对虾偷死野田村病毒(CMNV) RT-PCR 检测方法的建立
作者：张达云
来源：《农家致富顾问·下半月》2016年第03期
postcrossing 摘要：参考 GenBank 中对虾偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus， CMNV）的基因序列，应用 Primer Premier5.0 软件设计了一对引物，建立了适合CMNV快速检测的RT-PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的CMNV cDNA简繁翻译片段为模板进行PCR扩增，得到了预期大小为210bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序，测序结果与GenBank中的CMNV的相应序列比对分析，确定为CMNV的基因序列。以对虾常见IHHNV（传染性皮下及造血组织坏死病毒）、WSSV（对虾白斑综合症病毒）、TSV（桃拉病毒）、YHV（黄头病毒）等病毒核酸片段为模板，用设计的引物进行PCR，结果均为阴性。该方法敏感性检测结果表明，最低RNA模板检出量为2pg。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点，可用于对虾CMNV的快速检测。
拉丁语名字关键词： 虾 ； 病毒 ；检测方法
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
从宁波市多个南美白对虾育苗场分别采集10日龄虾苗幼体1000尾左右，95%酒精保存，CMNV、IHHNV（传染性皮下及造血组织坏死病毒）、mobile phoneWSSV（对虾白斑综合症病毒）、TSV（桃拉病毒）、YHV（黄头病毒）阳性样品为本实验室的保存样品。上海生工的“柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒”和“胶回收纯化试剂盒”、康为世纪“HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒”、 行尸走肉第六季什么时候出康为世纪“2×Taq MasterMix”。
1.2 病毒RNA提取
根据上海生工的柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒，操作如下：
将阳性虾苗用RNa-free研磨器研磨匀浆后，取25-50mg匀浆产物加入1.5ml RNa-free离心管中，加入450μl Buffer Rlysis-AG，立即震荡混匀，室温放置3min；12，000rpm，4℃表语是什么离心3min，将上清移至新的1.5ml RNa-free我的好朋友英语作文离心管中，加入1/2体积无水乙醇，充分混匀后，转移至吸附柱中，静置1min，室温12，000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入胸罩英语500μl GT solution，静置1min，室温10，000rpm离
心疯狂英语阅读版1min，倒掉收集管中废液；再加入500μl NT Solution，静置2min，室温10，000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；室温12，000rpm空转离心2min；将吸附柱放入新的RNa-free的离心管中，在吸附膜中央加入40μl DEPC处理的水，静置presnter2min，室温12，000rpm离心2min，得到总RNA。
