收稿日期:1999-05-23
植物转基因技术及在水稻
遗传改良上的应用
高方远，陆贤军，任光俊
(四川省农业科学院作物研究所，中国成都 610066)
摘 要：水稻是世界上重要的粮食作物。植物转基因工程技术在农作物品种改良方
面已取得可喜成就，显示出农业生物技术的巨大发展潜力和美好前景。本文综述基blue square
因转移技术及其在水稻遗传改良上的应用。
关键词：植物；基因转移技术；水稻；遗传改良；应用
Plant transgenic technique and application in
rice genetic improvement
GAO Fang -yu an ,LU x ian -jun ,REN Guang -jun
(Crop Rear ch Institute,S ichu an Academy of Agricultural S cience,Chengdu 610066,China)
Abstract :Rice is one of the most imp or tant cr ops in the w orld.By u sing p lan t trans genic technique,much progress w ere made in cr op variety improvem ent,and great p otential an d broad prospects of agricu ltural biotechnique w ere also r evealed w ith s uc-cessful utilization of this protocol .Th is paper s ummarized transgenic technique and application in rice gen etic improvem ent .Key words :plant;gene tran sfer technique;rice;genetic improvem ent;application
植物的基因转移是有目的地将外源DNA 导入植物，使之整合、表达并能稳定地遗传。植物基因转移技术由于根癌农杆菌(A grobacterium tumef iciens )Ti 质粒基因转移功能的发现，近年来取得了飞速发展。这一技术的推广应用无疑将给常规育种带来一场新的革命。
转基因植物的研究始于本世纪70年代末80年代初，当时仅在少数几种植物上获得成功。1985年,Horsch 等人[1]首创的叶盘法，开创了用植物外植体为材料进行转基因的新途径，这是转基因植物研究中的一个重要里程碑。1988年，水稻的转基因获得成功[2]。目前，水稻已建立较完善的转化体系。
1 基因转移的方法
1.1 原生质体转化
此转化途径所采用的DNA 导入方法主要有PEG 法和电击法(Paszko w ski 等,1984;To riyama 等,1988)，另外，运用脂质体介导转化法(Freemann,1984)、外源基因直接注射法(周光宇,1983)、显微注射法(Steinbiss ,1983)、激光微束穿刺法(Weber ,1988)及磷
酸钙-DNA 共沉淀法(Ca -P )等也获得了一定程度的成功[3,4]。目前，利用该技术已得到大
量转基因植株。但由于受原生质体再生困难的限制，有些学者认为这并不是一个有效的容易47
1999年12卷高新专辑Vol.12S.Is sue on AHT S 西 南 农 业 学 报Sou th west China Journal of Agricultural Sciences
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转化的技术[5,6]。
1.2 基因枪转化法
1987年Sanford等人[7]建立的基因枪转化系统，由于不需制备原生质体，只需简单的组织培养技术以
及无明显的宿主限制等优点引起了人们的高度重视，对基因转移工作起到了极大的推动作用。1991年,Christou等[8]应用基因枪法，以水稻的幼胚为材料获得了成功；在此之后,Jun Cao等(1992)和Li Liang cai(1993)等[9,10]对水稻的基因枪转化系统作了进一步改进，提高了转化频率。郑宏红等(1996)[11]对提高籼稻基因枪转化频率进行的研究对水稻生产有着实际意义，并为籼稻基因工程的研究及应用提供了基础。另外，针对目前较多使用的单质粒载体转化系统存在的缺陷，戴顺洪等(1998)[12]采用共转化系统，让目的基因与选择标记基因分别位于2个载体质粒上转化水稻，经筛选后再生，获得了三转化的转基因植株(tri-transfo rmant)，这一探索的成功，将在分离世代中把无生产利用价值的标记基因分离出去，同时装入更多的外源基因。当前，基因枪法已成为水稻遗传转化的主要途径。但该方法同样存在转化成本高，效率低，容易产生嵌合体及细胞培养难等问题。
1.3 农杆菌介导转化法
关于圣诞节的ppt由于基因枪法存在上述缺点[5,13]，人们试图寻找一种更为简洁有效的转化方法。
长期以来的观点认为，单子叶植物不能产生合适的感受态细胞是不能被农杆菌转化的主要原因。九十年代初期，许多学者指出了在水稻转化中使用这一方法的新希望，再次尝试将农杆菌介导基因转移体系用于水稻的基因转移[4,14～16]，获得了一些转基因植株，他们认为转化前经化学物质(如酚类物质)预处理农杆菌，从而改善农杆菌对水稻细胞的亲和性是转化成功的关键。但由于当时转化效率还很低，加之一些报告缺乏必要的分子证据或分析数据，人们对农杆菌转化法仍存疑问[5]。
近年来，在根癌农杆菌转化单子叶植物方面取得了长足进步。Hiei等(1994)[17]报告利用根癌农杆菌转化粳稻得到了大量转基因植株，并提供了详细的分子生物学证据和遗传学证据; Rashid等、Dong等、Aldemita和Hodges以及Ishida等[18～21]于1996年再次证明了根癌农杆菌介导转化水稻的可行性和有效性。肖晗等(1997)[22]通过农杆菌介导籼稻转化获得了大量转基因籼稻植株，解决了籼稻转化的困难。刘巧泉等(1998)[23]还详细比较了根癌农杆菌转化水稻的各种条件，建立了优化的转化系统，得到了大量转基因可育植株。同时发现在没有酚类物质存在的情况下，仍有较高的稳定转化率，进一步指出选择合适的材料(如预培养4d的幼胚)作为受体才是转化成功的关键。随着人们对农杆菌侵染机理的进一步研究，农杆菌将对水稻的基因转移及遗传育种作出新的贡献。
除上述方法外，我国学者周光宇创立的花粉管通道法也曾引起人们的极大兴趣，并取得了令人注目的进展。但因其重复性和准确性问题，不同的研究者有不同的看法[24,25]。
2 基因转移的受体材料
愈来愈多的学者意识到基因转移的成功不仅需要好的转化技术，选择合适的供试起始材料同样必不可少。
基因转移最早以原生质体作为受体材料，因其容易转化受到了人们的青睐，但复杂的原生质体制备、培养和再生过程又限制了它的应用范围。
1985年,Horsch[1]首创叶盘法，开创了用植物外植体为材料进行转基因的新途径，省去
了复杂的原生质体制备和培养阶段，这是转基因植物研究中的一个重要里程碑。以后转化所用的外植体种类不断扩大，叶片(叶柄)、子叶(子叶柄)、胚轴、茎是转化成功用得最多的外植体材料。在90年代前尚无用合子胚、体细胞胚或胚性细胞转基因成功的充分证据。近年来，已有许多用分生组织，成熟盾片、幼穗及幼胚盾片来源的愈伤组织转化成功的报道[4,17,18,23]。经研究对比，大多数研究者认为幼胚品种差异小，比较容易培养和再生，而且在转化前的培养周期短，转化细胞比较容易再生成完整的转基因植株，是一种比较理想的转化受体材料，因而被广泛采用[11,12,23,26,27]。
最近，杨长登等(1998)[28]还以籼稻的单倍体微芽为受体进行转化，避开了显隐性的影响，没有杂合体产生。这一尝试为基因转移及受体的选择提供了新的思路。
基于转基因植株几乎都是杂合体，近年来，有人以花药为受体进行烟草遗传转化，以期获得外源基因纯合的转基因植株，但转化频率极低。迄今未见以水稻花药做受体获得转基因植株的研究报道。斯华敏等(1999)[29]
hungry则在此基础上，将花药培养与遗传转化相结合，现已成功建立了转基因水稻快速纯合的新技术体系。3 基因转移技术在水稻遗传改良上的应用
目前，基因转移在水稻遗传改良上应用主要集中在抗虫育种、抗病育种及抗除草剂育种等几个方面。
3.1 抗虫育种
由于化学农药防治法带来的农药残留问题、环境污染问题及害虫抗药性问题日益突出，选育抗虫品种防治害虫势在必行。常规的水稻抗虫育种取得了一定的进展，但因种种原因限制了进一步的发展。而采用基因工程技术将抗虫基因(如B.t.)等导入水稻培育抗虫品种潜力巨大。
苏云金芽孢杆菌内毒素蛋白基因(B .t .)是近年来使用最多的抗虫基因，已有许多采用基因枪法、农杆菌介导法、花粉管途径法将B .t .基因导入水稻，获得转基因植株的报道[30]。
另一抗虫基因—CpTI 基因具有广谱抗虫性，加上CpT I 的作用位点是在丝氨酸蛋白酶的催化中心，可以排除害虫通过突变而产生耐受性，因此，有学者认为将该基因转入水稻比B.
t .基因更有应用价值[31]。
雪莲外源凝集素(GN A)基因对人和哺乳动物的毒性较低，对同翅目害虫却有很强的抑制作用。杨长登等(1998)[28]
采用农杆菌介导法将GNA 转入水稻，获得转基因植株，经试验转基因植株表现抗稻飞虱。进一步说明可充分利用此基因进行水稻抗虫性的改良。
3.2 抗病育种
近年来，已通过花粉管途径法、基因枪法、电击法等转化途径将抗水稻条纹枯病毒的基因、抗菌肽B 基因、编码芪类合酶成的植物抗毒素基因等转入水稻，育成了高抗水稻条纹枯病、稻瘟病及白叶枯病的品种或品系[32～34]。
3.3 抗除草剂育种
除草剂的使用因需很高的要求限制了应用。而转基因水稻在改善杂草控制和提高作物产量上却有着很大的潜力。目前，基因枪法、PEG 法与有效的筛选方法相结合，已将bar 基因、突变的ALS 基因转入水稻，获得了抗Basta 、PPT 、Chlor sulfuro 等除草剂的可育转基因植株[9,26,35,36].此外，由于从Bacillus amy loliquef aciens 克隆的RNA 酶基因—barna 可用于诱49 高新专辑高方远等：植物转基因技术及在水稻遗传改良上的应用
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导农作物工程雄性不育，国内外学者先后用基因转移的方法将T A29-barna基因(花药绒毡层启动子与barna拼接而成)及P SI-barna基因(花粉启动子与barna拼接而成)导入烟草与油菜获得雄性不育植株[37～42]。在水稻上，凌定厚等(1998)[43]首次以基因枪方法获得转PS I-barna基因的工程雄性不育水稻植株，并从形态学、细胞学及分子水平上作了论述。这一技术的成功运用，将为开发多样性的雄性不育系及杂交种生产开辟一条新的途径。
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