第37卷第6期2020年12月
实验动物科学
L A B O R A T O R Y
A N I M A L S C I E N C E
Vol . 37 No . 6December 2020
令研究报告令
iRhom2 小鼠乳腺发育障碍的转录组分析#
尚艳姣周小军郭子潇袁征
(军事科学院军事医学研究院实验动物中心，北京100071)
摘要：目的研究iRhom 2"w 小鼠乳腺表型相关的差异表达基因，为深入研究iRhom 2^P 小鼠乳腺发育障碍的相关 机制提供靶点信息。方法对12周龄的野生型和iRh 〇m 2"^小鼠的乳腺组织进行whok -mounts 染色，分析乳腺发 育形态，收集乳腺组织进行转录组测序，筛选差异表达基因，E L IS A 检测血清激素
水平。结果与野生型小鼠相 比，iRhom 2"nfl 小鼠乳腺侧枝导管较稀疏，差异最显著的18个基因中有6个在iR 丨i 〇m 2"n "’小鼠中表达上调，12个表 达下调。其中3个催乳素家族基因在iRh 〇m 2""f l 小鼠中不表达，且在血清中几乎检测不到催乳素表达，而血清中的 雌激素水平相比野生型小鼠较高。结论iRh 〇m 2"n <'突变的小鼠存在乳腺发育障碍，可能与imurni 2^P 小鼠中催乳 素和ZfP 281的缺失表达有关，生物信息学分析发现，iRhom 2""M ’小鼠神经发育可能存在不同于野生型小鼠的表型。 关键词：iRhom 2&"’ ；乳腺；小鼠；转录组；催乳素中图分类号：Q 786
文献标识码：A
文章编号：1006-6179(2020)06-0049-06
D O I ：10. 3969/j . issn . 1006-6179. 2020. 06. 009
乳腺在激素的刺激下可分泌乳汁，乳腺发育障 碍影响泌乳功能。影响小鼠乳腺发育的原因主要有 两方面，一方面是激素，包括雌激素、催乳素、孕激素 和它们的下游旁分泌效应子M ]，催乳素和雌激素协 同促进导管延伸、分叉和小叶腺泡形成。激素分泌 不足，直接影响乳腺管的生长发育及乳腺末端的分 枝，从而使乳腺发育受到影响。另一方面，除了经典 的激素调节乳腺发育，还有生长因子、受体酪氨酸激 酶、细胞外基质分子和蛋白酶也参与这个重要过
程'”。双调蛋白（amphiregulin , Areg )是乳腺导管 的延伸最重要的旁分泌介导者13]。A re g 敲除小鼠 在青春期乳腺导管发育受阻。
iRh 〇m 2〜C T 小鼠是我单位培育的一种BALB/c 遗传背景的突变小鼠[<]。该小鼠纯合子表型之一 为毛囊分化障碍。前期研究工作表明iRhcm ^17""纯 合子的雌鼠乳腺侧枝导管发育障碍，丧失泌乳功能，但相关机制尚不明确。本研究拟对iRhom2w "™小鼠 乳腺组织的进行转录组测序，对影响乳腺发育障碍 相关的基因进行鉴定和功能分析，为深人研究 iKhom2&‘小鼠表型特征以及延展该小鼠模型在其
收稿日期：2020-06-12
•基金项目：国家自然科学基金面上项目（N o .81571423)
作者简介：尚艳姣（丨988_)，女，研究实习员，从事检测及动物模型研究.E -m ail :yanj i a 〇0323@
一带一路英文
周小军（丨983_)，男，助理研究员，从事检测及动物模型研究.E -mail : zh 〇Uxia 〇jun 320320@ 126. com
通信作者：袁征（1973—)，男，实验师，从事科研管理工作• E -m a U :yUanzhfng 001@ 126. com
他领域的应用研究奠定基础。
1on fire
建迅教育材料与方法
1.1
实验动物
S P F 级iRh 〇m 2"^和野生型小鼠为本中心生产
繁育。实验动物生产许可证号：SCXK (军） 2017-0014〇 1.2样品采集
各取5只12周龄的野生型（WT )和iRh 〇m 2^ 纯合雌鼠，弯头镊夹取小鼠眼球，E P 管收集血液，用 于EL 1S A 分析。其中3只采用断颈法处死后迅速 解剖，取新鲜乳腺组织进行whole -mounts 染色分析。 另一部分新鲜乳腺组织放入RNa -fre e 的离心管 中，在液氮中速冻后置于-80 T 保存，用于转录组 分析。
1. 3 Whole-mounts 染色
将上述新鲜乳腺组织铺在玻片上，用体积比 1 : 3的冰醋酸/丨00%乙醇混合物固定、水化，0.2% 洋红（Sigma )和0. 5%的A 1K (S 04)2过夜染色，在梯
• 50 •
实验动物科学37卷
iRhom 2(w 小鼠和野生型小鼠乳腺组织共得到725 个差异表达的基因，476个基因表达下调，249个基 因表达上调。以多重假设检验校正后的/>值（/^办) 小于0. 05 [ g 卩-lo g jp a 办）>1.3]作为差异显著性标 准，得到18个显著性表达差异的基因，其中6个在 iRhorr ^i
小鼠中表达显著上调（P <0.05) ,12个在
iRh 〇m 2^小鼠中表达显著下调（P <0.05)(图2)。 PrZ 3H 、/W 261、P ^8a 9基因属于催乳素家族，这3个 基因在iRhom 2~w 小鼠中不表达，log 2( Fold Change ) 分别为-12. 02716、-11.47758 和-10. 35361 (表 1)。
和Z /p 281基因在iRhom 2"n t t ；小鼠中表达量
显著下调（P < 〇. 05 )，此外还有6个基因在 imi 〇m2^
小鼠中也不表达。在表达上调的基因
中，5个基因在野生型小鼠中不表达，而在 iRhom 2"nev 小鼠中表达量增力口，且Mou ENCODE transcriptome data 显 7K 0护365 在辜丸中的 FPKM 为 0.21，在其他组织中不表达。
i R l i o m 2_V S _W T
-表达上调6
表达下调：12
-20
20
log2(Fold Change)
图2差异基因火山图
注：横坐标表示基因在野生型（W T )和iRh 〇m 2"^(i R h 〇m 2)的表达倍数变化[l 〇g 2( Fold C h a n g e )]；纵坐标表示表达差异的
显著性水平；表达上调基因用红色点表示，下调基因用
绿色点表示，蓝色点为未发生显著变化的基因
Fig. 2 The volcano map of downregulated and upregulated
mRNAs between iRhom2"”c v and WT
N o t e ： T h e abscissa reprents fold change of gene expression level log2( Fold C h a n g e ) between i R h o m 2"n c K and W T , while the ordinate reprents the L o g 2( Fold Ch a n g e ) significance ； T h e upregulated gene was indicated by red dot, downregulated gene by green dot, and blue
dot reprented the gene without significant change
2. 3 ELISA 验证
血清中的催乳素和雌激素检测结果如图3所 示，iRh 〇m2"”™小鼠几乎不产生催乳素，显著低于野 生型小鼠（P =〇. 006)，而雌激素水平高于野生型小
鼠（戶= 0.037)。
汉英在线翻译度乙醇中脱水，用体积比1 : 2的苯甲醇/苯甲酸节 酯（Sigma )透明，利用Olympus 1X 51显微镜下观察 和拍照。
1.4转录组测序和生物信息学分析
转录组测序由诺禾致源公司进行，具体步骤包 括：利用RNeasy mini kit ( Qiagen )提取野生型和 iRhom 2y"™ 小鼠乳腺组织总 RNA ，用 Oligo Magnetic Beads 分离mRNA ，随后将其打断成250-300 b p 的 短片段，以片段化的R N A 为模板，随机寡核苷酸为 引物合成cDNA 第一条链。采用NEBNext Ultra TM RNA Library Prep Kit ( New England Biolabs )构建文 库，质检合格后，在Illumina Hiq X te n 平台进行 P E 150测序。下机原始数据经过数据过滤、测序错 误率检查及G C 含量分布检查，获得有效测序数据 (clean reads )。采用Tophat2将有效测序数据比对 到小鼠参考基因
组上，利用Stringtie 拼接转录本，并 对其进行表达水平定量。最后用Cuffdiff 软件分析 表达差异的显著性，P <〇. 05为显著差异。1.5 ELISA 分析
米用美国 Bio Vision 的 Prolactin (mou /rat ) ELISA Kit ( cat . No K 4688 )和 Estrogen ( mou ) ELISA Kit 10/16(cat . No K 4265-100)测定小鼠血清 中的催乳素和雌激素水平。2结果
2.1
乳腺发育形态
Whole -mounts 染色分析结果显示，相比于野生 型小鼠（图1A )，出生12周iRhon ^1^雌鼠的乳腺 导管分叉较稀疏（图1B )，导管侧枝发育明显存在 障碍。
A
B
图1小鼠乳腺形态
注：A .野生型；B. iRh 〇m 2e"™
2011考研英语二
Fig. 1 Mammary glands whole mounts
of iRhom2t /w c v and WT
Note: A. wild type; B. i R h o m 2"n c i l
2.2 差异基因的表达分析
计算FPK M 的大小衡量基因表达水平的高低，
用Cuffdiff 软件分析差异表达情况，以表达差异倍数 [log 2( Fold Change )] >1，
0.05 作为筛选条件。
.',ii (
言s o f o
l
第6期尚艳姣等：iRhom2_'’小鼠乳腺发育障碍的转录组分析•51 •
表1差异基因列表
Table 1The list of different expression genes between iRhom2tn c v and WT
基因编号基因名称基因描述i R h o m2"n f t I_
F P K M
W T_
F P K M
log2( Fold_
Change)
P
E N S M U S G00000038891P rl3b\催乳素家族3，b亚族，成员100. 83-12. 020.00003
E N S M U S G00000069258Prl2b\催乳素家族2，b亚族，成员100. 50-11.480.00023
E N S M U S G00000006490PrlSa9催乳素家族8，a亚族，成员900. 24-10. 350.01
E N S M U S G00000033834Tpbpa胚胎滋养层细胞特异性蛋白a00. 50-100. 015
E N S M U S G00000055298Ctsj组织蛋白酶J00. 68-11.440.0002
hosaE N S M U S G00000003974Grm3代谢型谷氨酸受体300. 007-10. 350.019
E N S M U S G00000028655M fsdla主要促进因子超家族成员2a 1. 2115. 91-4.380. 016
E N S M U S G00000041483Zfp2S1锌指蛋白2810. 01 3.07-8.490.015
E N S M U S G00000056158CarlO碳酸酐酶100. 03011.290.0002
E N S M U S G00000059429释365嗅觉受体3650. 13013.060.004
E N S M U S G00000008789Ceacam5癌胚抗原相关细胞黏附分子500. 02-9. 700. 027
E N S M U S G00000030366Ceacam12癌胚抗原相关细胞黏附分子1200. 14-9.410. 041
E N S M U S G00000027574NhainA N a+/K+转运A T P酶相互作用40. 1509. 590.027
E N S M U S G00000073878C m133040 6. 83-12.080. 028
E N S M U S G00000021795Sftpd表面活性剂相关蛋白D0. 2910. 29-6. 370. 029
E N S M U S G00000072601E arl嗜酸性粒细胞相关，核糖核酸酶家族A，成员10. 12011. 740.036
E N S M U S G00000034853Acot11酰基辅酶A硫酯酶1115. 250. 88 4. 370.036
E N S M U S G00000108841Frmpd2
F E R M和P D Z域组成20. 0209.510.043
注：F P K M为每百万片段中来自某一基因/转录本每千碱基长度的片段数目，衡量基因表达水平的高低；log2(Fold C h a n g e)为两组样本的差弄倍数，以丨og2(i R h o m2〜e V W T)来表示
Note ：F P K M m e a n s the n u m b e r of fragments per thousand ba length from a gene or transcript in each million fragments, measuring the level of gene expression ；Log2( Fold C h a n g e)reprents the fold change between two groups of samples, expresd as log2(i R h o m2f’n rV W T)
图3 野生型和i R h o m2^v小鼠血清中的
催乳素和雌激素水平
Fig. 3 Expression level of prolactin and estrogen in
the rum of WT and iRhom2""c v mice
3讨论
(/no；小鼠是我单位培育出的一种BALB/c遗传 背景的突变小鼠[5~，该小鼠纯合子表型之一为毛囊分化障碍。通过基因定位、基因组扫描和克隆测序鉴定未知突变基因为iRhom2，命名为iRh_2〃—6]。iRhom2u"™突变为缺失非移码突变，缺失区域定位在iRh〇m2的N末端，长度为309 bp。缺失区域移码区域编码氨基酸在各物种间高度保守。过表达iRhom2转基因小鼠与iRhom2Wlm交配 后挽救的毛囊分化障碍表型，证实导致iRhom24™小鼠表型是由于iRhom2 N末端缺失引起16i。另外，iRhom2 N末端对内质网的TNFo(转化 酶（TNFa-converting enzyme,TACE)成熟是必须的，iRhom2""™突变为功能丧失突变[6]。
进一步研究发现iRhori^1^雌鼠乳腺发育障碍，丧失泌乳功能，但其机制尚不明确。本研究通过 转录组测序发现，在iRhom2<w小鼠中有3个催乳 素家族的基因不表达，且血清中也几乎检测不到催乳素表达。催乳素可以通过内分泌和自分泌/旁分 泌途径影响乳腺上皮细胞的发育，可直接作用于乳腺上皮
细胞，或者通过信号转导与转录激活因子5b (Stat5b)的信号转导和转录激活间接作用于黄体，进而通过信号转导与转录激活因子5a(Stat5a)途径 影响乳腺发育[7]。
iRhom2与T A C E相结合，促进T A C E离开内质 网到高尔基体上进行加工成熟[8~。双调蛋白是乳腺导管的延伸最重要的旁分泌介导者，T A C E可在 上皮细胞表面剪切Areg，激活基质细胞的表皮生长因子受体（EG FR)信号通路影响乳腺侧枝形态发生。前期的研究结果显示，野生型iRhmn2能够促 进T A C E的成熟，然而过表达iRh〇m2~却不能诱导T A C E的成熟。我们推测iRhom
2""™小鼠乳腺发
• 52•实验动物科学37卷
育障碍可能与不能诱导T A C E的成熟有关。
本研究通过比较小鼠和野生型小鼠
乳腺组织的转录组测序结果，共发现725个差异表 达基因（P<0_ 05)，包括476个下调基因和249个上 调基因，为了更好地控制假阳性率，我们以pa办< 〇.〇5作为差异显著的筛选条件，共筛选出18个差 异显著的基因，包括6个上调基因和12个下调基因，同时对这些基因进行了文献调研和功能分析。在iRhom2—小鼠中Z/p281基因显著下调，Z/p281基因编码的是锌指蛋白281。锌指蛋白没有固定的结构和作用，一般在转录及转录后调控，蛋白折叠与 装配以及DNA、R N A识别等分子功能基础上，参与 调节胚胎发育、机体免疫及肿瘤形成、发展等过程[1°]。目前可见一些锌指蛋白与乳腺发育相关，如 ZfP157、Zf P289 和 ZNF503。Zfpl57 是乳腺转录因子Stat6的下游靶点，在外胚层中表达，青春期后，ZfP157主要在导管的基底上皮细胞和毛囊的皮脂腺中表达[1°]。ZfP289可能是碱性螺旋环螺旋转录因子的显性负调控因子（Id-1)诱导乳腺上皮细胞增殖的重要介质["】。ZNF503是G A T A结合蛋白3 (GATA3)表达和转录活性的转录抑制因子，可诱导 乳腺上皮细胞增殖和乳腺癌的发生M2]。但目前未发现Z/P281与乳腺发育相关的研究，但在胚胎干细胞中，Z/P281可与胚胎干细胞核心转录因子Nanog 启动区的位点结合直接激活Nanog的表达，并且 Z/p281同时具有激活域和抑制域，对胚胎干细胞的增殖、更新和多能性的调控网络中起着双重作用[13]。我们推测小鼠乳腺发育障碍可
能与Z/P281下调有关。
此外，Z/P281可以调控X射线修复交叉互补分子2(XRCC2)和4(XRCC4)的转录激活，通过调控不同修复机制基因的表达参与DNA损伤修复[~。骨髓细胞瘤癌基因（myelocytomatosis oncogene，c-Myc)诱导的上皮间质转化（epithelial-menchymal transition，EMT)依赖于 Z//>281 的表达，Z/p281 的转 录受 SRY 盒转录因子 4(SRY-box transcription factor 4，SOX4)控制，S0X4在许多人类恶性肿瘤中表达，影响关键生长因子、发育途径和癌症进展。Z/p281 的转录也受到miR34a通过p53依赖机制的抑制~]。可见Z/P281在肿瘤中具有重要的生物学功能，iRhom2t w小鼠可能具有不同于野生型小鼠的肿瘤发生或发展表型。
Z/p281也是神经元分化的调控因子，在小鼠皮层神经元终末分化和维甲酸诱导的神经母细胞瘤(neuroblastoma，N B)细胞分化过程中，Z办281的表 达减少，而异位表达Z//>281，可以抑制小鼠皮层神经 元和N B细胞的分化[15]。在iRhon^i小鼠中Mfsd2a和Cnn3显著下调，Mfsd2a(主要促进因子超 家族成员2a)是跨膜蛋白和钠依赖性溶血磷脂酰胆碱转运体，是血脑屏障形成和维持完整性的关键组成部分[16_〜。Grm3是编码代谢型谷氨酸受体3的基因，谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，可激活离子型和代谢型谷氨酸受体。谷氨酸 能神经元是神经系统中最为重要的兴奋性神经元，谷氨酸能神经介质参与了正常大脑功能的大部分方 面119_21]，在许多神经病理学条件下可能受到干扰。iRh〇m2u"™小鼠中嗅觉受体365(01fr365 )和碳酸酐 酶lO(CarlO)显著上调，嗅觉受体与鼻子中的气味分子相互作用，启动神经反应，从而触发嗅觉[22]。嗅觉受体通过7个跨膜结构与许多神经递质和
激素 受体结合，识别气味信号和G蛋白介导的转导。CarlO可能在分泌途径中与神经突起形成复合物，促进神经突起的表面运输m]。催乳素参与运动对慢性应激性记忆巩固障碍的保护调节[24]。这些差 异表达的基因在神经系统中具有重要的作用，同时 研究发现iRhom在果蝇中主要在神经组织表达。我们推测，iRhom2^小鼠可能具有不同于野生型小鼠的神经发育表型，其是否能应用于肿瘤生物学或神经生物学动物模型的建立需要进一步研究。
参考文献
[1]Sternlicht M D,Kouros-Mehr H,Lu P,et al.Hormonal and
local control of m a m m a r y branching morphogenesis J .
Differentiation, 2006, 74(7)：365-381.
[2 ]McNally S, Martin F. Molecular regulators of pubertal m a m m a r y
gland development[ J].A n n M e d,2011, 43(3)：212-234.
[3J Ciarloni L,Mallepell S,Brisken C. Amphiregulin is an esntial mediator of estrogen receptor alpha function in m a m m a r y gland
development [J]. Proc Natl A c a d Sci U S A,2007, 104( 13)：
5455-5460.
[4 ]Li S R,W a n g D P,Y u X L, et al.U n c v(uncovered) ：a n e w
mutation causing hairloss on m o u s e chromosome 11 J .Genet
Res, 1999, 73(3)：233-238.
[5 ]Liu B, X u Y,Li W L, ef al.Proteomic analysis of differentially
expresd skin proteins in i R h o m2 (U n c v)mice[ J .B M B R e p,
2015, 48：19-24.
[6 j Y a n g L L, Liu B,Li Y,et al.i R h o m2mutation leads to
第6期尚艳姣等：iRhmr^w小鼠乳腺发W障碍的转录组分析• 53•
aberrant hair follicle differentiation in mice [ J ]. P L o S O n e,
2014, 9：ell5114.
[7]Binarl N,O r m a n d y C J, Kelly P A. M a m m a r y Gland
Development and the Prolactin Receptor [J ] . A d v Kxp M e d Biol,
高中辅导班
2000, 480：85-92.
[8Mcllwain D R,Lan g P A,Maretzky T,et al.i R h o m2 regulation of T A C E controls T N F-m e d i a t e d protection against Listeria and
respons to L P S[J]. Science, 2012, 335(6065)：229-232. [9 ]Adrain C, Zettl M,Christova Y,el al.T u m o r necrosis factor
signaling requires i R h o m2 to promote trafficking and activation of
T A C E[J]. Science, 2012,335(6065)：225-228.
[10] Oliver C H,Nichols J, W a t s o n C J. T h e K R A B D o m a i n Zinc
open worldFinger Protein,Zfpl57, Is Expresd in Multiple Tissues During
Mou Emhryogenesis and in Specific Cells in Adult M a m m a r y
Gland and Skin[ J]. Genesis, 2013, 51 (3)：179-186.
[11」Singh J, Itahana Y,Parrinello S, el al.Molecular Cloning and Characterization of a Zinc Finger Protein Involved in 1(1-1-
stimulated M a m m a r y Epithelial Cell Growth [J J . J Biol C h e m,
2001, 276(15)：11852-11858.
[12] Shahi P, W a n g C Y,Laws o n D A, ef al.Z N F503/ Zpo2Drives
Aggressive Breast Cancer Progression by Down-Regulation of
G A T A3 Expression [ J ].Proc Natl A c a d Sci U S A,2017, 114
(12)：3169-3174.
[13] W a n g Z X,T e h C H L, C h a n C M Y,al.T h e Transcription
Factor Zfp281 Controls Eml)ryonic Stem Cell Pluripotency by
Direct Activation and Repression of Target Genes [ J j .Stem
Cells, 2008, 26 ( 11) ：2791-2799.
[14] Pieraccioli M,Nicolai S, Antonov A,et al.Z N F281Contributes
to the D N A D a m a g e Respon by Controlling the Expression of
X R C C2and X R C C4[ J ]. O ncogene, 2016, 35 ( 20 ):
2592-2601.
[15] Pieraccioli M,Nicolai S, Pitolli C,et al.Z N F281Inhibits
Neuronal Differentiation and Is a Prognostic Marker for
Neuroblastoma [J J .Proc Natl A c a d Sci U S A,2018, 115
(28)：7356-7361.
[16]朱嘉微，肖汀.主要促进因子超家族成员M f s d2a的研究进展
[J].癌变•畸变•突变，2019,31(1):86-88.
[17]Andreone H J ,C h o w B W,Tata A,et al.Blood-Brain Barrier
Permeability Is Regulated by Lipid Transport-Dependent
Suppression of Caveolae-Mediated Transcytosis [ J ] .N e u r o n,
2017, 94 (3)：581-594.
[18]C h o w B W,G u C H. Gradual Suppression of Transcytosis
Governs Functional Blood-Retinal Barrier Formation [J J .
Neuron, 2017, 93 (6),1325-1333.
[19]M c O m i s h C E,Demireva E Y,Gingrich J A,et al.
Developmental Expression of m G l u2and m G l u3in the M o u s e
Brain[ J] . G e n e Expr Patterns, 2016, 22 (2)：46-53.
[20]Joffe M E, Santiago C I, Oliver K H, et al.m G I u2 and m G I u3
Negative Allosteric Modulators Divergently Enh a n c e
Thalamocortical Transmission and Exert Rapid Antidepressant
like Effects[J]. Neuron, 2020, 105 ( 1) ：46-59.
[21 |M e n n a L D,Joffe M E,Iacovelli L, et al.Functional
Partnership Between m G l u3and m G l u5Metabotropic Glutamate
Receptors in the Central Nervous System [J ].
Neuropharmacology, 2018, 128：301-313.
[22] Papadimitriou E M,Allen W E,Colquitt B M,ei al.Enhancer
Interaction Networks as a M e a n s for Singular Olfactory Heceptor
Expression!；J]. Cell, 2014, 159 (3):543-557.
羞愤非主流英语网名
[23]Sterky F H,Trotter J H,Lee S J,ef al.Carbonic anhydra-
related protein C A10 i s an evolutionarily conrved pan-neurexin
ligand[J]. Proc Natl A c a d Sci U S A,2017, 114(7)：
E1253-E1262.
[24 ]L e e m Y H,Park J S, C h a n g H,et al.Exerci Prevents M e m o r y
Consolidation Defects Via Enhancing Prolactin Responsiveness of
C A1Neurons in Mice U n d e r Chronic Stress[J]. Mol Neurobiol,
2019, 56(9) ：6609-6625.
(下转至第58页）
