TRIzol®Reagent提取RNA
——王珠清
TRIzol®Reagent（Cat. 15596-026或15596-018，Invitrogen）是提取人、动物、植物、酵母或细菌高质量总RNA（或DNA和蛋白）的试剂。它主要由酚、异硫氰酸胍及其他促进不同种类RNA分离的组分组成。TRIzol®Reagent在样本均质化过程中破坏细胞及分解细胞组分时，能通过高效抑制RNa活性来维持RNA的完整性。
材料：
氯仿、异丙醇、75%乙醇（用DEPC-treated water配置）、RNa-free water或者DEPC处理水（DEPC处理水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40µlDEPC（0.01% （v/v）），37℃过夜，送至高压）。
Protocol：
一、 样本均质化：
1、根据样本类型来决定，具体操作如下：
样本 | 操作 |
组织 | 50-100mg组织/ml TRIzol，用匀浆器或研钵碾碎 |
贴壁细胞（单层） | 将培养基移除后直接加TRIzol，用枪头吹打混匀裂解细胞（35mm培养皿/ml TRIzol；60mm培养皿/3ml TRIzol；100mm培养皿/8ml TRIzol）。 |
悬浮细胞 | 离心收取细胞，0.25ml样本/0.75ml TRIzol（动物、植物或酵母5-10×106细胞；细菌1×107细胞)，枪头吹打混匀裂解 |
treaty | the power of love |
备注：如RNA量很少，可适当加入4-8 µl核酸助沉剂（Acryl Carrier）/ml TRIzol
2、4°C 12,000× g离心10 min，弃沉淀，将上清移入一新1.5ml离心管中（沉淀中包括细胞
外基质（ECM）、多糖及高分子量的DNA，上清中则包含RNA。而在高脂样本中在上清上层有一层油脂）；
3、如继续操作，则直接进入步骤二（分相）；如果暂时不用，可直接置于室温几小时或置于-80℃保存一年。
二、分相：
1、将均质样本室温静置5 min以使核蛋白质复合物分离；
2、加200 µl氯仿（1ml TRIzol处理样本），盖上盖子，手剧烈摇动15s后室温静置2-3 min；
3、4℃ 12000×g离心15 min（离心后液体分为三层：上层水相包含RNA；下层有机层包含DNA和蛋白）；
4、小心将上层水相移入一新1.5 ml离心管中，避免吸到中间层及下层有机层。
三、RNA沉淀：
1、加0.5%异丙醇（1ml TRIzol处理样本），室温10 min；
2、4℃ 12000×g离心10 min。
四、RNA漂洗：
1、弃上清，用1 ml 75%乙醇漂洗（1ml TRIzol处理样本）（RNA在75%乙醇中于-20℃至少可以保存一年；于4℃至少可以保存一周）；
2、短暂涡旋样本，然后在4℃ 7500×g离心5 min，弃上清；
3、室温风干5-10 min（不要使RNA过于干燥，这样会降低RNA溶解度，而部分溶解的RNA样本A260/280<1.6。
五、RNA重悬：
1、用黄枪头吸20-50µlRNa-free水将RNA重悬，吹打混匀；
2、置于-80℃保存。
六、RNA浓度及纯度测定：
1、用分光光度计测定RNA浓度及纯度：置于纯度，A260为核酸最高吸收峰的吸收波长；A280为蛋白最高吸收峰的吸收波长；A230则为碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。RNA的260/280比例在1.8-2.0；260/230比例在2.0以上说明纯度较高。若260/280低于1.8说明可能有蛋白或酚的污染；若260/230比例低于2.0则可能有碳水化合物或盐离子污染。
2、用琼脂糖凝胶来确定RNA质量：
现在进行时完美的RNA应该是三条带：28，18，5.8
28和18比较亮，而且28S亮度是18S的两倍，最好是2.7：1；5.8基本很模糊，可有可无，如图所示。
反转录-聚合酶链式反应
(Rever Transcription-Polymera Chain Reaction，RT-PCR)
——王珠清
原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
Protocol：
一、DNa I消化基因组：
一般情况下，为避免基因组的污染，在反转录之前要对基因组进行消化，这里要用到DNa I（Cat. EN0521，Fermentas），具体体系如下：
1、
RNA | 1 µg |
10×reaction buffer with MgCl2 | 1 µl |
DNa I, RNa-free | 1 µl (1 U) |
DEPC-treated Water | to 10 µl |
| |
2、37℃ 30 min；
3、加1 µl 50 mM EDTA，65℃ 10 min。
二、反转录：
如在定量PCR时需做NRT(no rever transcript)，则吸出10 µl进行反转，剩下1 µl做NRT；如不需则直接拿上一步产物11µl进行下一步试验。
目的不同则反转录方法也不同，
（一）若为普通mRNA定量，则有两种方法：
1、iScriptcDNA Synthesis Kit（Cat.170-8890或170-8891，Bio-Rad），具体体系（20µl）如下：
5×iScript reaction mix | 4 µl |
iScript rever transcripta | 1 µl |
Nuclea-free water | 4µl或5µl |
RNA template (DNa I消化完产物) | 11µl或10µl |
| |
cspan置于PCR仪中25ºC5 min，42ºC 1 h，85ºC 5 min
2、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Cat.1621或K1622，Thermo Scientific），具体体系（12µl）如下：
Template RNA | total RNA(DNa I消化完产物) | 11µl或10µl obsolescence |
Primer | Oligo(dT)18 primer | 1 µl |
or random hexamer primer | 1 µl |
or gene-specific primer（也可用于miRNA） | 15-20 pmol |
Nuclea-free water | | 0µl或1µl |
| lobbyist | |
如果RNA模版富含GC或包含二级结构，温和混合后简单离心，于65°C孵育5 min后置于冰上。然后按照如下顺序加样(20µl)：
5×Reaction Buffer | 4 µl克林贡语 |
RiboLockRNa Inhibitor (20 u/µl) | 1 µl |
10 mMdNTP Mix | 2 µl |
RevertAid M-MuLV Rever Transcripta (200 u/µl) | 1 µl |
| |
温柔混合后离心，
（1） 若用oligo(dT)18或gene-specific primer为引物，则42℃孵育60min；
（2） 若用random hexamer primer为引物，则25℃5min后42℃孵育60min。
70°C 5 min终止反应。
（二）若为miRNA定量，则要用到polyA加尾法（Cat. 0960201，Quanto Bio）：
1、在miRNA 3’尾添加polyA（20 µl）
10×buffer，E.coli poly（A） polymera | 2 µl |
10mM ATP | 2 µl |
RNa Inhibitor | 0.5 µl |
Total RNA（DNa I消化完产物~1.0 µg） | 11 µl |
RNa-Free Water | 4 µl |
E.coli poly（A） polymera | 0.5 µl |
| |
好习惯成就好人生离心15s，37℃孵育1h（PCR仪或温箱，勿在水浴锅）
2、cDNA合成（40 µl）
Product（上一步产物） | 20 µl |
RT primer（0.5ug/µl） | 0.5 µl |
| |
70℃ 5 min（1、破坏RNA和引物的二级结构；2、灭活poly（A）polymera）；
冰浴5 min；
然后按照以下体系添加：
5×MLV Rever Transcripta Buffer | 圣诞歌英文版8 µl |
10mM dNTP | 2 µl |
RNa Inhibitor | 1 µl |
Poly A加尾后反应产物 | 20 µl |
RNa-Free Water | 8 µl |
M-MLV Rever Transcripta | 1 µl systema |
| |
50℃ 50 min后于70℃15 min灭活
DNA提取
——王珠清&任立坤
一、传统酚氯仿抽提法
1、溶液的配制：
本试验所用试剂的配制若无特别的要求，均为重蒸水溶剂，高压灭菌（1.034×105 Pa）20 min。
（1）0.5 mol/L EDTA：称取18.61 g EDTA溶于80 mL蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH值至8.0（约需2 g NaOH颗粒），加水定容至100 mL，高压灭菌。
（2）1 mol/L Tris-Cl：称12.14 g tris碱溶于80 mL蒸馏水中，加浓盐酸调pH值至8.0，定容至100 mL，高压灭菌。
（3）10% SDS：称10 g SDS溶于90 mL蒸馏水，加热至68℃助溶，用盐酸调pH值至7.2，定容至100 mL。
（4）STE裂解缓冲液：1 M Tris-HCl 2 mL，0.5 M EDTA•Na 4 mL，5 M NaCl 4 mL，定容至200 mL，高温高压灭菌20 min，4℃保存。
（5）5 M NaCl：150 mL水中加入58.44 g NaCl，加水定容至200 mL，高压灭菌。
（6）3 mol/L NaAc：称取40.81 g NaAc溶于50 mL蒸馏水，用冰醋酸调其pH值至5.2，定容至100 mL。
（7）DNA抽提buffer：1 mol/L Tris 1 mL，0.5 mol/L EDTA 20 mL，10% SDS 5 mL加双蒸水定容至100 mL。
（8）PBS：在800mL蒸馏水中溶解8g NaCL、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌20 min，室温保存。
（9）70% 乙醇，70 mL无水乙醇，加30 mL蒸馏水至100 mL。
2、Protocol：
（1）哺乳动物全血100-400μl和禽类、两栖类全血5-20μl，用等量PBS洗后离心取白细胞沉淀；动物细胞106-107 cells，用PBS洗后离心取细胞沉淀；动物组织30-50 mg，用PBS洗掉血迹后于1.5mL离心管中剪碎。
