・神经内分泌与免疫・
肿瘤坏死因子α对3T32L1细胞葡萄糖摄取和I RS21信号通路的影响
曾天舒 袁 莉 陈璐璐 (华中科技大学同济医学院附属协和医院内分泌科，武汉430022)
中国图书分类号 R58711 文献标识码 A 文章编号 10002484X(2006)0920830205
[摘 要] 目的：观察T NF2α作用于3T32L1细胞对胰岛素介导的葡萄糖摄取和I RS21相关信号通路的影响。方法: T NF2α分别作用于3T32L1细胞6小时和24小时后用胰岛素刺激，观察细胞葡萄糖摄取,I RS21酪氨酸、丝氨酸307磷酸化水平以及PK B磷酸化水平。同时观察那巴霉素对T NF2α作用的影响。结果:T NF2α明显抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取、I RS21酪氨酸及PK B磷酸化，这些作用可被那巴霉素逆转。T NF2α作用6小时对I RS21蛋白无影响但导致丝氨酸307磷酸化，作用24小时则降低I RS21蛋白水平，那巴霉素拮抗T NF2α导致I RS21减少但对丝氨酸磷酸化无作用。结论:T NF2α导致的脂肪细胞胰岛素抵抗与I RS21酪氨酸磷酸化水平下降密切相关,Rapa mycin可以逆转T NF2α的作用。
[关键词] 肿瘤坏死因子2α；胰岛素受体底物1；蛋白激酶B;3T32L1脂肪细胞；葡萄糖摄取
TNF2αi m pa i rs gluco upt ake and I RS21a ssoc i a ted si gna li n g pa thway by sti m u2 l a ted i n suli n i n3T32L1ad i pocytes
ZEN G Tian2Shu,YUAN L i,CHEN L u2L u.D epa rt m ent of Endocrinology,U n ion Hospita l,Tong2jiM edical College, W uhan430022,Ch ina
[Abstract] O bjecti ve:To investigate gluco up take and I RS212ass ociated signaling path way by sti m ulated insulin under T NF2αtreat m ent.M ethods:3T32L1adi pocytes were treated with T NF2αwithin6hours and24hours res pectively.22deoxy3[H]gluco was ud t o measure gluco up take and western bl ot was ud t o measure I RS21,PK B p r otein,tyr osine and rine307phos phorylati on on I RS21,and PK B phos phorylati on.Results:On basal status,gluco up take of3T32L1cells and phos pho2tyr osine of I RS21,PK B phos2 phorylati on,and rine307phos phorylati on on I RS21were all l ow.I nsulin sti m ulati on induced gluco up take and I RS21tyr osine phos2 phorylati on,rine307phos phorylati on,PK B phos phorylati on rap idly.T NF2αinhibited insulin2induced gluco up take,tyr osine phos2 phorylati on of I RS21and PK B phos phorylati on.Rapa mycin reverd the effects of T NF2α.Treated with T NF2αwithin6hours incread rine307phos phorylati on but had no effect on I RS21p r otein level.T NF2α2induced rine307phos phorylati on of I RS21was not affected by rapamycin.I RS21level was decread under24hours T NF2αtreat m ent and rapamycin can rever the effect.Conclusi on:T NF2αinduced insulin resistance in3T32L1adi pocytes m ightbe related t o i m paired I RS21tyr osine phos phorylati
on,rapa mycin could rever the effects of T NF2α.Treated with T NF2αwithin6hours sti m ulate phos phrylati on of rine307of I RS21and24hours treat m ent de2 cread I RS21p r otein level.Rapa mycin antagonist T NF2α2induced l os of I RS21.
[Key words] Tu mor necr osis fact or2α;I nsulin recep t or substrate21;Pr otein kina B;3T32L1adi pocyte;Gluco up take
肿瘤坏死因子2α(T NF2α)是一种具有多种功能的细胞因子，因其导致胰岛素抵抗从而可能在肥胖,2型糖尿病等疾病的发生中起着重要的作用。但是,T NF2α引起胰岛素抵抗的机制还不十分清楚, T NF2α导致胰岛素受体底物1(I RS21)丝氨酸磷酸化进而反馈抑制自身酪氨酸磷酸化可能是其重要机制之一。本研究观察T NF2α作用不同时间对3T32 L1脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取和PK B活化的影响及其和I RS21蛋白水平、酪氨酸及丝氨酸磷酸化变化之间的关系，了解T NF2α导致胰岛素抵抗的可能机制。
作者简介：曾天舒(1969年-)，男，医学博士，主治医师，主要从事胰岛素抵抗的机制和治疗方面的研究,E2mail:ti m zengsky@
<。1 材料与方法myheartwillgoon
英国议会否决脱欧111 研究材料 胰岛素为诺和诺德公司产品;22脱氧3[H]葡萄糖、羊抗兔二抗和ECL检测试剂为Am2
horback
ersha m公司产品；鼠T NF2α为R&D产品；细胞培养基、抗生素及胎牛血清(F BS)为GI B CO产品；那巴霉素(Rap)为Sig ma产品。抗I RS21和抗磷酸化I RS21(Ser307)抗体为UB I产品；抗磷酸化酪氨酸抗体(RC220)为R&D产品；抗β2肌动蛋白、抗蛋白激酶B(PK B)和抗磷酸化PK B(Ser473)抗体为Cell Signaling产品。BCA蛋白质测定试剂为B i o2Rad产品。其他化学试剂均为分析纯。
112 细胞培养 在37℃、5%CO2条件下,3T32L1前脂肪细胞在含10%新生牛血清的高糖DME M中培养，当细胞融合后2天，更换为含015mmol/L32
异丁甲基黄嘌呤,011μg/m l生物素,2μg/m l胰岛素,100ng/m l地塞米松和10%F BS的高糖DME M 培养基中培养3天，更换为2μg/m l胰岛素和10% F BS的高糖DME M培养基继续培养3天，其后用含10%F BS的DME M培养，以后每2天换培养液1次。诱导分化后第10～12天的细胞呈脂肪细胞表型，可进行实验。实验前1天更换含012%BS A的无血清DME M培养基过夜。
113 脂肪细胞的T NF2α处理和葡萄糖摄取分析 培养于24孔培养板的3T32L1脂肪细胞于实验前1天更换为含012%BS A的无血清培养基培养过夜。实验组分别加入T NF2α(溶解于含011%BS A的P BS缓冲液)20ng/m l培养4和22小时，对照组加入等体积含011%BS A的P BS缓冲液。那巴霉素干预组在加入T NF2α前1小时加入Rap终浓度为20 mmol/L。实验前细胞在含012%BS A的KRB缓冲液中(内含1215mmol/L HEPES,12010mmol/L NaCl,610mmol/L KCl,112mmol/L MgS O4,110 mmol/L CaCl2,014
mmol/L NaH2P O4,016mmol/L Na2HP O4)37℃平衡2小时，实验组仍加入T NF2α。然后加入胰岛素(终浓度100n m)孵育10分钟，非特异摄取孔加入细胞松弛素B(25mmol/L)015μl 孵育5分钟后每孔加入含5μCi22脱氧3[H]葡萄糖的22脱氧葡萄糖混和液25μl，准确计时孵育5分钟后迅速吸去全部孵育液中止反应，冰P BS洗涤细胞3次，吸去洗涤液，室温下干燥后每孔加入500μl Trit on210030分钟裂解细胞，取400μl细胞裂解液用液闪计数器读数。
114 免疫印迹分析 培养于100mm培养皿的脂肪细胞同样经上述T NF2α和那巴霉素处理后，用100nmol/L胰岛素刺激15分钟后吸去培养液，用冷P BS洗涤细胞3次后加入细胞裂解液015m l，刮起细胞，细胞悬液先后分别过22G及27G针头数次，静置10分钟后500G(4℃)离心15分钟，留上清，用BCA法测定蛋白质浓度。蛋白质置于-80℃冰箱保存。电泳前按2∶1体积比与上样缓冲液混和, 95℃变性10分钟，各取20μg蛋白上样715%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转印到硝酸纤维素膜上，在封闭缓冲液中4℃过夜。检测I RS21磷酸化酪氨酸时，转印膜与偶联辣根过氧化物酶的抗体(1∶2000)在室温下孵育2小时后经P BS清洗后加ECL试剂，显象，成像。其余反应分别与第一抗体孵育(I RS21浓度为015μg/m l；其余抗体浓度均为1∶1000)在4℃反应过夜，与1∶10000羊抗兔抗体孵育1小时，加ECL试剂反应，显像，成像。115 结果分析与统计 免疫沉淀结果用I m ageJ软件分析。结果用x±s表示，两组间比较采用t检验。
2 结果
211 T NF2α作用不同时间对3T32L1脂肪细胞葡萄糖摄取和PK B活化的影响 见图1和图2。对照组细胞在没有胰岛素作用的基础状态下对葡萄糖有低水平摄取，此时PK B磷酸化处于极低水平。胰岛素刺激可以使细胞葡萄糖摄取明显增加到基础水平5倍以上，而PK B磷酸化水平升高达基础水平10倍左右。
T NF2α作用使基础状态下细胞葡萄糖摄取和PK B磷酸化水平轻度升高。而对胰岛素刺激的葡萄糖摄取和PK B磷酸化有显著抑制作用(P< 0101)：作用6小时可以使胰岛素激发的葡萄糖摄取下降近40%，而24小时则减少超过50%；不论6小时还是24小时T NF2α作用均明显抑制胰岛素刺激PK B磷酸化达到50%以上。上述结果提示T NF2α使得细胞对胰岛素敏感性下降。但是T NF2α作用对PK B蛋白水平没有明显影响。
212 T NF2α对3T32L1脂肪细胞I RS21及其磷酸化的影响 见图3。对照组细胞基础状态下I RS21酪氨酸和Ser307磷酸化水平均极低，胰岛素刺激使I RS21酪氨酸和Ser307磷酸化水平分别升高8倍和815倍。T NF2α作用使I RS21基础酪氨酸磷酸化水平升高1倍左右(P<0101),
但是胰岛素刺激的酪
图1 TNF2α降低3T32L1脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取
F i g11 TNF2αtrea t m en t reduces i n suli n sti m ul a ted gluco
班会开场白upt ake i n3T32L1ad i pocytes
Note:T NF2αtreated with6hours or24hours was marked as6h or24h res pectively.＄1P<0105compared with column1,331P<
0101compared with column2.
氨酸磷酸化水平则明显下降(P <0
101)：作用6小时下降约30%，作用24小时则降低近50%，与葡萄糖摄取的改变相仿。
T NF 2α作用不同时间对I RS 21蛋白水平和其Ser307磷酸化的作用不同:6小时对蛋白水平无影
响而可刺激其基础Ser307磷酸化水平增高6倍，胰岛素刺激可使其进一步升高；作用24小时后，细胞内I RS 21水平明显减少而Ser307磷酸化水平恢复到基础水平，胰岛素刺激不能进一步增强其磷酸化。
法语翻译在线213 那巴霉素逆转T NF 2α导致的胰岛素抵抗 见图4、图5和图6。那巴霉素是哺乳动物T OR
(Ma mmalian target of rapa mycin,mT OR )的特异性抑制剂，经Rap 预处理可以明显拮抗T NF 2
α抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取、I RS 21酪氨酸磷酸化以及PK B 活化。同时,Rap 也逆转T NF 2α导致I RS 21蛋白水平下降的效应，但是对Ser307磷酸化状态改变没有影响
。
图2 TNF 2
α降低胰岛素活化蛋白激酶B 的作用F i g 12 TNF 2αi m pa i rs i n suli n sti m ul a ted prote i n k i n a B
acti v ity
Note:T NF 2
αtreated with 6hours or 24hours was marked as 6h or 24h res pectively .Cells showed in column 1,3,5were not sti m ulated with insulin and column 3and 5was compared with column 1re 2s pectively .Cells showed in Column 2,4,6were sti m ulated with in 2sulin and column 4and 6were compared with column 2res pective 2ly .331P <0101compared with column
2.
图3 TNF 2α降低胰岛素刺激的I RS 21酪氨酸磷酸化
F i g 13 TNF 2αtrea t m en t reduces i n suli n sti m ul a ted tyrosi n e phosphoryl a ti on of I RS 21
Note:T NF 2
αtreated with 6hours or 24hours was marked as 6h or 24h res pectively .Cells showed in column 1,3,5were not sti m ulated with insulin and column 3and 5were compared with column 1re 2s pectively .Cells showed in column 2,4,6were sti m ulated with in 2sulin and column 4and 6were compared with column 2res pective 2ly .＄1P <0105compared with column 1,31P <0105compared with column 2,331P <0101compared with column
2.
图4 那巴霉素逆转TNF 2
α对胰岛素刺激的葡萄糖摄取的抑制
F i g 14 Rapam yc i n revers TNF 2
α2i n duced i n h i b iti on of i n 2suli n sti m ul a ted gluco upt ake
Note:T NF 2
αtreated with 6hours or 24hours was marked as 6h or 24h res pectively .Cells showed in column 1,3,5were not sti m ulated with insulin and column 3and 5were compared with column 1re 2s pective
ly .Cells showed in column 2,4,6were sti m ulated with in 2sulin and column 4and 6were compared with column 2res pective 2ly .＄1P <0105compared with column 1,31P <0105compared with column 2.
图5 那巴霉素逆转TNF2α对胰岛素刺激的
I RS21酪氨酸
磷酸化的抑制
F i g15 Rapam yc i n revers TNF2α2i n duced i n h i b iti on of
tyrosi n e phosphoryl a ti on of I RS21
Note:T NF2αtreated with6hours or24hours was marked as6h or24h res pectively.Cells showed in column1,3,5were not sti m ulated with insulin and column3and5were compared with column1re2 s pectively.Cells showed in column2,4,6were sti m ulated with in2 sulin and column4and6were compar
ed with column2res pective2 ly.＄1P<0105compared with column1,＄＄1P<0101com2 pared with column1,331P<0101compared with column2.
3 讨论
近年来在多种肥胖及2型糖尿病的动物模型以及病人中观察到脂肪组织T NF2α表达水平增高与个体的胰岛素敏感性下降显著相关，而使用T NF2α受体2I gG嵌合蛋白中和T NF2α可以改善肥胖大鼠的胰岛素敏感性，提示T NF2α可以导致胰岛素抵抗。在本实验中用T NF2α处理3T32L1脂肪细胞使得胰岛素刺激的葡萄糖摄取明显下降，说明通过T NF2α处理建立了胰岛素抵抗的细胞模型。
现在认为T NF2α导致胰岛素抵抗的主要机制包括通过降低G LUT4水平和抑制G LUT4转位以及直接影响胰岛素介导的信号通路导致胰岛素抵抗[1,2]
。图6 那巴霉素逆转TNF2α抑制胰岛素活化蛋白激酶B的作用
F i g16 Rapam yc i n revers TNF2α2i n duced i n h i b iti on of
phosphoryl a ti on of PKB
Note:T NF2αtreated with6hours or24hours was marked as6h or24h res pectively.Cells showed in column1,3,5were not sti m ulated
with insulin and column3and5were compared with column1re2
s pectively.Cells showed in column2,4,6were sti m ulated with in2
sulin and column4and6were compared with column2res pective2
ly.31P<0105compared with column2.
在肌肉和脂肪组织，胰岛素结合于其跨膜受体，使I RS21上的酪氨酸位点磷酸化后将信号下传，介导一系列生物效应，其中三磷酸肌醇激酶(P I3K)和其下游的蛋白激酶B(PK B)在介导细胞摄取葡萄糖以及糖酵解和糖原合成等胰岛素的促代谢效应中起到重要作用。在人类2型糖尿病患者中普遍存在I RS系
统的异常，如脂肪细胞I RS21水平的降低[2]。早期研究显示极大剂量的T NF2α可以影响脂肪细胞胰岛素受体蛋白水平或其自身酪氨酸磷酸化，但是最近在人类和动物脂肪细胞均未发现T NF导致胰岛素抵抗伴有胰岛素受体的改变，而近年来T NF2α对I RS21的作用愈来愈受到重视[1,3,4]。
抑制I RS21酪氨酸磷酸化的可能机制包括I RS2 1降解加速和I RS21蛋白上的丝氨酸残基磷酸化反馈抑制酪氨酸磷酸化[5,6]。后者可能是一种生理性
的反馈调节机制，但是在高胰岛素血症和T NF2α作用下出现的I RS21丝氨酸磷酸化增强提示这一机制可能参与胰岛素抵抗的发生。
在I RS21上近百个丝氨酸位点中第307位丝氨酸(人类为312)的研究最为深入[7]。多种因素可导致Ser307/312磷酸化从而抑制酪氨酸磷酸化并可能参与I RS21降解[8]。本实验发现T NF2α作用导致胰岛素刺激酪氨酸磷酸化水平下降和葡萄糖摄取减少，但是作用6小时使I RS21的Ser307磷酸化明显增强而I RS21蛋白水平并无明显变化；作用24小时则使I RS21蛋白水平明显下降，此时Ser307磷酸化水平已无明显升高。上述结果提示，在短时间T NF2α作用下，丝氨酸磷酸化可能是抑制酪氨酸磷酸化的主要因素，而长期作用下I RS21蛋白减少则发挥主要作用，此时丝氨酸磷酸化的作用可能并不重要。上述发现支持这样一种假设即丝氨酸磷酸化的作用代表了一种短时调节机制而I RS21水平的减少则代表着长时机制，慢性胰岛素刺激脂肪细胞的体外研究以及在2型糖尿病患者和动物模型的脂肪细胞中I RS21水平下降支持这种假设[9]。
有人发现，用P I3K的抑制剂LY294002可以逆转T NF在N I H3T3细胞和肌细胞中导致的胰岛素抵抗，提示T NF导致的胰岛素抵抗与P I3K及其下游激酶有关[6]。哺乳动物T OR(Ma mmalian target of rapa mycin,mT OR)是哺乳动物体内存在的酿酒酵母T OR的类似物，是一种丝氨酸激酶，可以被PK B所激活，那巴霉素是其特异性抑制剂。有研究表明mT OR可以使I RS21蛋白第636/639位丝氨酸磷酸化从而抑制酪氨酸磷酸化[10]。在慢性高胰岛素血症导致的胰岛素抵抗中,mT OR的激活与I RS21的降解有
amplification关[11]。为了了解mT OR在T NF2α介导的胰岛素抵抗中所起的作用，我们用Rap预处理细胞，发现不论6小时还是24小时的T NF2α作用导致的胰岛素抵抗均被一定程度恢复，且24小时组更为明显。但是Rap对Ser307磷酸化状态并无影响，其部分逆转胰岛素抵抗的作用可能与抑制了mT OR致Ser636/639磷酸化有关。这一结果也提示在T NF2α短期作用下，有不止一个丝氨酸磷酸化位点参与对酪氨酸磷酸化的抑制作用。而在T NF2α作用24小时组,Rapa mycin可以明显逆转I RS21蛋白的减少，与对慢性胰岛素作用相仿，说明mT OR在导致I RS2 1减少中起着重要作用。
thatisright
综上所述,I RS21酪氨酸磷酸化水平下降在T NF2α导致的脂肪细胞胰岛素抵抗中起到重要作用，但是T NF2α作用不同时间导致I RS21酪氨酸磷酸化受损的基础不同，短期作用下主要通过导致I RS21上某些丝氨酸残基磷酸化从而抑制酪氨酸磷酸化，而长期作用可以导致I RS21蛋白水平下降。mT OR作为位于P I3K/PK B下游的丝氨酸激酶参与对I RS21酪氨酸磷酸化的抑制作用，该途径可能成为治疗胰岛素抵抗的靶点。
ought4 参考文献
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[收稿2005210209 修回2006202227]
(编辑 许四平)
