CRISPR/Cas9 基因敲除技术
CRISPR （ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleas, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
Biomics专注于RNA基因调控多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导
下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。
z CRISPR与RNAi的区别
目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列，是可以遗传的。由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分，因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多，更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。
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作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9有以下特点和优势：
1、操作简单，靶向精确性更高。
sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZENs 更简单方便，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。
2、CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。
3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等
4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
5、无物种限制。
6、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。
Biomics提供以下CRISPR/Cas9专家系统服务
1、与客户协商根据靶序列设计RNA序列（3个工作日）；
Biomics具有丰富的sgRNA设计经验，提供的序列经过blast，优选脱靶效应最低的序列提交给客户。此外，为进一步提高sgRNA的特异性和降低脱靶效应，我们提供双切口sgRNA对设计（Figure1）。。
齐东野语翻译Figure 1.Schematic illustrating DNA double-strandedbreaks using a pair of sgRNAs guiding Cas9 D10Anickas (Cas9n).
2、客户根据自身需要选择sgRNA表达载体构建，或sgRNA体外转录合成（构建周期：10个工作日）
A、sgRNA表达载体构建，该构建载体为Biomics独有设计策略，连接效率更高，鉴定方法准确便捷。客户可以根据自身需要选择载体构建服务或直接购买试剂盒（Precut SgRNA Cloning kit & pSD-gRNA Plasmid）日语可恶
feel质粒pSD-gRNA专门用于在哺乳动物细胞中表达sgRNA，该质粒含CMV启动子驱动的GFP报告基因表达框，与Cas9表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能。此质粒由Biomics独立设计含氨苄抗性用于阳性克隆筛选，试剂盒提供预剪切线性质粒，客户可以直接进行连接筛选阳性克隆，降低了客户酶切质粒不完全导致假阳性克隆的出现几率。
B、sgRNA体外合成。
2012年12月1日客户可以根据自身需要选择sgRNA合成纯化服务或直接购买试剂盒（T7 sgRNA MICscript TM KIT&EzOmics TM RNA QUICK clear KIT-）
体外转录的sgRNA与质粒表达的sgRNA相比，更简便快捷，省去了质粒构建的步骤，整个操作过程仅需20h（包括过夜孵育）。转录纯化后的sgRNA可直接进行转染及细胞显微注射。
sgRNA 合成引物（反向引物设计为固定模式，由Biomics 提供）
PCR kit（e.g. pfu DNA polymera）
T7 sgRNA MICscript TM KIT
EzOmics TM RNA QUICK clear KIT-------一步纯化RNA转录产物
简单三步实现 sgRNA轻松合成
3、全基因组sgRNA文库的构建（用于全基因范围的基因打靶，构建突变体库）
根据客户提供的物种信息，进行生物信息统计
通过与客户协商，针对物种的全基因组进行RNA序列设计
根据设计结果合成RNA或构建sgRNA表达载体库
提供给客户sgRNA表达质粒和合成的RNA文库，设计报告，质粒及RNA质量分析报告。
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4、CRISPR/Cas9载体
Biomics已开发出多种cas9表达载体及其sgRNA共表达载体供客户选择，三种不同的突变用于不同的应用，例如双切口敲除、单切口敲除、抑制转录、启动子激活等。
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5、sgRNA活性检测长沙教育培训机构
Biomics提供多种sgRNA活性检测方法，包括SSA lucifera报告系统、Surveyor法、Q-PCR、突变点基因测序等
SSA检测：根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率，客户也可以选购BiomicsPrecut pSG-target
Cloning kit自行构建报告载体用于检测，Biomics提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。
检测原理：SSA报告质粒(pSG-target)中lucifera基因被终止密码子提前终止，这种截短的lucifera没有活性。为检测sgRNA的剪切活性，将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组重新形成有活性的lucifera（Figure 2），通过检测lucifera的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性（Figure 3）。
存档是什么意思
Figure 2. Restore disrupted lucifera function via sgRNA-mediated homologous recombination
Figure 3.Incread FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells.
Surveyor法及测序验证
CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致，都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有：靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法（Surveyor法）。八年级上册英语课件
Surveyor法即错配酶法：靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（主要是CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。
6、稳定表达Cas9蛋白细胞株筛选（Stable CAS9 Protein expressing cell line screening）
通过抗性基因的筛选，筛选出稳定表达的Cas9细胞系。使用该细胞系筛选sgRNA时，不需要额外转染表达Cas9的质粒，简化试验操作，提高试验的可重复性。
