甜叶菊苷M的毒理学安全性评价
武新月，赵悦，施伟庆，陆罗定，陈耿，吴俊，俞萍
（江苏省疾病预防控制中心，江苏南京 210009）
摘要：甜叶菊苷M是在甜叶菊中发现的糖苷类物质，已被确定为一种潜在的甜味剂。本研究依据食品安全国家标准，采用小鼠急性经口毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓红细胞微核试验、小鼠精母细胞染色体畸变试验和28 d经口毒性试验对甜叶菊苷M进行了安全性评价。结果显示：甜叶菊苷M对雌雄小鼠急性经口MTD值均大于10000 mg/kg·bw，属实际无毒级；Ames试验、小鼠骨髓红细胞微核试验和小鼠精母细胞染色体畸变试验均为阴性；将样品以2000、1000和500 mg/kg的设计剂量掺入基础饲料中喂养大鼠28 d后，各剂量组雌雄动物的体重、摄食量、食物利用率、血液学、血生化和组织病理学等指标与对照组相比无明显异常。样品对雌、雄大鼠未观察到有害作用剂量（NOAEL）分别为2650和2421 mg/ kg·bw t。研究结果表明，甜叶菊苷M未见急性毒性、遗传毒性和短期毒性，具有较高的食用安全性。
关键词：甜叶菊苷M；甜菊糖苷；急性毒性；遗传毒性；短期毒性；安全性评价
文章篇号：1673-9078(2021)03-250-258 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2021.3.0760 Toxicological Safety Evaluation of Stevioside M
WU Xin-yue, ZHAO Yue, SHI Wei-qing, LU Luo-ding, CHEN Geng, WU Jun, YU Ping
(Jiangsu Provincial Center for Dia Control and Prevention, Nanjing 210009, China) Abstract: Stevioside M is a glycoside found in the leaves of Stevia rebaudiana (Bertoni) that has been identified as a potential sweetener. The safety of stevioside M was evaluated according to the national food safety standard, using the acute oral toxicity test, Ames test, mou bone marrow erythrocyte micronucleus test, mou spermatocyte chromosome aberration test, and 28 day oral toxicity test. The results showed that the acute oral MTD values of stevioside M in both male and female mice were higher than 10000 mg/kg·bw, indicating that stevioside M was practically non-toxic; the results of Ames test, mou bone marrow erythrocyte micronucleus test, mou spermatocyte chromosome aberration test were negative; after the 28 day administration with the basic diet incorporated by stevioside M at designed dos of 2000, 1000 and 500 mg/kg, no significant changes were found in indices including body weight, food intake, food utilization rate, hematology, blood biochemistry and histopathology between each do group and control group. The No Obrved Adver Effect Level (NOAEL) of female and male mice were 2650 and 2421 mg/ kg·bw. The results indicate that stevioside M has no acute toxicity, genetic toxicity or short-term toxicity, and is therefore of high food safety.
Key words: stevioside M; steviol glycosides; acute toxicity; genetic toxicity; short-term toxicity; safety evaluation
引文格式：
武新月，赵悦，施伟庆，等.甜叶菊苷M的毒理学安全性评价[J].现代食品科技,2021,37(3):250-258
WU Xin-yue, ZHAO Y ue, SHI Wei-qing, et al. Toxicological safety evaluation of stevioside M [J]. Modern Food Science and Technology, 2021, 37(3): 250-258
甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）俗称甜菊、甜草[1]，原产于巴西南部和巴拉圭北部之间的阿曼拜山脉，是一种多年生的菊科草本植物[2]。已有的研究表明，甜叶菊具有显著的抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病以及抗肿瘤等作用[3-7]。目前从甜叶菊中分离得到的成分主要有甜菊糖苷、三萜类、黄酮类、植物甾醇、收稿日期：2020-08-14
作者简介：武新月（1993-），女，检验师，研究方向：食品与健康
通讯作者：俞萍（1973-），女，主任医师，研究方向：毒理学检测与功能评价 挥发油和香豆素类等[8]，甜菊糖苷作为低热量、无毒的天然甜味剂，甜度高出蔗糖300倍，因此成为非热糖替代品应用于食品、饮料、酿酒等生产工艺中[1,9]。甜菊糖苷是一类由多种甜味成分组成的四环二萜类化合物，包
照片英文括甜菊苷、莱鲍迪苷A（rebaudioside A，reb A）、莱鲍迪苷B（rebaudioside B，reb B）、莱鲍迪苷C（rebaudioside C，reb C）、莱鲍迪苷E（rebaudioside E，reb E）、莱鲍迪苷F（rebaudioside F，reb F）、莱鲍迪苷M（rebaudioside M，reb M）、甜茶苷、杜克苷和甜菊双糖苷等[10]。其中甜菊苷和reb A作为甜菊糖苷
250
的主要甜味成分，含量最高（约占85%），但其味道带有强烈的苦涩，一定程度上限制了甜菊糖苷的应用[11]。相比之下，reb M则甜度高，口感干净，苦味大大降低，风味更加令人愉悦，但在甜菊糖苷中的含量极低（约占0.06%），因此作为甜味剂的开发和利用受到很大挑战[12-14]。为了解决这一难题，研究者通过发酵和生物转化的方法，使用基因工程改造的酵母菌将甜菊糖苷转化成reb M，从而有效地提高reb M的产量[15,16]。以甜菊糖苷为原料，在麦芽糖淀粉酶和葡萄糖淀粉酶以及毕赤酵母提取液的作用下充分反应，分离反应混合物，去除蛋白残渣得到上层清液。然后将上层清液加入大孔树脂进行吸附，接着用水冲洗树脂柱，再用乙醇洗提数次，经浓缩、结晶、干燥后可得到reb M及其同分异构体的混合物，称为甜叶菊苷M （stevioside M）。目前对甜叶菊苷M有限的研究中，主要是从化学结构、甜度和理化性质等方面进行的[17,18]，而对甜叶菊苷M的毒理学安全性评价则尚未有报道。本研究按照国家卫生和计划生育委员会发布的《食品安全性毒理学评价程序与方法》[19]，采用小鼠急性经口毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓红细胞微核试验、小鼠精母细胞染色体畸变试验和28 d
经口毒性试验对甜叶菊苷M的毒理学安全性进行评价，为甜叶菊苷M的进一步开发应用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样品
甜叶菊苷M：由无锡新和源生物制造有限公司提供。
1.1.2 主要试剂
鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535，美国Moltox公司；S9，齐氏生物科技有限公司；敌克松，AccuStandard公司；叠氮钠，浙江东阳市天宇化工有限公司；2-氨基芴，Fluka AG公司；1,8-二羟基蒽醌，SIGMA-ALDRICH公司；环磷酰胺，Sigma公司；丝裂霉素，浙江海正药业股份有限公司；秋水仙素，国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 试验动物
leden
SPF级健康ICR雌、雄小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司提供，生产许可证号：SCXK（苏）2016-0003号；SPF级健康SD雌、雄大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006号。
1.1.4 仪器与设备
电子天平：PL203型，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；生化培养箱：LRH-400型，韶关市泰宏医疗器械有限公司；生物显微镜：OLYMPUS CX41RF 型，日本日立公司；生化分析仪：OLYMPUS AU640型，日本日立公司；电解质分析仪：PSD-15b型，南京攀事达电子仪器有限公司；血细胞分析仪：ADVIA 2120型，德国西门子公司；全自动血凝仪：Coatron 1800型，德国TECO公司；尿分析仪：Scan 500型，德国科宝公司；半自动石蜡切片机：RM 2245型，德国莱卡公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠急性经口毒性试验（限量法）
选取SPF级健康ICR小鼠20只，雌雄各半，体重为18.5~21.3 g。给样前禁食6 h。准确称取样品10000 mg加纯净水至30 mL搅拌成均匀的糊状物，采取一次灌胃给予，灌胃容量为30 mL/kg·bw，剂量为10000 mg/ kg·bw。灌胃后连续观察14 d，记录中毒表现及死亡情况。
1.2.2 Ames试验
平板掺入法。使用菌株鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535。采用β-萘黄酮和苯巴比妥联合诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。准确称取样品1000 mg，加入DMSO溶解定容至20 mL，经121 ℃，20 min高压灭菌。试验设5个剂量组，分别为5000、1000、200、40和8 μg/皿，同时设自发回变组，溶剂对照组和阳性对照组。每个测试点做3个平行皿，同样实验条件下测试两次。
1.2.3 小鼠骨髓红细胞微核试验
SPF级健康ICR小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，分别为6670、3330、1670 mg/kg·bw三个剂量组，溶剂对照组（纯净水）和阳性对照组（环磷酰胺40 mg/kg·bw）。采用30 h两次灌胃法，每次灌胃容量为20 mL/kg·bw。于末次给药后6 h颈椎脱臼处死动物，取股骨骨髓于小牛血清中涂片、固定、染色。显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），记录含微核的细胞数，并计算含微核细胞率；每只动物计数200个嗜多染红细胞，同时计数正染红细胞（NCE），计算PCE在总红细胞中的比例。
1.2.4 小鼠精母细胞染色体畸变试验
SPF级健康雄性ICR小鼠25只，随机分为5组，分别为6670、3330、1670 mg/kg·bw三个剂量组，溶剂对照组和阳性对照组。样品各剂量组和溶剂对照组的灌胃容量为20 mL/kg·bw，每日灌胃1次，连续5 d；
251
252
阳性对照组仅于实验第1 d 腹腔注射一次，注射量为10 mL/kg·bw 。试验第14 d 处死动物，取双侧附睾精子滤液制片镜检。显微镜下，每只动物计数500个精母细胞，记录染色体畸变细胞数，并计算畸变细胞率。
1.2.5 28 d 经口毒性试验
SPF 级健康SD 大鼠，雌雄各40只，随机分为4组，分别为2000、1000、500 mg/kg·bw 三个样品剂量组和基础饲料对照组。采用逐步稀释的方法将样品掺入基础饲料中，以每日约100 g/kg·bw 的摄食量给予大鼠自由食用，连续喂养28 d 。每日观察动物的一般表现，记录中毒体征和死亡情况。每周称量体重和进食量，计算食物利用率。试验结束时采血进行血液学检查、血清生化和电解质检查。血液学检查指标包括白细胞（WBC ）、红细胞（RBC ）、血小板（PLT ）计数、血红蛋白（HGB ）浓度
、红细胞压积（HCT ），中性粒细胞（NE ）、淋巴细胞（LY ）、单核细胞（MO ）、嗜酸性粒细胞（EO ）、嗜碱性粒细胞（BA ）分类，凝血酶原时间（PT ）、活化部分凝血活酶时间（APTT ）；血清生化检查指标包括丙氨酸氨基转移酶（ALT ）、天
门冬氨酸氨基转移酶（AST ）、谷氨酰转肽酶（GGT ）、
碱性磷酸酶（ALP ）、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖（GLU ）、尿素氮（BUN ）、肌酐（CRE ）、总胆固醇（CHO ）、甘油三酯（TG ）；尿液检测指标包括相对密度（SG ）、pH 值、尿蛋白（PRO ）、尿糖（GLU ）和潜血（ERY ）。采血后进行大体解剖检查，并称量心脏、胸腺、肾上腺、肝、肾、脾、睾丸、脑的绝对重量，计算脏/体比值；固定保存各组动物的脏器，先对高剂量组和对照组动物的脑、甲状腺、胸腺、心脏、肝、肾、脾、肾上腺、胃、十二指肠、结肠、胰、肠系膜淋巴结、睾丸、卵巢、膀胱进行组织病理学检查，若发现病变再对较低剂量组相应脏器及组织进行检查。
1.3 数据分析
试验所得数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析。用泊松分布U 检验法对骨髓红细胞微核试验结果进行分析；用卡方检验对小鼠精母细胞染色体畸变试验结果进行分析。
表1 甜叶菊苷M 对小鼠体重的影响
Table 1 Effects of stevioside M on body weight in mice (⎯x±s)
性别 动物数/只
剂量/(mg/kg·bw)
初始体重/g
第1周体重/g
第2周体重/g
死亡数/只
MTD/(mg/kg)
雌 10 10000 19.91±0.77 23.38±1.21 27.00±1.64 0 >10000 雄
10 10000 20.03±0.91 26.87±1.10 30.55±1.84 0 >10000
表2 Ames 试验结果
Table 2 Results of Ames test (n=3,⎯x±s)
测试次数
组别 TA97a TA98
TA100
TA102 TA1535
+S 9 -S 9 +S 9 -S 9 +S 9 -S 9 +S 9 -S 9 +S 9 -S 9 第1次 测试 自发回变 122±9 115±8 33±4 32±3 120±6144±7 295±7 287±24 14±4 13±5 8 μg/皿 107±4 113±3 30±131±3 119±4120±6 315±15 289±7 16±617±4 40 μg/皿
105±7
109±4 30±2
30±2 108±6130±5 307±17 284±8 15±117±2 200 μg/皿 109±5 104±8
33±332±3 113±4139±3 300±14 280±16 19±418±3 1000 μg/皿 106±11 106±3 33±3
32±3
110±4
139±4
314±9 286±8 16±4
15±4 5000 μg/皿 107±8 105±7
30±231±2 115±3
141±5 315±7 284±7 15±5
21±2
溶剂对照 114±10 112±7
41±2 34±3 127±5134±6 310±22 297±8 11±4 15±2
阳性对照 1052±69** 1142±96** 896±35**769±99**905±8
**922±107**
830±82** 888±40** 200±11**418±32**
第2次 测试 自发回变 115±10 120±8
34±2 32±3 116±13135±7 289±5 283±16 17±3 12±3 8 μg/皿 108±6 109±10 34±2 34±2 116±13135±9 307±12 279±12 19±3 11±3 40 μg/皿
119±10 110±7 35±5 34±3 112±7
139±6 324±9 295±8 20±1 13±6 200 μg/皿 108±17 111±3
36±3 34±2 116±6142±8 31320± 286±12 19±2 12±2 1000 μg/皿 117±3 110±8 38±2 35±3 117±3
146±6 314±11 283±16 17±1 13±4 5000 μg/皿 118±4 104±8 36±4 34±4 119±16157±9 308±3 289±5 18±5 13±3 溶剂对照
124±8 113±11 34±2 28±3 114±10
141±5 300±2 276±10 17±3 10±1
阳性对照 940±65** 1143±110** 921±65**761±73**
910±24**911±69**
892±92** 818±76** 250±76**533±62**
注：**表示超过溶剂对照2倍以上。
253
2 结果与分析
2.1 小鼠急性经口毒性试验
小鼠灌胃后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。观察期结束后，大体解剖未见明显异常。由表1可见，甜叶菊苷M 对动物体重无明显影响；本次试验中样品对雌雄小鼠急性经口MTD 值均大于10000 mg/kg b·wt （相当于估计最大摄入量的1312倍），根据小鼠急性经口毒性分级标准，该样品属
于实际无毒级。
2.2 Ames 试验
剂量达5000 μg/皿各平板背景菌苔均生长良好。由表2可见，在加与不加S 9的情况下，两次测试，样品各剂量组五种菌株的回变菌落数均未达到空白对照组的2倍，且无剂量-反应关系，而阳性对照组均表现出强烈的诱变作用。在本试验条件下，甜叶菊苷M 对标准测试菌株TA97a 、TA98、TA100、TA102和TA1535
不具有致突变作用，Ames 试验结果为阴性。这一结果与文献报道的rebA 的Ames 阴性[20]结果一致。
2.3 小鼠骨髓红细胞微核试验
由表3可见，与溶剂对照组相比，样品各剂量组含微核细胞率差异均无统计学意义（p >0.05），也无剂量-反应关系；阳性对照组含微核细胞率与溶剂对照组相比差异具有统计学意义（p <0.01）；样品各剂量组动物PCE 占红细胞总数的比例均高于对照组的20%。表明甜叶菊苷M 小鼠骨髓红细胞微核试验结果为阴性。
2.4 小鼠精母细胞染色体畸变试验
由表4可见，样品各剂量组小鼠初级精母细胞染色体畸变细胞率与溶剂对照组相比，差异均无统计学意义（p >0.05），也无剂量-反应关系；阳性对照组与溶剂对照组的染色体畸变细胞率、性染色体和常染色体单价体、断裂和裂隙差异均具有统计学意义（p <0.01，p <0.05）。提示甜叶菊苷M 对小鼠初级精母细胞染色体无致畸变作用，试验结果为阴性。
表3 小鼠骨髓红细胞微核试验结果
Table 3 Results of micronucleus test in mice bone marrow (⎯x±s)
性别
组别 动物数/只
观察细胞数/个
含微核细胞数/个
含微核细胞率 PCE 比例/%
‰ p 值 雌性
knock
溶剂对照 5 10000 20 2.00±0.79 50.72 ±2.18 1670 mg/kg
5 10000 18 1.80±0.7
6 >0.05 51.10±0.79 3330 mg/kg 5 10000 20 2.00±0.61
>0.05 51.24±1.35 6670 mg/kg 5
10000
21
2.10±1.24
>0.05
50.88±1.59
阳性对照 5 10000 254 25.40±7.76<0.01 49.36±2.35 雄性
溶剂对照 5 10000 22 2.20±0.76 51.10±1.93
1670 mg/kg
5 10000 23 2.30±0.97 >0.05 50.82±2.15 3330 mg/kg 5 10000 20 2.00±0.79 >0.05 50.78±0.53 6670 mg/kg 5
10000one less lonely girl
26
2.60±0.89
>0.05
50.45±1.80
阳性对照
5 10000 274 27.40±5.52
lacros怎么读
<0.01 49.03±1.68
表4 小鼠精母细胞染色体畸变试验结果
Table 4 Results of chromosome aberration test in mice spermatocyte (⎯x±s)
组别 动物数 /只 观察细 胞数/个 裂隙 /个 性染色体
单价体/%常染色体
单价体/%染色体畸变类型
畸变细
胞数/个
畸变细胞率
断片/个异位/个微小体/个 阴性对照
5 500 0 3.40±1.06
2.0±1.61 3 0 0 3 0.60±0.89
姿势用英文怎么说
1670 mg/kg 5 500 0 3.20±1.26 1.80±1.26 4 0 0 4 0.80±0.84 3330 mg/kg 5 500 0 3.00±1.55 2.20±0.75 2 0 0 2 0.40±0.55 6670 mg/kg 5 500 0 3.20±1.09 2.00±1.15
4 0 0 4 0.80±0.84 阳性对照
bleaching5 500 6* 8.20±1.26** 6.60±1.48**
42 4 0 46** 9.20±1.92**
注：与阴性对照组相比，* p <0.05；** p <0.01。
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表5 甜叶菊苷M 对大鼠体重的影响
Table 5 Effects of stevioside M on body weight in rats (⎯x±s)
性别 组别 动物数/只 初始体重/g 第1周体重/g 第2周体重/g 第3周体重/g 第4周体重/g 增重/g上海高级口译培训
雌
对照 10 76.20±4.34 125.60±4.17 167.40±13.23195.40±15.86220.30±18.53 144.10±16.29低剂量 10 76.10±3.60 123.90±6.85 162.10±7.39 189.00±12.26
213.60±17.40 138.00±15.84中剂量 10 75.70±2.83 126.80±3.91 170.30±11.91198.30±15.28224.60±16.30 149.08±15.41高剂量 10 76.10±3.25 125.50±4.93 168.60±8.04 194.40±8.57 221.70±11.24 146.36±11.01
雄
对照 10 86.30±4.69 150.00±8.57 212.20±14.23271.00±19.44325.10±28.23
238.80±28.83低剂量 10 86.30±6.67 149.00±7.56 216.60±15.82277.50±19.82339.40±24.64 253.10±19.40中剂量 10 86.70±5.72 149.30±6.06 213.80±13.87272.30±18.07328.70±21.43 242.00±18.41高剂量
10 87.10±5.28 150.60±9.85 215.00±11.16
274.80±13.54
333.90±17.10 246.80±15.35
表6 甜叶菊苷M 对大鼠每周摄食量及总摄食量的影响
Table 6 Effects of stevioside M on weekly and total food intake in rats (⎯x±s)
性别
组别 动物数/只
第1周摄食量/g
第2周摄食量/g
第3周摄食量/g
第4周摄食量/g
总摄食量/g
雌
剑桥雅思9
对照
10 113.50±7.44 146.00±9.96 149.20±8.40 171.20±16.09 579.90±33.73
低剂量 10 114.60±6.19 137.40±7.29 144.40±10.37 163.10±17.82 559.60.±33.66 中剂量 10 111.40±6.57 144.30±12.47 154.00±13.74 172.20±17.32 581.90±40.80 高剂量 10 112.40±4.86 145.00±10.09 151.30±8.92 175.7±10.67 584.40±20.62 雄
对照
10 131.20±6.55 175.10±13.74 192.00±13.58 193.20±18.20 691.50±45.77 低剂量 10 129.00±7.16 174.50±13.09 191.6±15.09 204.60±12.98 699.70±41.27 中剂量 10 132.50±6.77 179.60±14.43 198.30±14.27 201.70±19.13 712.10±46.80 高剂量
10 136.00±4.78 181.70±11.18 198.40±11.66 204.00±12.52 720.10±31.44
表7 甜叶菊苷M 对大鼠食物利用率的影响
Table 7 Effects of stevioside M on food utilization rate in rats (⎯x±s)
性别
组别 动物数/只
第1周食物
利用率/%
第2周食物 利用率/%
第3周食物 利用率/%
第4周食物 利用率/%
总食物
利用率/%
雌
对照研究生复试英语听力
10 43.72±3.76 28.42±5.54 18.81±2.95 14.47±2.78 24.83±2.06 低剂量 10 41.75±3.88 27.89±3.50 18.60±4.39 14.87±2.75 24.55±2.26 中剂量 10 45.88±2.27 29.84±5.44 18.10±3.04 15.27±2.10 25.55±1.35 高剂量 10 43.91±2.67 29.72±2.50 17.16±2.45 15.44±3.62 24.91±1.64 雄
对照
10 48.96±4.84 35.30±4.33 30.59±3.00 27.86±2.97 34.48±2.98 低剂量 10 48.67±1.97 38.63±3.05 31.81±2.48 30.29±2.71 36.16±1.53 中剂量 10 47.34±2.90 35.93±4.58 29.50±1.63 28.08±3.01 34.02±2.04 高剂量
10 46.70±4.70 35.41±2.79 30.17±2.82 29.01±3.46 34.29±1.88
2.5 28 d 经口毒性试验 2.5.1 一般临床观察
试验期间，各组动物的外观、排便、进食及活动等均未见明显异常，未见明显中毒体征和死亡。这一研究与Nikiforov 等人进行的reb D 的28 d 喂养试验结果一致[21]。
2.5.2 动物的体重及摄食情况
由表5~7可见，与对照组相比，样品各剂量组动
物多个观察点的体重、摄食量、食物利用率以及总的摄食量和食物利用率均无显著性差异（p >0.05）。
2.5.3 甜叶菊苷M 对大鼠血液学指标的影响
由表8可见，与对照组相比，雌性大鼠低剂量组WBC 计数值偏高，NE 值偏低，差异有统计学意义（p <0.05），但两项指标值均在本实验室历史正常值范围内，且无剂量-效应关系；雌性低、中剂量组和雄性低、中、高剂量组大鼠PT 值以及雄性低剂量组APTT 值差异有统计学意义（p <0.01，p <0.05），但两项指标变化均无剂量-效应关系，且雌雄动物变化趋势不同，结合其他指标综合分析认为，上述变化不具有生物学意义和毒理学意义；其余各剂量组的多项血常规指标与对照组相比无显著性差异（p >0.05）。
