言
表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）传感器因其免标记、非侵入性、高灵敏度和原位检测的特点而被广泛应用于生化分析中，主要采用被称为Krestchmann结构的SPR棱镜激发结构［1］。根据光学传感信号的不同，SPR传感器可分为强度型/角度型、相位型、偏振干涉型和波长型。20世纪80年代后，表面等离子体共振成像（Surface plasmon resonance imaging，SPRi）［2］和表面等离子体显微镜（Surface plasmon microscopy，SPM）［3］被相继提出并得到蓬勃发展。1
999年，Giebel小组用棱镜激发结构的表面等离子体共振显微镜（Surface plasmon resonance microscopy，SPRM）在不同的入射角度对金鱼胶质活细胞进行了成像，并对细胞/基质的距离进行了量化［4］。细胞膜与基质之间的黏附情况得以以高对比度可视化，垂直分辨率在纳米范围内。但由于表面等离子体（Surface plasmas，SPs）的传播和斜入射造成的像差，横向分辨率表现不佳。通过优化棱镜形状和扫描成像方式可以减小像差［5］。除了像差问题外，棱镜激发结构的角度扫描型SPRM还有其他固有缺点。当改变入射角度时，SPR芯片上的照明区域会发生变化，这个问题可以通过增加一对固定的反射镜和角度可控的反射镜来解决［6］。此外，对于常规显微系统，高倍物镜的工作距离更短，即要求物镜更靠近样品表面，而棱镜的尺寸限制了物镜与样品之间的距离，由此也限制了棱镜型SPRM的分辨率。1998年，H.Kano 等人提出使用高数值孔径显微物镜激发SPR［7］，这种新型结构的SPRM从2000年开始迅速发展［8-9］。通过增加信号接收方向来弥补SPs传播带来的图像模糊［10-12］，高数值孔径物镜型SPRM 的空间分辨率可接近衍射极限，在单细胞、单病毒［13］、单纳米粒子［14］、单分子［15-16］等成像检测方面展现出极大潜力。但由于高数值孔径物镜中存在偏振相关衰减和光学相差，菲涅尔模型不再适用于物镜型SPRM，使得其中SPR的变化难以被定量解释，需要进行复杂的参数矫正［17］，物镜型SPRM的量化分析方法还有待进一步的研究。
聚苯乙烯微球合成成本低、粒径小、疏水性强、分散性好，还具有相对稳定的物理化学性质，在分析
化学、生物医学、标准计量领域中应用广泛，在表面成像检测研究中也发挥出重要的尺度比对与表征作用［13-14，16-19］。本文使用一种新型的高光谱表面等离子体共振显微镜（Hyperspectral surface plasmon resonance microscopy，HS-SPRM）对聚苯乙烯微球进行成像，它将波长检测型的棱镜SPRM与高光谱成像系统相结合。不同于角度扫描型SPRM，波长检测型SPRM不需要频繁改变入射角度，而是从光谱中提取与消逝场内介质等效折射率密切相关的共振信息。高光谱成像系统可以提供样品图像中每个像素点的光谱，这使得HS-SPRM具备在二维空间内像素级的光谱分析能力。使用基于不同偏振的光谱校正方法对聚苯乙烯微球的高光谱数据进行图像优化，对比SPR成像结果与反射式明场显微镜图像，发现二者存在明显差异。
2实验
2.1实验样品
金膜SPR传感芯片制备：玻璃基片依次用丙酮、乙醇、去离子水超声、清洗后烘干，然后在洁净的玻璃基片上依次溅射3nm铬和40nm金。
聚苯乙烯微球样品片制备：购置的聚苯乙烯
什么是tm
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微球（直径9.0~9.9μm ，质量浓度5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用去离子水稀释后滴加在金膜SPR 传感芯片表面，静置至液体自然风干。2.2
实验装置
反射式明场显微图像采集自蔡司金相显微镜（Axio Imager A2m ）。SPR 高光谱数据采集自实验室自研的HS -SPRM 装置，其结构示意图如图1所示。宽带白光经多模光纤接入准直器中，得到较为准直的平行光束。平行光束经过偏振片和孔径光阑进入基于Kretschmann 结构的棱镜型SPR 激发结构，带有检测样品的SPR 传感芯片通过折射率匹配液与45°/45°/90°玻璃棱镜耦合，反射光通过凸透镜进行成像，这里称为一级成像。推扫式高光谱成像仪（GaiaField Pro -V10E ，四川双利合谱公司）通过镜筒与物镜组合成高光谱显微成像光路，垂直放置。调节平面反射镜的位置与角度，可使一级成像光进入高光谱显微成像装置中。保证物镜的工作距离恰好位于一级成像透镜的像平面上，就能获得对焦清晰的样品SPR 图像。
准直器、偏振片和孔径光阑是固定在同一个
带有刻度的旋转台上，可通过调节旋转台调整并读取入射角度（入射光与棱镜直角面法线的夹角）。棱镜可以水平移动，因此可以调整入射光照射在样品上的光斑位置。一级成像透镜的倾斜角度可调节，并且倾斜角度应与偏振片和光阑关于棱镜中轴线镜像对称。平面反射镜的位置和倾斜角度可调节，是主要的光路对准和调焦部件。后续的高光谱显微成像部分为一个整体，可在一定范围内水平、垂直整体平移。2.3
实验方法
将带有聚苯乙烯微球样品的金膜SPR 传感芯片通过折射率匹配液与棱镜耦合，打开光源，调节旋转台使得平行光以0°入射到棱镜直角边，此时可以获得最小的像差［5］。调节偏振片的角度，分别采集0°偏振（Transver electric ，TE 模式）和90°偏振（Transver magnetic ，TM 模式）下聚苯乙烯微球的高光谱SPR 图像。2.4
数据处理
高光谱成像仪采集并保存的高光谱数据是以.raw 格式存储的二维数组，可从中解析出单波段的二维图像信息，或是单像素点的光谱曲线。实验室用自主开发的基于Python 语言的高光谱数据解析软件对高光谱SPR 数据进行进一步处理。将同一入射角度下的TM 模式和TE 模式的高光谱图像视为一组数据，分别用HSI TM 和HSI TE 表示。数据处理过程具体分为以下3步：
（1）自动识别感兴趣区域，去除背景数据。高光谱成像仪的CCD 光电接收器的尺寸是1392pixel×1040pixel ，在前序光路中调整前级成像透镜与平面镜角度与位置时，可能使得最终CCD 接收到的光斑尺寸与位置发生偏差。图2原
始的TM 与TE 偏振SPR 高光谱数据中，无用的黑背景占据了大部分区域，如果将背景数据也代入后续计算，是无用且耗费大量计算资源的，因此需要先对感兴趣区域（Region of interest ，ROI ）进行分割提取，即提取出高光谱显微镜视野范围。利用显微图像光斑皆为圆形的特点，先取单波段灰度图像进行阈值处理识别光斑轮廓，然后根据圆形轮廓计算光斑的圆心与半径，最后生成圆形掩模版用于截取高光谱数据。为了提高自动识别圆形轮廓的准确性，这里选择一系列信噪比较高的单波段图像的轮廓识别结果进行平均。
最
图1
高光谱SPR 显微成像系统装置示意图。LS ：激光泵浦宽带光源；MF ：多模光纤；CD ：准直器；LP ：线性偏振片；AD ：孔径光阑；L ：f =30mm 双胶合消色差透镜；M ：平面反射镜；IP ：L 的像平面；OBJ ：物镜；HSI ：推扫型高光谱成像装置。Fig.1
Schematic diagram of HS -SPRM system （LS ：la‐r -pumped broadband light source ；MF ：multi‐mode optical fiber ；CD ：collimating device ；LP ：linear polarizer ；AD ：aperture diaphragm ；L ：f =30mm achromatic cemented -double lens ；M ：mir‐ror ；IP ：the image plane of L ；OBJ ：objective lens ；HSI ：hyperspectral imaging device ）.
心情总是郁闷怎么办1176
第9期
吴静宁，等：聚苯乙烯微球的表面等离子体共振图像处理与分析
lookinto
终将截取后的感兴趣区域的高光谱数据转存为三维数组。
（2）在图像层面进行光谱校正。在光谱维度上分别对HSI TM 、HSI TE 进行数据切片，得到波长
范围在400~1000nm 间360个单波段灰度图像，
将TM 模式下的单波段图像I n
TM 与TE 模式下的单波段图像I n TE 相比之后进行归一化操作，表达
式如式（1）、（2）所示：
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I n TM/TE =I n TM /I n
TE ，
（1）
I ˉn TM/TE
=
I n TM/TE -min (I n
TM/TE )max (I n TM/TE )-min (I n TM/TE )
，（2）
其中n 为整数且n ∈[1，360]。由此得到360张TM/TE 模式下的单波段归一化图像，再将这些单波段图像拼接成数据立方体HSI TM/TE 。
（3）在光谱层面进行图像平滑。在空间维度上对HSI TM/TE 进行分割，提取每个像素点的光谱，进行多项式平滑滤波，去除光谱噪声。最终
得到光谱校正的平滑的高光谱数据。
图2
pestleSPR 高光谱数据立方体处理方法与流程示意图
Fig.2
Schematic diagram of the SPR hyperspectral data cube processing method and procedure
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第37卷
液晶与显示
仅TM 偏振光可激发SPR 现象，故TE 模式数据中的光谱即为经过棱镜全反射的光源光谱。因此数据处理得到的TM/TE 模式下的光谱曲线可视为消除了光源光谱影响的校正曲线，SPR 共振峰的位置更加显而易见。此外，在整套光路系统中可能存在难以清除的尘埃或是光学器件瑕疵，在高光谱成像结果中形成固有污点，使用上述数据处理的方法可以大幅降低固有污点的对比度，削弱固有污点对SPR 图像分析的影响。
3
结果与讨论
3.1
聚苯乙烯微球SPR 图像处理效果
图3（a ）、（b ）分别为TM 偏振与TE 偏振的原
始高光谱伪彩色图像，仅在发生SPR 的TM 偏振图像中隐约可见聚苯乙烯微球的轮廓。图3中“P1”所指的是一个聚苯乙烯微球样品所在的位置，“P2”指向无样品的位置。图3（e ）、（f ）分别为TM 偏振与TE 偏振图像中箭头指向的单像素点的原始光谱。TM 偏振中的聚苯乙烯微球与空
气介质的SPR 共振光谱存在明显区别，故而在高光谱伪彩色图像中体现出可区分微粒轮廓的色彩差异。TE 偏振不发生SPR ，故两个位置点的光谱一致，均为经棱镜全反射的光源光谱。
光学系统中的固有污点在成像结果中呈现为未聚焦的黑色衍射光斑，极大地影响了SPR 图像中对微粒样品位置与轮廓的判断与分析。这些固有污点存在于成像系统中，不会随样品或光源偏振的改变而改变，但位置与尺寸会因装置放大倍数以及棱镜出射光方向产生细微差别。采用前述的数据处理方法第二步后得到TM/TE 模式下的SPR 图像，如图3（c ）所示，可见固有污点的对比度被大幅降低，微粒样品的轮廓得以凸显，但光谱中的随机噪声也被增强。校正后的光谱不再具有光源光谱本身的特征，如图3（g ）所示，由此避免了光源光谱对SPR 共振信息提取造成影响。进一步对TM/TE 模式下的SPR 高光谱数据进行光谱平滑，得到的结果如图3（d ）、（h ）所示，图像与光谱曲线中的随机噪声得以削弱，更有利于SPR 共振峰信息的精确提取。
3.2明场反射显微图像与SPR 图像的对比与分析
图4展示了聚苯乙烯微球样品片上同区域的
反射式明场显微镜成像结果与SPR 成像结果，箭头指出的聚苯乙烯微球“ps1~ps8”在图4（d~f ）中依次对应。对比明场反射图像与SPR
图像发
图3聚苯乙烯微球的SPR 图像处理效果。（a ）未经处理的SPR 高光谱伪彩色图像；（b ）未经处理的TE 偏振高光谱伪彩色图像；（c ）按照TM/TE 模式处理后的SPR 高光谱伪彩色图像；（d ）曲线平滑处理再按照TM/TE 模式处理得到的SPR 高光谱伪彩色图像；（e~h ）分别为图3（a~d ）中指示的单像素点对应的光谱曲线。
Fig.3SPR images processing effect of polystyrene microspheres.（a ）Original SPR hyperspectral pudocolor image ；（b ）Original TE -polarized hyperspectral pudocolor image ；（c ）SPR hyperspectral pudocolor image procesd in TM/TE mode ；（d ）Smoothed TM/TE mode SPR hyperspectral pudocolor image ；（e~h ）Single -pixel SPR spectra indicated in Fig.3（a~d ）.
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