酵母单杂转化方法
1)制备Y1HGold[Bait/AbAi]酵母感受态细胞;
2)在一个无菌的15ml离心管中配置如下体系
AD文库(2–5 μg)
20ul Herring Testes Carrier DNA,denatured
加600ul Y1HGold[Bait/AbAi]酵母感受态细胞;团委书记竞聘
3)轻柔的漩涡混匀;
4)加2.5ml PEG/LiAc;
cutacross5)轻柔的漩涡混匀;
6)30℃水浴温浴45min，每15min混匀一次;
7)加160ul DMSO,42℃水浴温浴20min，每10min混匀一次;
8)700×g 离心5min
9)吸去上清，用3mlYPDA悬浮沉淀;
10)30℃振荡培养90min;
11)700×g 离心5min;
12)弃去上清，用15ml无菌生理盐水悬浮沉淀;
涂布于SD/-Leu/AbA平板上，每150ul涂布于一个150mm的平板上。
30℃倒置培养，直至克隆长出。
the的用法Y1HGold Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格
Y1HGold: 10×100μl保存条件:-80℃
pAbAi(control vector):10ng/μl 10μl 保存条件: 4℃
Carrier DNA: 5ug/μl 100 μl 保存条件: -20℃
PEG/LiAc: 5 ml 保存条件: 4℃
基因型
MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met –, MEL1
产品说明
Y1HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株,MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker为: ura3,leu2；报告基因为:AbAr。
Y1HGold -GAL4-AbA酵母单杂系统需要两种质粒配套使用:pAbAi和PGADT7。质粒pAbAi的筛选标志为URA，用于表达 pBait-AbAi construct (1~3个bait DNA 序列重复串联后克隆到pAbAi中)；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达
AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA酵母单杂系统原理:Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度
基地组织头目
(0.1-0.2ug/ml) 下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株
wmc(Bait-Reporter Yeast Strains)，当猎物蛋白(Prey)结合到诱饵序列(Bait DNA)上,GAL4 AD就会激活AbAr 的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长。AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。High5TM系列Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月，经pAbAi质粒检测转化效率>103cfu/μg DNA 。
Y1HGold酵母感受态细胞操作方法oddeven
1. 取pBait-AbAi质粒5ug,BstBI 或 BbsI酶切1小时，回收。
2. 取100 μl冰上融化的Y1HGold感受态细胞，依次加入预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5ug(体积不高于15ul),Carrier DNA(95-100度5min，快速冰浴，重复一次)10 ul ,PEG/LiAc 500ul并吸打几次混匀,30度水浴30 分钟(15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42度水浴15min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm 离心 40s 弃上清,ddH2O 400ul 重悬，离心 30s 弃上清。挫折也美丽
5. ddH2O 50ul重悬，涂SD/-Ura平板,29℃培养72h。
6. 挑取5-10个克隆，用PCR方法确定pBait-AbAi整合到Y1HGold基因组中,PCR阳性菌株在SD/-Ura 平板划线,29℃培养72h,4℃保存，此菌株即是
Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。
Y1HGold酵母感受态细胞
Preparation of Media:
YPDA (1L):
Tryptone 20g
yeast extract 10g
0.2% adenine 15ml
补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5 Agar 20g (for plates only) 121度,15分钟高压灭菌,
待培养基温度降到55度时，加
儿童动画片
入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml 0.2% adenine(1L)
中美对话女翻译官意外走红Adenine 2g
补水到1L
idea溶解后高压灭菌
或0.22um 滤膜过滤除菌
Y1HGold酵母感受态细胞
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. Y1HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而,Y1HGold的ADE
2基因被破坏,Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物
P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm 克隆，涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h 培养可见直径1mm克隆。
