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自体骨髓间质干细胞移植治疗扩张型心肌病的实验研究
张瑶李永利
张烁李丽丽郝东侠高民徐燕赵士丹
·２７３·
·实验研究·
【摘要】目的观察扩张型心肌病（ＤｃＭ）心肌组织自体骨髓间质干细胞（ＡＢＭＭｓｃｓ）移植，对心脏功能的影
响。方法４０只日本大耳白兔，随机分成对照组（ｎ＝１０）与实验组，无菌条件下于髂骨处抽取骨髓６ＩＩｌｌ，分离
ＡＢＭＭＳＣ８后冻存。实验组动物耳缘静脉注射阿霉素复制ＤＣＭ模型，８周后再分为移植组（ｎ＝１５）和非移植组（ｎ＝
１５）。３组动物均做开胸手术，对照组开胸后不做任何处理，移植组左心室前壁注射ＡＢＭＭＳＣＢ，非移植组注射细胞培养液。移植后４周，超声心动及左心导管测定心脏功能，心肌组织ＨＥ染色及双重免疫组化分析。结果超声心动显示。细胞移植前，左室射血分数（ＥＦ）、左室壁收缩末期厚度（ＬｖＷＴｓ）、左室壁舒张末期厚度（ＬｖＷＴｅ）、左室收缩末期内径（Ｄｓ）、左室舒张末期内径（Ｄｄ）、心室率（ＨＲ）组间比较，差异有统计学意义（，＝５．０２６、３．８７９、４．４７２、
３５８２、３．９５２、３３７８，Ｐ＜０ｕＤ５）；ＥＦ、ＬＶＷＴｓ、ＬＶＷＴｅ，移植组和非移植组与对照组相比，明显减小（Ｐ＜Ｏ．０５），Ｄｓ、Ｄｄ、ＨＲ则
明显增加（Ｐ＜Ｏ．０５）。细胞移植后，ＥＦ、ＬＶＷＴｓ、ＬＶＷＴｅ、Ｄｓ、Ｄｄ、ＨＲ组问比较，差异有统计学意义（，＝４．４８７、４．０１４、４．５９３、３．４２５、３．７１６、３．４９５，Ｐ＜０．０５）。ＥＦ、ＬｖＷＴｓ、ＬＶＷＴｅ，移植组较非移植组明显增加（Ｐ＜Ｏ．０５），但仍低于对照组（Ｐ＜０。０５）；而Ｄｓ、Ｄｄ、ＨＲ，移植组虽明显低于非移植组，但仍高于对照组（Ｐ＜０．０５）。左心导管检查显示，移
植后，Ｐｓ、Ｐｄ、＋ｄｐ／ｄｔｍａ）【、ＨＲ组间比较，差异有统计学意义（，＝４．４０６、４．９１８、１０．８５８、３．８２４，Ｐ＜０．０５）。两两比较
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ｍａ］【，移植组明显高于非移植组（Ｐ＜０．０５），但低于对照组（Ｐ＜０．０５）；Ｐｄ、ＨＲ移植组低于非移植组（Ｐ＜
０．０５）．但高于对照组（Ｐ＜０．０５）。移植组的心肌组织内可见抗５一溴脱氧尿苷（ＢｒｄＵ）染色阳性的细胞，这些细胞同时抗肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）染色及抗钙黏附因子（Ｎ—ｃａｄｈｅｒｉｎ）染色阳性。结论利用阿霉素可以复制扩张型心肌病动物模型，白体骨髓间质干细胞移植可以改善扩张型心肌病的心脏功能，而且移植后在心肌组织内发生了心肌源性的
转化。
【关键词】心肌病，充血性；干细胞，骨髓；移植，自体；超声心动描记术；
枯草菌素
左心导管术
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基金项目：哈尔滨市科技攻关计划项目（２００ＢＡＡ９ＣＳｌ８８—２４）；中国博士后基金（ＵｔＢ０４—２８１）
作者单位：１５００８１哈尔滨医科大学第二临床医学院心内科（张瑶、张烁、李丽丽、郝东侠、高民、徐燕、赵士丹），神经外科（李永利）
作者简介：张瑶（１９７３一），女，黑龙江省哈尔滨市人，博士，硕导，副主任医师，主要从事细胞移植治疗各种心血管疾病的研究，ＥⅡｌａｉｌ：ｙ∞ｚｈ”ｇｇｒａｃｅ＠１６３．ｃ㈣
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自体骨髓问质干细胞（ＡＢＭＭＳＣｓ）移植是目前医学研究的热点之一．也是～种十分有前景的治疗手段。迄今为止。其在治疗心血管疾病方面已经取得了许多可喜的进展。但近年来该研究所针对的疾病大多是心肌梗死．因其往往是充血性心力衰竭的主要病因…２１。而实际上，包括扩张型心肌病
（ＤＣＭ）在内的以心肌弥漫性损害为特征的心脏病是临床上可以引起充血性心力衰竭的另一类重要的心血管疾病。因此。有必要明确ＡＢＭＭＳＣｓ移植对这一类心血管疾病的治疗价值。据此。作者利用阿霉素诱导兔ＤＣＭ模型。观察ＡＢＭＭＳＣｓ移植后动物心脏功能的变化及移植细胞的存活与分化情况。
ｌ材料与方法
１．１主要试剂：ＤＭＥＭ低糖培养液及胎牛血清由美国Ｈｖｃｌｏｎｅ公司提供，阿霉素、胰蛋白酶、５一溴脱氧尿苷（Ｂｒｄｕ）、小鼠单克隆抗Ｂｒｄｕ抗体、兔抗钙黏附因子（Ｎ—ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体、兔抗肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）抗体、异硫氰酸荧光素标记山羊抗鼠ＩｇＧ抗体、罗达明标记山羊抗小鼠ＩｇＧ抗体由美国Ｓｉｇｍａ公司提供。１．２动物分组及模型复制：健康纯系日本大耳白兔４０只，雌雄不限，体质量１．８～２．Ｏｋｇ（哈尔滨医科大学第二Ｉ临床医学院动物实验中心提供）。随机分为对照组（１０只）和实验组（３０只）。实验组复制动物模型，经耳缘静脉注射阿霉素（１ｇ／Ｌ），每次１ｍ以ｇ，每周２次，８周后再将动物分成移植组（１５只）与非移植组（１５只）。动物自由进食、饮水。１．３ＡＢＭＭＳＣｓ的分离、培养、冻存：复制ＤＣＭ模型前．３组动物在无菌条件下于髂骨处抽取骨髓６“。加入等体积的ＰＢＳ液，混匀，置于淋巴细胞分离液（１．０７３以）上，离心、吸取呈膜状的单个核细胞层。加入ＰＢＳ液，离心、弃上清，再加入ＤＭＥＭ低糖培养基（含１５％胎牛血清），置于３７℃、含５％ＣＯ：饱和湿度的培养箱内培
养。１４ｄ后．０．２５％胰酶消化，用培养液终止消化。离心、弃上清，加入冻存液，移入冻存管中。一４℃放置ｌｈ。一２０℃放置１５ｍｉｎ，一８０℃放置ｌｈ，再置于液氮中。
１．４ＡＢＭＭＳＣｓ的复苏与标记：取出冻存管，在ｌ～２ｍｉｎ内将冻存液完全溶解，加入培养液，置于培养箱中培养。当细胞相互汇合达９０％时，传代培养；留取第２代进行标记。于移植前ｌ天，将标记物ＢｒｄＵ按５０ｍｇ／Ｌ加入细胞悬液中，在３７℃、含５％Ｃ０２饱和湿度的培养箱内孵育２４ｈ。ＰＢＳ液冲洗、０．２５％胰酶消化、加入ＰＢＳ液配制成细胞数为１×１０９几的细胞悬液。
１．５细胞移植：动物耳缘静脉注射ｌ％戊巴比妥钠（３０ｍ叭ｇ），全身麻醉后，胸骨正中切口，剥开心包。移植组ＡＢＭＭＳＣｓ悬液（１ＩＩｌｌ）多点注射到左心室前壁，非移植组注射同体积细胞培养液，对照组仅做开胸术。术后肌肉注射庆大霉素（５ｍ班ｇ）３ｄ。１．６超声心动测定心脏功能：在移植前１周和移植后４周，采朋彩色多普勒超声仪（美国ＶｉＶｉｄ７．０，４．４～８．０ＭＨｚ）检测动物心脏功能。评价指标：左室收缩末期内径（Ｄｓ）、左室舒张末期内径（Ｄｄ）、左室收缩末期厚度（ＬＶＷＴｓ）、左室舒张末期厚度（ＬｖⅥ仉）和心率（ＨＲ），Ｓｉｍｐｓｏｎ法测定左心室射血分数（ＥＦ）。１．７左心导管测定心脏功能：移植后４周。动物全身麻醉，固定、仰卧、颈部伸直、分离左颈总动脉；６Ｆ软质导管沿颈总动脉送入左心室．另一端接压力换能器与ＲＭ６２４０Ｂ／Ｃ四道采集信号处理系统。记录左室收缩压（Ｐｓ）、左室舒张末压力（
Ｐｄ）及左室内压力最大上升速率（＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ）与ＨＲ。
１．８组织学检测：处死动物。将心肌组织于冷冻切割机上速冻后切成５斗ｍ的薄片，利用兔抗Ｎ—ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体和兔抗ａｃｔｉｎ抗体分别与小鼠单克隆抗ＢｒｄＵ抗体制备混合双抗．行抗ＢｒｄＵ和Ｎ—ｃａｄｈｅｒｉｎ、抗ＢｒｄＵ和ａｃｔｉｎ双重免疫组化检查。荧光显微镜下观察。另取心肌组织，１０％甲醛溶液固定、石蜡包埋、ＨＥ染色，光镜下观察。
１．９统计学分析：采用ＳＰｓＳ１１．５统计软件。死亡率比较采用ｘ２检验，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用ＳＮＫ－口检验。
２结果
２．１各组动物的死亡情况：在整个实验过程中，４０只动物共有１１只动物死亡，其中移植组５只（死亡率３３．３３％）、非移植组４只（死亡率２６．６７％）、对照组２只（死亡率２０％）。各组间死亡率比较，差异无
万方数据
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统计学意义（Ｘ２＝０．５４６４，Ｐ＞０．０５）。
２－２移植前、移植后各组动物心功能超声心动检查结果：从表１可见，细胞移植前，ＥＦ、ＬｖＷＴｓ、ＬＶＷＴｅ、Ｄｓ、Ｄｄ、ＨＲ组间比较，差异有统计学意义（Ｆ＝５．０２６、３．８７９、４．４７２、３．５８２、３．９５２、３．３７８，Ｐ＜０．０５）。进一步两两比较。ＥＦ、ＬＶＷＴｓ、ＬＶＷｒｅ移植组和非移植组与对照组相比明显减小（尸＜０．０５），Ｄｓ、Ｄｄ、ＨＲ明显增加（Ｐ＜０．０５）；移植组与非移植组上述指标比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。从表２可见，细胞移植后，ＥＦ、ＬＶＷＴｓ、ＬＶＷＴｅ、Ｄｓ、Ｄｄ、ＨＲ组间比较，差异有统计学意义（Ｆ＝４．４８７、４．０１４、４．５９３、３．４２５、３．７１６、３．４９５，ＪＰ＜０．０５）。进一步两两比较。移植组与非移植组比较，ＥＦ、ＬＶＷＴｓ、ＬＶＷＴｅ明显增加（尸＜０．０５），但仍明显低于对照组（Ｐ＜０．０５）；而Ｄｓ：Ｄｄ、ＨＲ虽然低于非移植组（Ｐ＜０．０５），但仍高于对照组（Ｐ＜Ｏ．０５）。
２．３移植后左心导管测定动物心脏功能结果：从表３可见，移植后，Ｐｓ、Ｐｄ、＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＨＲ组间比较，差异有统计学意义（Ｆ＝４．４０６、４．９１８、１０．８５８、３．８２４．Ｐ＜０．０５）。Ｐｓ、＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ移植组明显高于非移植组（Ｐ＜Ｏ．０５）。但低于对照组（尸＜０．０５）；Ｐｄ、ＨＲ移植组低于非移植组（Ｐ＜０．０５），但高于对照组（Ｐ＜０．０５）。２．４组织学检测：非移植组心肌纤维断裂，细胞呈现不同程度的空泡变性，部分心
肌细胞凝固性坏死，横纹消失，细胞间隙增宽，组织间质水肿，可见炎性细胞浸润，见图１。移植组心肌内可见细胞核相对较大、类似胎心或新生心室细胞的成团的ＡＢＭＭＳＣｓ，周同有炎细胞浸润，见图２。免疫荧光染色，在移植部位有抗ＢｒｄＵ染色阳性的细胞（深棕色），而这些细胞同时又表现出抗胞膜Ｎ—ｃａｄｈｅｒｉｎ染色阳性反应（绿色），及抗胞浆ａｃｔｉｎ染色阳性反应（绿色），见图３、４。，
３讨论
阿霉素是临床上常用的广谱化疗药。其毒性除骨髓抑制、胃肠道反应、脱发外，以心脏毒性最重。约有６％一３０％的患者在使用后会出现心脏毒性［３］。不少学者成功地运用阿霉素复制的动物ＤＣＭ心力衰竭模型完成与之相关的实验研究［，，４］。而本实验中，移植组与非移植组组织学检测显示，动物心肌组织发生了与人类ＤＣＭ相似的病理学改变．其在ＡＢＭＭＳＣｓ移植前的心脏功能较对照组明显降低。
实验中利用超声心动仪及左心导管术观察了动物骨髓问质干细胞移植前后心脏功能的变化。证实ＡＢＭＭＳＣｓ移植对ＤＣＭ的心脏功能有明显的改善作用。这一结果与Ｙｏｏ等腊．６１发现的相似．他们也曾考虑到弥漫性心肌损伤的治疗问题。将异体心肌细胞及白体平滑肌细胞移植人遗传性扩张型心肌病仓鼠（Ｈａｍｓｔｅｒｓ大鼠）的心肌内，并观察到两种移植均对心脏功能有一定程度的改善作用。但遗憾的是，他们选择的供体细胞的局限性在早些年前就已
上海三校生高复班表ｌ移植前动物心功能超声心动检查结果比较（ｉ±ｓ）
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注：与对照组比较。｝Ｐ＜０．０５
表２移植后动物心功能超声心动检查结果比较（ｉ±ｓ）
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注：与对照组比较，’Ｐ＜Ｏ．０５；与移植组比较，△Ｐ＜Ｏ．０５
表３移植后动物心功能左心导管测定结果比较（ｉ±ｓ）
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注：与对照组比较，·Ｐ＜０．０５；与移植组比较。△Ｐ＜Ｏ．０５
万方数据
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图ｌ扩张型心肌病心肌纵切面改变ｌＨＥ４∞）
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图２移植组心肌内成团的ＡＢＭＭＳＣｓ（ＨＥ４∞）
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图３移植组心肌内ＡＢＭＭＳＣｓ细胞抗ＢｒｄＵ及
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Ｆｉｇｕ地３ＡＢＭＭＳＣｓｉｎｍｙｏ∞ｒｄｉｕｍ骶弛ｄｏｕｂＩｅｓｔａｉｎｅｄｂｙ
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图４移植组心肌内ＡＢＭＭＳ（Ｘ细胞抗ＢｒｄＵ
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经被学者们反复地论证过。
在ＤＣＭ动物的心肌组织内．ＢｒｄＵ染色阳性的ＡＢＭＭＳＣｓ可以表达心肌特异性表面抗原ａｃｔｉｎ及Ｎ—ｃａｄｈｅｒｉｎ，说明移植细胞的确发生了向心肌细胞的转化。但ＡＢＭＭＳＣｓ移植后心脏功能改善的原因，似乎不能单从补充心肌细胞数量来解释。Ｎａｇａｙａ等［７］发现。Ａ
ＢＭＭＳＣｓ体外培养时，就可以分泌大量促血管生成、抗凋亡及有丝分裂因子（血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子等）。移植于仓鼠心肌内后，在改善心脏功能的同时，一部分细胞表达心肌特异性抗原。而另一部分表达血管特异性抗原。移植组的心肌组织内血管密度增加。而含胶原量减少。因此，ＡＢＭＭＳＣｓ移植改善ＤＣＭ心脏功能可能的机制是。在补充心肌细胞数量的基础上诱导血管再生．改善心肌供血，增加心肌收缩力，抑制心室重构，减少凋亡细胞。另外，移植细胞分化形成的心肌细胞之间的连接结构对心脏局部功能的改善可能也有一定的帮助［７】。
利用阿霉素诱导的ＤＣＭ动物模型所获得的ＡＢＭＭＳＣｓ移植可以改善心脏功能这一结论．为扩大ＡＢＭＭＳＣｓ移植的应用范围做了一个初步尝试，同时也为以弥漫性病变为特点的ＤＣＭ开辟了一个新的治疗思路。但是，实验中采用的局部注射的移植方式是否最适合予以弥漫性心肌病变为特点的扩张型心肌病？移植时所采用的细胞数是否能够最大程度地发挥改善心脏功能的最佳细胞数量？另外．移植后的细胞能否与心肌细胞间建立有效的生物及电信号联系，形成真正意义上的“功能性合胞体”等等。这些尚不明确的问题还有待于在以后的实验中进一步研究。汽车底盘装甲
参考文献
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（收稿日期：２００６一ｌｌ一２０）
（本文编辑：王丹娜）万方数据
