生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
第17卷第2期2022年4月
V ol.17,No.2Apr.2022
㊀㊀基金项目：国家重点研发计划(2017YFC1600900)；国家自然科学基金资助项目(31972605)
㊀㊀第一作者：秦菲(1977 )，女，博士，副教授，研究方向为食品检测与营养评价,E -mail:************** ㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:**********
DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20210616001
秦菲，汪洋，赵祎，等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇对黄粉虫毒性及其排泄行为[J].生态毒理学报,2022,17(2):311-316
Qin F,Wang Y ,Zhao Y ,et al.Toxicity and excretion of deoxynivalenol to Tenebrio molitor larvae [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2022,17(2):311-316(in Chine)
脱氧雪腐镰刀菌烯醇对黄粉虫毒性及其排泄行为
秦菲1，汪洋2，赵祎1,2，陈明生3，范文佳1，郭宝元2,*，王松雪2书籍是人类进步的阶梯
1.北京联合大学生物化学工程学院，北京100023
2.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京100037
3.湖北以勒科技有限公司，武汉430070收稿日期:2021-06-16㊀㊀录用日期:2021-10-04
摘要：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是影响粮食和饲料安全最重要的真菌毒素之一㊂为研究DON 对黄粉虫的毒性及其排泄过程和行为，采用不同浓度DON(低剂量组0.25mg ㊃kg -1，中剂量组5.51mg ㊃kg -1，高剂量组8.83mg ㊃kg -1)添加的小麦粉对黄粉虫进行暴露㊂结果表明，低剂量组幼虫存活率(85%)>高剂量组幼虫存活率(83%)>中剂量组幼虫存活率(78%)，不同剂量组之间存活率无显著差异(P >0.05)㊂不同DON 剂量组喂养的黄粉虫体质量增加也无显著性差异(P >0.05)㊂进食低剂量DON 黄粉虫粪便中未检出DON ㊂进食中剂量DON 的黄粉虫DON 排泄率为9%；进食高剂量DON 黄粉虫的DON 排泄率为17%㊂关键词：呕吐毒素；黄粉虫；粪便；降解；排泄
文章编号:1673-5897(2022)2-311-06㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
no badyToxicity and Excretion of Deoxynivalenol to Tenebrio molitor Larvae
Qin Fei 1,W ang Y ang 2,Zhao Yi 1,2,Chen Mingsheng 3,Fan Wenjia 1,Guo Baoyuan 2,*,Wang Songxue 2
1.College of Biochemical Engineering,Beijing Union University,Beijing 100023,China
all well2.Academy of National Food and Strategic Rerves Administration,Beijing 100037,China
3.Hubei Jireh Technology Company Limited,Wuhan 430073,China
Received 16June 2021㊀㊀accepted 4October 2021
Abstract :Deoxynivalenol (DON),produced by various fusarium species,is one of the most prevalent food -and feed -associated mycotoxins.This study concentrated on the toxicity and excretion of DON by dietary exposure for
Tenebrio molitor larvae.Three DON levels of 0.25(low dosage,LD),5.51(medium dosage,MD)and 8.83mg ㊃kg -1(high dosage,HD)in wheat flour were employed.The survival rates were as follows:LD (85%)>HD (83%)>MD (78%).There was no significant difference in survival rate (P >0.05)among different groups and body mass increa of larvae (P >0.05).After 24h,DON was undetectable in the feces of Tenebrio molitor larvae of the low dosage group,while the excreted rates of the medium and high dosage groups were 9%and 17%,respectively.Keywords :deoxynivalenol;Tenebrio molitor larvae;feces;degradation;excretion
312㊀生态毒理学报第17卷
㊀㊀脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)，化学名为3α,7α,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮,CASRN 为51481-10-8，又称呕吐毒素(vomi -
toxin)，结构如图1所示，是禾谷镰刀菌(Fusarium
graminearum )和黄色镰刀菌(Fusarium culmorum )等真菌侵染谷物及其制品产生的有毒代谢产物[1-2]㊂DON 能引发人和禽畜拒食㊁呕吐㊁生长延迟㊁生殖紊
乱等症状，对人畜造成伤害[3]㊂在我国,DON 在小麦和玉米中检出阳性率和污染水平均较高[1-2]，小麦和玉米中DON 的检出率基本呈现由南向北逐渐增高之势㊂DON 污染水平一般在0.3~1mg ㊃kg -1，部分甚至超过5mg ㊃kg -1[1-2]㊂为避免DON 通过饲料污染禽畜产品，粮食和饲料的DON 脱除非常重要
㊂
图1㊀脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON )的结构及其在生物体内的转化过程
注:DOM -1表示脱环氧雪腐镰刀菌烯醇;3-keto -DON 表示3-酮基脱氧雪腐镰刀菌烯醇;3-epi -DON 表示3-异构化脱氧雪腐镰刀菌烯醇㊂
Fig.1㊀The deoxynivalenol (DON)structure and the metabolites in organisms
Note:DOM -1is de -epoxy -deoxynivalenol;3-keto -DON is 3-keto -deoxynivalenol;3-epi -DON is 3-epi -deoxynivalenol.
㊀㊀昆虫是世界上最繁盛的动物类群之一[3-5]㊂由于真菌毒素广泛存在于各种粮食中，很多植食性昆虫也不可避免地通过取食暴露于真菌毒素污染㊂近年来，科学家发现昆虫可以通过一系列的生理过程，将其摄入的真菌毒素代谢或排出体外[6-12]㊂黄粉虫
(Tenebrio molitor larvae)㊁黑水牤(Hermetia illucens larvae)和黑菌虫(Alphitobius diaperinus Panzer)等昆虫能够代谢50%~80%摄入的玉米赤霉烯酮㊁黄曲霉素和DON 等真菌毒素[6]
㊂van Broekhoven 等[7]
发现部
分DON 及3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)能够被代谢和排出黄粉虫体外,24h 后虫体内即检测不到DON 残留㊂黄粉虫对DON 的代谢率高达80%~96%，同时，肠道中也检测到DON 的环氧开环代谢产物脱环氧雪腐镰刀菌烯醇(DOM -1)
[6-12]
，由此可见黄
粉虫肠道微生物中存在着DON 降解菌㊂
黄粉虫(Tenebrio molitor )是非常具有代表性的一种食用昆虫品种，属于鞘翅目(Coleoptera)，拟步甲科(Tenebrionidae)，粉甲属(Lepidoptera )㊂目前,DON 在昆虫体内代谢和毒理学研究鲜有报道㊂本研究探究了DON 超标的饲料对黄粉虫的影响，同时将考察DON 在黄粉虫体内的代谢规律㊂1㊀材料与方法(Materials and methods )1.1㊀试剂和生物材料
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和13C 标记的DON
稳定同位素标准溶液(100mg ㊃L -1)购自Romer 公司(美国)㊂甲醇㊁乙腈㊁乙酸铵㊁甲酸和乙酸均为HPLC 级，购自默克公司(美国)㊂实验用水为Milli -Q 超纯水㊂
实验用黄粉虫(Tenebrio molitor larvae)购自北京本地花鸟鱼菜市场㊂在实验室人工气候箱中(25ħ，湿度60%)驯化1周后进行实验㊂驯养采用的饲料为小麦粉，由2020年黄淮海地区生产的小麦加工制成㊂
1.2㊀实验仪器四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q -Exac -
tive ，赛默飞世尔科技公司，美国)；快速液相色谱仪(UltiMate 3000，赛默飞世尔科技公司，美国)用于小麦粉㊁黄粉虫体内和粪便中DON ㊁3AcDON ㊁15AcDON 及其代谢产物的分析㊂
液相色谱条件:Waters 公司CORTECSTM UP -LC C 18柱(100mm ˑ2.1mm ,1.6μm)，柱温为40ħ，进样量2μL ㊂流动相:A 为甲醇,B 为含1%(体积分数)的甲酸和1mmol ㊃L -1乙酸铵的水溶液，流速0.3mL ㊃min -1㊂梯度洗脱条件:0~2min ,90%B ;2~3min ,90%~80%B ;3~4min ,80%~79%B ;4~5min ,79%~74%B ;5~7min ,74%B ;7~7.5min ,74%~40%B ;7.5~10.5min ,40%B ;10.5~
13.5min ,40%B ;13.5~14.5min ,40%~5%B ;14.5
初一英语课件~17min ,5%B ;17~18min ,5%~90%B ;18~21
第2期秦菲等：脱氧雪腐镰刀菌烯醇对黄粉虫毒性及其排泄行为313
㊀
min,90%B㊂
质谱条件：加热电喷雾离子源(HEST)温度为300ħ；毛细管电压为3.2kV；离子传输管温度为320ħ㊂Full scan/ddms2扫描模式：采集范围为200
~800Da，正离子采集；一级质谱分辨率为70000 FWHM，二级质谱分辨率为17500FWHM，碰撞池能量(NCE)为35eV㊂
经典欧美歌曲1.3㊀DON加标小麦粉饲料的制备
我国国家标准‘食品安全国家标准食品中真菌毒素限量“(GB2761 2017)[13]规定，谷物及谷物制品中DON的限定量为1mg㊃kg-1，需通过UPLC-MS/MS技术对小麦粉原样进行多毒素检测㊂为考察黄粉虫对低(low dosage,LD)㊁中(medium dosage, MD)㊁高(high dosage,HD)3种剂量DON污染的小麦粉饲料的耐受情况，需人工掺毒制备中浓度㊁高浓度污染的小麦粉饲料，相关方法如下：分别准确称取0.815mg和1.63mg DON毒素标准品，加入2mL 水涡旋振荡至完全溶解，分别将DON水溶液与5.0 g饲料混匀，然后再与10.0g饲料混匀，以此方式逐渐加入饲料混匀，最后将490g饲料全部混匀，分别制成5mg㊃kg-1中剂量组和8mg㊃kg-1高剂量组的掺毒饲料，未经人工添加DON的小麦粉作为低剂量对照组㊂
混匀后采用四分法取样，对人工掺毒饲料中DON的浓度进行检测，以评价掺毒的均一性㊂1.4㊀DON暴露实验
驯养后的黄粉虫禁食48h，在温度(25ʃ1)ħ㊁湿度60%的条件下进行DON暴露㊂在250mL烧杯中放入30.0g黄粉虫(约270条)，每3d投喂黄粉虫质量10%的低㊁中㊁高3个浓度(分别定义为LD㊁MD㊁HD)的DON染毒小麦粉，每组设置2个平行㊂实验期间，每3d测定黄粉虫体质量㊁收集粪便并称量，剔除死亡黄粉虫，记录黄粉虫及其粪便质量㊁死亡黄粉虫的数量，暴露时间为14d㊂最后一次喂食后，在0㊁1㊁2㊁4㊁8㊁12㊁24和48h分别取黄粉虫3.0 g，于-80ħ保存㊂将收集的黄粉虫粪便在研钵中研磨成颗粒均匀的粉末置于-80ħ冰箱中保存㊂1.5㊀样品前处理
小麦粉样品：准确称取小麦粉5.00g样品，加入20mL乙腈-水-乙酸(体积比为70ʒ29ʒ1)提取液，用涡旋混合器混匀1min，置于涡旋振荡器上提取20min，然后以7000r㊃min-1离心5min，准确移取0.5mL上清液加入0.5mL去离子水，涡旋混匀，然后用冷冻离心机以4ħ㊁12000r㊃min-1离心10 min，取上清液，过0.2μm有机滤膜，取180μL过滤液加入20μL内标液，混匀上机㊂
黄粉虫样品：将黄粉虫在50ħ烘箱中烘干至恒重，在研钵中研磨成颗粒均匀的粉末㊂称取0.5000 g加入乙腈-水-乙酸(体积比为70ʒ29ʒ1)提取液2 mL㊂并用涡旋混合器混匀，置于涡旋振荡器上提取20min，置于超声机中超声15min；然后以12000r㊃min-1离心10min，准确移取0.5mL上清液和0.5 mL去离子水，涡旋混匀，然后用冷冻离心机以4
ħ㊁12000r㊃min-1离心20min，用针头取下层液体，用0.2μm有机滤膜过滤，取180μL过滤液加入20μL内标液，混匀上机㊂
黄粉虫粪便：称取0.5000g加入乙腈-水-乙酸(体积比为70ʒ29ʒ1)提取液2mL㊂用涡旋混合器混匀1min，置于涡旋振荡器上提取20min，然后以7000r㊃min-1离心5min，精确移取0.5mL上清液加入0.5mL去离子水，涡旋混匀，然后用冷冻离心机以4ħ㊁12000r㊃min-1离心10min，取上清液过0.2μm有机滤膜，取180μL过滤液加入20μL内标液，混匀上机㊂
2㊀结果与讨论(Results and discussion)
2.1㊀小麦粉中的DON
实际环境中，黄粉虫接触DON途径主要是膳食暴露㊂本研究以DON染毒小麦粉作为黄粉虫饲料，分析黄粉虫摄入染毒小麦粉后,DON在黄粉虫体内和排泄物中的DON残留和代谢产物㊂将黄淮海地区2020年生产的小麦制粉，测得其DON残留为0.25mg㊃kg-1，低于食品安全标准GB2761 2017中DON的限量1mg㊃kg-1㊂以该小麦粉作为暴露的对照组，定义为LD组，再通过向此小麦粉中加入DON标准物质溶液，以制备DON污染水平比较高的饲料㊂通过液相色谱质谱检测，获得2个不同DON污染水平的小麦粉饲料样品，分别为5.51mg㊃kg-1(MD)和8.83mg㊃kg-1(HD)㊂后续黄粉虫的DON 暴露将以此3个样品为饲料㊂
2.2㊀黄粉虫的DON暴露
以LD㊁MD和HD3组不同DON浓度的小麦粉为饲料饲喂黄粉虫，经过3d的喂食，观测到染毒小麦粉已全部转化为黄粉虫粪便㊂在此期间，黄粉虫将全部染毒饲料啮食干净，并未有剩余的小麦饲料，说明黄粉虫并未对染毒小麦粉有厌食的情况㊂对黄粉虫进行14d的暴露实验，观测黄粉虫的
one fifth314㊀生态毒理学报第17卷
体质量变化和死亡情况，由表1可知,LD 组幼虫存活率(85%)>HD 组幼虫存活率(83%)>MD 组幼虫存活率(78%)㊂t 检验结果表明不同剂量组之间存活率无显著差异(P >0.05)㊂黄粉虫进食高浓度DON 污染的小麦粉并不影响其存活率，通过外推法粗略估计DON 对黄粉虫的半数致死浓度(LC 50)>5000mg ㊃kg -1，表明DON 对黄粉虫为低毒或无毒㊂
经过14d 暴露实验,LD 组黄粉虫体质量增加
4.97mg ;MD 量组体质量增加1.28mg ;HD 组体质量增加
5.37mg ㊂通过t 检验表明3个实验组中黄粉虫的增重并无显著性差异(P >0.05=0.407)㊂黄粉
虫在喂养第5天时，各组均出现了化蛹的情况，通过
t 检验表明3个实验组的化蛹情况，同样无显著性差
异(P >0.05)㊂
2.3㊀黄粉虫体内DON 残留
在不同的时间点对染毒后的黄粉虫取样，检测其体内DON 浓度㊂如图2(a)所示,DON 浓度整体为下降趋势，黄粉虫在进食含DON 的小麦粉前2h 体内毒素呈现上升趋势,2h 时DON 浓度在体内达到最高值，之后明显下降；在8h 后DON 开始缓慢下降;24h 时毒素完全降解㊂随着黄粉虫开始取食，其体内的DON 逐渐上升㊂黄粉虫体内酶和肠道
表1㊀DON 暴露对黄粉虫生长的影响
Table 1㊀Effect of DON on the development of Tenebrio molitor L.
组别Group
虫体质量/g
Body mass/g 黄粉虫数量Number
暴露前Before exposure
暴露后After exposure
暴露前Before exposure 暴露后After exposure
死亡数Death number 化蛹数Pupation number 存活率/%Survival rate/%平均体质量增加值/mg Average mass gain/mg LD -130.1626.34276229472283 5.75LD -230.0827.18244214302088 3.73均值Average
30.1226.76260222382185 4.97MD -130.0423.26258198602377 1.04MD -229.9823.87270212581379 1.56均值Average
30.0123.57264205591878 1.28HD -130.7126.892712234818827.26HD -230.1026.23260220402085 3.46均值Average
30.41
26.56
266
222
44
19
83
5.37
注:LD 代表低剂量组(麦麸中DON 水平为0.25mg ㊃kg -1);MD 代表中剂量组(麦麸中DON 水平为5.51mg ㊃kg -1);HD 代表高剂量组(麦麸中DON 水平为8.83mg ㊃kg -1)㊂
Note:LD is low dosage (0.25mg ㊃kg -1DON in wheat flour);MD is medium dosage (5.51mg ㊃kg -1DON);HD is high dosage (8.83mg ㊃kg -1
DON).
图2㊀黄粉虫体内DON 浓度变化
注:(a)DON 在黄粉虫体内浓度;(b)DON 在黄粉虫体内的生物累积因子㊂
Fig.2㊀The DON concentration in Tenebrio molitor L.
Note:(a)DON concentration in Tenebrio molitor L.;(b)Bioconcentration factors of DON in Tenebrio molitor L..
第2期秦菲等：脱氧雪腐镰刀菌烯醇对黄粉虫毒性及其排泄行为315
㊀微生物参与DON的代谢过程[10]㊂DON在黄粉虫体
内的消除过程还包括其排便过程㊂在MD和HD组
中,2h后黄粉虫体内的DON浓度达到峰值，而在
LD组中,DON达到峰值需要的时间则会比较晚(8
h)㊂这说明高浓度的DON更容易激活黄粉虫体内
的代谢通路和肠道微生物对DON的代谢活性㊂在
MD和HD组中,DON浓度在黄粉虫体内会出现一
个平台，说明DON的摄入和代谢形成了一个平衡
态㊂随后，随着DON污染的饲料经排泄排出体外
和代谢水平升高，黄粉虫体内DON浓度会明显下
降，在24h后黄粉虫体内没有DON毒素残留㊂
生物累积因子(bioaccumulation factor,BAF)反
小王子电影
映了污染物在动物体内累积效应㊂
BAF=C
TM
C
feed
ˑ100%
式中:C
feed 是饲料中的DON浓度,C
TM
为黄粉虫体
内的DON浓度㊂
当BAF>1表示污染物在生物体内有生物累积作用,BAF<1表示无生物累积作用㊂生物累积因子用黄粉虫体内DON的浓度与饲料中DON的比值来表示(式1)㊂黄粉虫体内的生物累积因子变化趋势见图2(b)，结果表明DON进入黄粉虫体内，容易通过代谢和排泄排出体外，无生物累积效应㊂
2.4㊀DON在黄粉虫体内的排泄
采用排泄率(excretion rate,ER)来表征通过粪便排出的DON，采用代谢率(metabolization rate,MR)来表征DON在黄粉虫体内通过体内酶和肠道微生物代谢的比例㊂
ER=M
fecesˑC feces
M
feedˑC feed
ˑ100%
式中:M
feed 为投喂饲料的总量,C
feed天津新东方英语培训
为饲料中DON
的浓度,M
feces 为产生粪便的总量,C
feces
为粪便中
DON的浓度㊂
黄粉虫粪便中DON的检测结果如表2所示，在粪便样品中均未检测到DON衍生物㊂进食污染
表2㊀黄粉虫粪便中DON浓度
Table2㊀DON in feces of Tenebrio molitor L.
(mg㊃kg-1)
LD MD HD 1ND0.180.43
2ND0.140.51
平均值Average ND0.160.47饲料的黄粉虫粪便中的DON浓度低于污染小麦粉饲料DON的浓度㊂LD组黄粉虫粪便中未检出DON㊂MD组的粪便的DON浓度为0.16mg㊃kg-1, DON排泄率为9%;HD组粪便DON浓度为0.47
mg㊃kg-1,DON排泄率为17%㊂由此可以推断, DON在黄粉虫体内的转化途径，主要是降解㊂黄粉虫进食DON污染的小麦粉饲料后，小部分通过粪便代谢排出,24h后体内没有DON残留，说明大部分DON在黄粉虫体内通过肠道微生物和体内酶降解㊂
通讯作者简介：郭宝元(1976 )，男，博士，研究员，主要研究方向为生态毒理学㊂
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