六级吧脂肪间充质干细胞来源外泌体对血管基质成分
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脂肪间充质干细胞来源外泌体对血管基质成分
新概念作文大赛作品
造血功能的作用及机制研究
中文摘要
造血干细胞移植已广泛应用于血液病的临床治疗实践中。供者来源困难限制了造血干细胞移植在临床的应用。脂肪组织血管基质成分（SVF）中含有少量造血干/祖细胞。脂肪间充质干细胞（ADSC）是一种多能干细胞，可以通过调控SDF-1-CXCR4轴促进造血干细胞的归巢，并且支持造血重建。但ADSCs的安全性使其成为临床使用中的&ldquo；双刃剑”。间充质干细胞外泌体（exosomes）是间充质干细胞在释放到细胞外基质的膜性囊泡。外泌体具有与其来源母细胞相同的功能。
研究目的：
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1.明确SVF中造血干/祖细胞的生物学特性；
2.分离并鉴定脂肪间充质干细胞外泌体（ADSC-exosomes）；
3.探讨ADSC-exsomes是否可通过SDF-1/CXCR4促进SVF的有效归巢；
袋狸>pint4.探讨共移植方式是否有助于SVF移植后的造血重建。
研究方法：
1. I型胶原酶摇床消化消化脂肪组织，分离获取SVF细胞。通过细胞形态、流式细胞表型分析、造血干细胞集落培养、脾集落形成实验证实SVF中存在功能性造血干/祖细胞。
2. 运用贴壁培养法分离纯化ADSC，对其进行表型和功能型鉴定。从第3代ADSC细胞培养上清液中分离ADSC-exosomes。通过透射电镜形态学、BCA蛋白浓度分析、Western Blot 检测ADSC-exosomes表面标记。
3. ADSC-exosomes与SVF共培养后，不同时间点检测细胞总数、CD34+细胞比例及造血干细胞集落培养，探讨ADSC-exosomes对SVF细胞增殖的影响，共培养后的SVF中所含的造血干细胞是否仍具有增殖分化能力；共培养后不同时间点RT-PCR检测SDF-1/CXCR-4 mRNA表达水平，明确ADSC-exosomes对SVF归巢的作用及相关机制；将SVF用CM-DIL 标记后植入辐照后的NOD/SCID小鼠，不同时间点荧光显微镜下观察SVF在各脏器的定植及在胫骨骨髓腔的定位。
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4.ADSC-exosomes与SVF共同植入半清髓NOD/SCID小鼠体内，通过生存分析、血常规、骨髓常规、GVHD评估、流式细胞hCD45比例、造血干细胞集落培养等指标探讨ADSC-exosomes与SVF共移植是否有助于实现造血重建。
研究结果：
1.用I型胶原酶可以从脂肪组织中分离处SVF，SVF中含有功能型的造血干/祖细胞。2．ADSC培养48小时后收集培养上清，利用超高速离心法可以获得ADSC-exosomes，透射电子显微镜观察ADSC-exosmes是一群直径50nm左右的球状体，Western Blot结果显示CD63阳性。
3.ADSC-exosomes与SVF共培养后细胞数及CD34+细胞比例随时间延长增加；早期培养细胞造血干细胞集落形成能力强；并能增加CXCR4和SDF-1mRNA的表达，在24h时增加显著。ADSC-exosomes与SVF共移植组有更多的SVF归巢至骨髓腔。
4.ADSC-exosome+SVF共移植外周血象恢复时间较前缩短，骨髓抑制恢复加快，骨髓细胞中hCD45比例增加。
结论：
1. SVF中存在功能性的造血干/祖细胞；
2. 超速离心法是获取ADSC-exosome的有效方法；
3. ADSC-exosome通过调节SDF-1/CXCR4轴有助于SVF的归巢。
4. ADSC-exosome有助于SVF移植后的造血重建。
关键词：血管基质成分；脂肪间充质干细胞；外泌体；造血干细胞
作者：黄珍
指导教师：栾佐教授
The role and mechanism of exosomes derived from adipo stem cells on the hematopoietic function ofthe world as i e it
stromal vascular fraction
ABSTRACT
Hematopoietic stem cell transplantation has been widely ud in the clinical treatment of hematological dias. Donor source difficulties have been limited to the clinical application of hematopoietic stem cell transplantation. Adipo tissue stromal vascular fraction (SVF) containing hematopoietic stem / progenitor cells, but its content is less, and the homing efficiency is low. Adipo derived menchymal stem cells (ADSC) is a kind of multipotent stem cells, can regulate th
e SDF-1-CXCR4 axis to promote the homing of hematopoietic stem cells, and hematopoietic reconstruction. However, the curity of ADSCs is limited in clinical u. Exosomes is creted by menchymal stem cells into the extracellular matrix. The exosomes has the same function as its mother cell.
AIM:
1.To identify the biological characteristics of hematopoietic stem / progenitor cells in SVF;
2.Isolation and purification of adipo derived menchymal stem cells (ADSC-exosomes);
3.To investigate whether ADSC-exsomes can through the effective regulation to promote the homing of SDF-1/CXCR4 SVF;
4.To confirm ADSC-exsomes transplantation contributes to hematopoietic reconstitution after SVF transplantation.
Methods:
1.with 0.1% collagena digestion of shaker adipo tissue isolated from SVF cells. The function of
hematopoietic stem / progenitor cells in SVF was confirmed by cell morphology, flow cytometry, hematopoietic stem cell colony culture and spleen colony formation assay.
2.ADSC was isolated and purified by adherent culture, and its phenotype and function were identified. Isolation of ADSC-exosomes from the third generation ADSC cell culture supernatant. ADSC-exosomes surface markers were detected by transmission electron microscopy, BCA protein concentration and Western Blot.
3.Co culture ADSC-exosomes and SVF, count the total number of cells at different time points to detect the percentage of CD34+ cells and hematopoietic stem cell colony culture, to explore the effects of ADSC-exosomes on proliferation of SVF cells, including SVF after hematopoietic stem
cells still have the ability of proliferation of co culture; co culture at different time points after RT-PCR detection, SDF-1/CXCR-4 the expression level of mRNA, a clear effect of ADSC-exosomes on SVF homing and related mechanism; SVF labeled with CM-DIL after implantation after irradiation NOD/SCID. The localization of SVF in different organs at different time points and the localization of bone marrow cavity in the tibia were obrved.
4 ADSC-exosomes and SVF co implanted mi myeloablative mice through survival analysis, routin
e blood test, bone marrow routine, GVHD evaluation, flow cytometry, the proportion of hCD4
5 cell colony culture index of ADSC-exosomes and SVF co transplantation will contribute to hematopoietic reconstitution of hematopoietic stem.
Result:
1.SVF can be isolated from adipo tissue by collagena, and SVF contains functional hematopoietic stem / progenitor cells.
2.ADSC after 48 hours of incubation, culture supernatants were collected, ADSC-exosome can u the ultra high speed centrifugation and transmission electron microscopy ADSC-exosmes is a spherical body diameter of about 50nm, Western and Blot showed CD63 positive.
3.ADSC-exosome after coculture with SVF cells and CD34+ cell ratio increas; colony forming ability of hematopoietic stem cells cell culture early; incread expression of CXCR4 and SDF-1mRNA, a significant increa in 24h. SVF labeled with CM-DIL were found after implantation in vivo transplantation group SVF cell homing to the bone marrow cavity more.
4, ADSC-exosome+SVF co transplantation of peripheral hemogram recovery shorter than before, ac
celerate the recovery of bone marrow suppression, the proportion of hCD45 in bone marrow cells incread.
Conclusion:
1 functional hematopoietic stem / progenitor cells in SVF;
2 ultracentrifugation is an effective method to obtain ADSC-exosome;
3 ADSC-exosome by adjusting the SDF-1/CXCR
4 homing to help SVF.
4 ADSC-exosome promotes hematopoietic reconstitution after SVF transplantation.
Key words: vascular matrix components; adipo derived menchymal stem cells; exocrine; hematopoietic stem cells
Name: Zhen Huang
Supervisor: Zuo Luan Professor
前言
造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs)是存在于造血组织中的一群具有自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞。其主要功能是分化为各系造血祖细胞, 进一步可分化成红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系及淋巴细胞系。同时HSCs又能自我更新即自我复制, 维持自身数量不变, 从而能长期维持机体的正常造血机能[1]。
客房服务员英文
目前来源于骨髓或脐血的造血干细胞移植已应用于血液病的临床治疗实践中，已成为治疗或治愈下述几类疾病的最有效方法，包括：○1恶性血液病（如白血病、淋巴瘤、重型再生障碍性贫血等）；○2遗应用传代谢性疾病（如粘多糖病、尼曼匹克病、戈谢病等）；○3自身免疫病（如系统性红斑狼疮、皮肌炎、多发性硬化症等）○4某些实体瘤等病（如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等）[2, 3]。然而，移植成功与否与供受者间人类白细胞抗原(HLA)的相容性密切相关[4]。非血缘骨髓供者的寻找，取决于供者库的大小及受者HLA位点频率的分布。非血缘脐血移植，虽然对HLA要求不如骨髓严格，但由于每份脐血细胞数量有限、造血恢复较慢，这大大限制了其临床应用。因此，供者来源困难限制了造血干细胞移植在临床的应用。若能找到患者自身新来源的HSC供回输使用，不仅能有效减低移植物抗宿主病和排斥反应，还可以使上述供者来源困难的限制问题得以解决，使更多病人可能受益于造HSCs移植。
骨髓是从胚胎末期一直到出生后HSCs 的主要来源。成年人血液HSCs约占骨髓细胞的0.05%。HSCs
中一小部分能在未受任何刺激的情况下一直在骨髓与外周血之间进行循环[6, 7]，在其从外周血返回骨髓的途中，能在具有适宜环境的肝脏、脾脏、肌肉以及胸导管等处定居下来[8-12]。因此，髓外一些器官组织也会含有HSCs。
脂肪组织（Adipo tissue，A T）是人体最大的器官之一，作为一个重要的内分泌器官，其参与机体能量调节，炎症和免疫反应[1]。A T来源于中胚层，由成熟的脂肪细胞和血管基质成分（stromal vascular fraction，SVF）两种不同的细胞群组成。SVF是一组异质性的细胞群，含有周细胞、内皮细胞、基质细胞和巨噬细胞等[6]。SVF 也是造血祖细胞和中胚层干细胞（可以分化为成骨的、成软骨的以及肌源性、神经源性细胞系）的来源之一。Cousin等人于2003年的动物试验首次揭示小鼠脂肪组织基质血管成分（SVF）在受体小鼠体内有造血功能。SVF中约占3%的CD45+ CD34+ 干细胞能支持经致死剂量照射过小鼠骨髓中造血功能的内源性重建，10周以后仍能从受鼠的骨髓、脾、外周血中检测到供体来源的细胞，并可分化为不同系的血细胞。Han等证实小鼠脂肪组织SVF中存在功能性Lin-Sca-1+c-kit+HSPCs。但也同时发现SVF中功能性造血干细胞的归巢效率非常低，仅为骨髓中造血干细胞的1/10，而这将影响SVF的植入。为增加造血干细胞的植入，除了增加移植细胞数量，是否可以通过其它方式增加SVF的归巢，提高SVF移植的效率。
趋化因子SDF-1（stromal-derived factor 1，SDF-1）与其受体CXCR4（C-X-C chemokine
receptor type 4）在诱导造血干细胞归巢、实现有效植入和维持长期造血中发挥着重要的作用。Ponomaryov等发现SDF-1在骨髓损伤部位分泌增加，有利于损伤修复和移植后造血的重建。CXCR4是SDF-1在体内的唯一受体的。研究表明CXCR4在造血前体细胞中有较高的表达，化学趋化因子、粘附分子、间质细胞等可以调节其表达水平。在加入各种细胞因子后，造血前体细胞CXCR4表达水平迅速上调，从而对SDF-1浓度梯度所产生的趋化作用增强。在给予一定浓度的SDF-1诱导后，CD34+细胞CXCR4的表达增加，能加快造血干细胞移植的造血恢复。研究发现除造血前体细胞外，CXCR4在骨髓间充质干细胞（Menchyma Stem Cell，MSCs）表面也可持续表达。这表明间充质干细胞通过SDF-1-CXCR4轴不仅可调节造血干细胞的归巢与生存发育，也有利于自身的正确归巢，支持造血干细胞的长期造血。
HSCs在骨髓造血微环境中进行增殖、分化和发育。1978年Schofield提出了骨髓&ldquo；龛”（niche）的概念。HSCs定位在这个&ldquo；龛&rdquo；内，与骨内膜细胞、网状基质细胞、内皮细胞紧密接触。间充质干细胞是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞，因此它与骨髓微环境关系密切。除此之外，间充质干细胞还可以分泌多种支持造血的细胞因子如干细胞生长因子（Stem Cell Factor，SCF）、白介素-6( interleukin 6，IL-6)、血小板生长因子等，并能表达多种细胞粘附分子如细胞间粘附分子1（Intercellular Adhesion Molecule 1，ICAM-1）、血管细胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM），从而对造血功能起到辅助、
补充、支持和调节作用。因此MSCs对于造血干细胞移植有巨大的作用：1. 促进造血干细胞的增殖：目前研究证实，以MSCs做为滋养层细胞时，可明显扩增共同培养的HSCs；2.可以促进HCSs的植入及造血重建：在HCSs 数量有限的情况下，将体外扩增的MSCs与HCSs共移植给NOD/SCID小鼠，可以缩短造血重建时间，促进造血干细胞的成功植入；3.通过免疫调节作用防治移植物抗宿主病（graft versus host dia,GVHD）：MSCs可抑制T细胞、NK细胞增殖，并抑制B细胞的分化，从而预防或改善HSCT后的GVHD。但随着干细胞研究的深入，发现间充质干细胞移植也存在一定的风险，如静脉移植细胞可能会引起毛细血管栓塞，体外反复传代培养的细胞可能存在遗传物质变异等问题，从而使间充质干细胞成为临床使用中的一把&ldquo；双刃剑”。因此寻找一种既能够替代干细胞移植，又具有上述干细胞修复活性的物质变得尤其重要。
间充质干细胞外泌体（MSCs-exosomes）是MSCs分泌到细胞外的一种纳米级膜性囊泡。表面高表达CD9、CD81、CD63，并且含有大量的生物信息传播介质，如miRNA的遗传信息及其它一些具有生物活性的物质[24]。外泌体大小约30-120nm，能通过血脑屏障及血脑脊液屏障[28]，免疫原性低，半衰期长，能进行长时间、远距离的运输。因此，作为干细胞治疗领域的新工具，外泌体近些年逐渐引起关注[29]。
研究发现间充质干细胞释放的exosomes同样具有明显的组织修复作用。在心肌缺血再灌注损伤模型中，在再灌注损伤发生前5 min 静脉注入MSC-exosomes，可以使梗死面积减少45%，并且exosomes
大家好的英文的注入剂量与减少的梗死面积呈正相关。在顺铂导致的急性肾损害模型中，人脐带血来源的MSCs-exosomes可以通过激活P38MAPK信号通路，减轻肾小管上皮细胞的凋亡，改善肾脏功能。2014年Kordelas将MSCs来源外泌体应用于allo-HSCT后aGVHD的治疗。一例难治性aGVHD病人经MSCs外泌体治疗后，腹泻量明显减少，皮肤粘膜aGVHD表现也明显缓解，激素用量减少，疗效持续至治疗后4个月。目前间充质干细胞外泌体的研究主要集中于肿瘤、免疫、心血管等领域，在造血系统的研究刚起步。造血干细胞分泌的外泌体质膜表面同样表达造血干细胞的标记如CD34、CXCR4、CD133 。将HSPCs和MSCs在含有荧光标记CD133 分子外泌体的培养基中共同培养，6小时后MSCs 细胞中含有荧光信号，而HSPCs中并没有检测到荧光信号，表明细胞内在化外泌体是有选择性的。MSCs可以促进造血干细胞的增殖，通过SDF-1-CXCR4轴可以调节造血干细胞及
