64中国兽医杂志2020年(第56卷)第10期Chine Journal of Veterina/Medicine
CRIIPR-Cat结构及该系统介导的主要致病菌耐药机制的研究进展
潘思宇s党乔1，刘树明1>2>3，孔令聪^3，马红霞1>2>3
(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.动物生产及产品质量安全省部共建教育部重点实验室，
吉林长春130118； 3.吉林省新兽药研发与创制重点实验室，吉林长春130118)
中图分类号：S859.7文献标志码：A 兽医临床致病菌在抗微生物药物压力下不断进化、演变，部分菌株已对常用药物呈现多重耐药性，不但为兽医临床的抗感染治疗造成了困难，也对公共卫生安全造成了严重威胁［1］%通常耐药性
致病菌的产生由外排泵、产生灭活酶、携带耐药性质粒、可移动耐药原件及靶位置换等介导［2］%
但近年研究发现，主要致病菌的免疫系统在抗生素压力下不断进化，也可在一定程度上介导耐药性的产生％其中，聚类规则间隔回文重复序列(Clustered ogumriy interspaced shoO palindromic rv-peats，CRISPR-E vi)系统不仅能稳定病原微生物的遗传性，还参与细菌的生理等功能的调控，为此受到了国内
外学者广泛关注％该系统是原核生物基因组中的适应性免疫系统，能够有效抵抗外来基因组分的入侵，维持细菌基因信息的完整性［3］，是特异性核酸的靶向防御机制％CRISPR-E vi系统的免疫功能包括3个不同的机制阶段：适应、表达和干扰⑷％目前，该系统已广泛应用于基因编辑、细菌分型等诸多领域％但Gilt等首次发现了CRISPR-Cas系统可靶向外源DNA，有效阻止接合质粒的转化，在一定程度上减少了病原菌间耐药基因的传播⑸％从此,CRISPR-Cas系统介导的细菌耐药性及毒力研究引起国内外研究人员的高度关注％
1细菌CRISPR-Cas系统结构及功能
年末结转CRISPR-E vi系统是原核生物基因组中新近发现的一种免疫防御系统，广泛存在于细菌和古
收稿日期：2020—01—08
基金项目：国家重点研发专项计划(2016YFD0501301)&国家自然科学基金青年基金(31702293)&吉林省自然科学基金(2019020 1294JC)
xiao
作者简介：潘思宇(1996-)，女，硕士，从事细菌耐药机制的研究，E-mail：
通讯作者：马红霞,E-mail：hwyxe0731001@163-com
文章编号：0529—6005(2020)10—0064—03
菌［6］。该系统由CRISPR位点和Cas基因组成，根据不同种类Cas蛋白的不同功能，可将该系统分为三类⑷，即Typa IWI I%其中I型是整个系统中含有最丰富且复杂的蛋白系统，包含6个亚型，Cas3蛋白为最具有标记性蛋白;II型系统组分相对单一，启动免疫系统仅需要Cas9蛋白的参与［7］;III类系统包含两大标志基因，需要多个Cas蛋白共同作用切割目的基因⑷％
Cas蛋白通常携带能够结合聚合酶、核酸酶及解旋酶的功能域，参与免疫的多个阶段［4,9］%Stem-berg等解释了CRISPR-E vi免疫系统的工作原理，当一种细菌识别病毒或质粒侵入时，将外源DNA整合到CRISPR单元中作为新的间隔序列，再将CRISPR 单元转录为pra-crRNA，产生的crRNA与入侵病毒或质粒结合并使其沉默［10］，进而启动免疫系统％在适应阶段，外源DNA插入CRISPR位点的重复序列和间隔序列，这些序列被转录成crRNA%在靶向过程中，成熟的crRNAs与Cas蛋白组装破坏外源核酸［11］%在表达阶段，反式编码RNA和prawrRNA 结合为复合体与Cas9结合对靶向DNA进行切割［12］%在干扰阶段,D I类CRISPR系统中许多蛋白发挥相应的作用,Cas6蛋白参与crRNA的成熟及其前体的初加工，成熟后的crRNA与Cas复合体相结合对DNA进行靶向切割［13］(表1)%
2CRISPR-Cas系统对细菌耐药性调控作用
相关研究表明，完整的CRISPR-Cas系统不仅可有效地抵抗外来入侵物质，同时影响细菌包膜的完整性％Samp s on团队［14］通过改变脂质A介导的外膜蛋白及增加电荷，从而使菌株可对多黏菌素产
生相应抗性％Cas9缺陷株的生长能力在不同浓度抗生素压力下呈现不同趋势，而对Cas9回补株几乎没有影响％国内研究人员也证明，缺失Cas3基因的突变链球菌的生物被膜形成能力与野生株相比明显
Chine Journal of Vete/naj Medicine中国兽医杂志2020年(第56卷)第10期65
表1CRISPR-Cas系统组分及作用机理
类型亚型Cos组分蛋白标记基因作用阶段功能预测I-A Ca5，Ca6，Ca7，Ca8，C a5，Ca3
I-B Ca3，Ca5，Ca6，Ca7在干扰阶段，前一阶
I-C Cat,Cat,Cat,Cas8c段形成的复合体促进TYPEI Cas3适应及干扰阶段aRNA与外源DNA形I-D Cat,Cat,Cat,Cas8c成R环结构，具有解
I-E Cas3,Cs c1,Cs c2,Cat,Cat e,Cat旋酶和核酸酶功能
I-F Ca3，C y1，C y2，C y3
II-A Ca9在crRNA的成熟和靶标DNA的剪切中发
TYPE I
II-P Ca9Cas9干扰阶段挥重要作用且反式编
码小RNA，参与外源
基因的获取等功能
TYPE I I-A Cs m3,C c m4,Csm5,C c m6,Cas10,Cmrf,Cmrl
Ca$10,Cas6阶
抵抗外源性质粒以及
僵组词语病毒侵染，参与crRNA
的成熟和剪切靶向I-B Cmo4，Cmo5，Cmo6，Ca6DNA
减弱，同时对氟敏感性也显著增加［15］%
对于许多致病性细菌，抗生素耐药性主要是通过获得外源DNA介导且被编码整合于可移动元件上，包括质粒、基因岛及整合子等。已有研究报道, CRISPR-Cas与细菌耐药存在一定关系％McDonald 等［16］确定了70多弧菌科的多种不同的CRISPR-Cas系统类型，这些系统主要分布在可移动原件中，
VC系统也在整合酶基因岛附近％王琳琳(17)在多重耐药志贺菌中分别检测出四环素类、B-内酰胺类、氟座诺酮类等耐药基因，这些耐药基因均存在于CRISPR间隔序列较少的菌体内，进一步推测多重耐药株的CRISPR间隔物缺失可影响菌株获得多重抗生素耐药性。而CRISPR-Cas免疫系统的缺失可能会促进细胞在特定条件下的生存，例如在抗微生物药物的压力下抗性基因的获取等％关于粪肠球菌CRISPR-Cas系统与耐药适应性的相关报道表明，该系统的部分缺失与获得性耐药呈正相关［18-19］%已报道粪肠球菌含有一些能够独立复制的质粒和致病岛，这些元件上均分布了抗性基因与毒性因子,CRISPR-Cas系统以上述元件为靶向位点，并检测到粪肠球菌中存在相关耐药基因［21］%此外，Palme/21〕发现构成多重耐药肠球菌的基因组中，25%来自可移动元件，且与CRISPR间隔序列高度一致，促进质粒自身转移进一步影响染色体的编码及Cas位点移动和部分碱基突变，从而使肠球菌产生获得耐药性，为此强调CRISPR在肠球菌内整合基因组的重要性％对表皮葡萄球菌的研究发现，非致病性菌体缺乏CRISPR序列，而在携带质粒的致病性菌体内检测到CRISPR序列，能够有效的阻止接合质粒的转移，在一定程度上减少了耐药基因在病原菌间的转移［5］%同时,Eva等切在弗朗西斯菌中发现了存在于II型系统中的一种scaRNA，不同于tracrRNA和crRNA的作用机理，这种小分子由Cas9介导使RNA相互作用降低蛋白转录，从而抑制抗原的表达并降低宿主促炎性反应％综上所述，不同菌种的CRISPR系统均参与了细菌耐药性的调控，为日后细菌耐药性的研究提供了重要的理论基础％
另外,CRISPR系统除了抵御外来物质入侵外，还能控制内源性转录，参与调解细菌致病性［22］% CRISPR系统的缺失可明显导致细菌致病性的变化％最新研究表明,Cas9的缺失可降低细胞上皮细胞粘附，影响数种调控毒力的蛋白表达，而Cas9作为毒力因子的作用机制尚不明确，推测Cas9基因与编码毒力决定因素的基因协同调控病原菌的毒力性，同时抑制毒性决定基因的转录［12］%CRISPR系统不仅能增强生物膜形成能力，同时Cas9还参与了宿主先天免疫的逃避通路并有效抑制抗原的表达，这种天然机制也使细菌逃避多种宿主受体的免疫机制而提高自身毒力［14］%此外，值得注意的是缺乏CRISPR序列的菌株拥有更多的原噬菌体,CRISPR 靶标的分析表明，间隔序列与其原噬菌体靶标之间存在相互排斥的关系，干扰毒力因子在病原菌间转移［23］，这说明CRISPR-Cas可拮抗原噬菌体的插入，
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从而影响病原体的进化，但其二者相互影响及作用机制仍需进一步开展研究。
3展望
CRISPR-Eas系统作为细菌常在的天然免疫防御系统，一方面，CRISPR免疫系统阻止抗生素抗性基因和毒力基因向病原菌转移，从而降低病原菌的进化能力；另一方面，该系统能有效对抗入侵的外源性遗传物质，其独特的功能特性不仅调控微生物耐药适应性并介导耐药基因与毒力基因的表达。本实英语六级听力真题
验室针对革兰阳性和阴性多重耐药致病菌，如肠球菌、巴氏杆菌及肺炎克雷伯菌等进行CRISPR-Eas系统的检测，结果与已报道结论相似% CRISPR-Eas缺失株与野生株相比，Cas基因的缺失不仅影响细菌的耐药性同时潜在的使部分耐药基因发生表达沉默，部分功能基因表达量发生显著上调，间接影响细菌在抗生素压力下的生长速率，但CRISPR-Eas是如何介导致病菌耐药性及其相关机制仍需要我们进一步展开研究％不同生物体内的CRISPR免疫通路与执行相应功能蛋白有所不同，Cas蛋白家族在实现精确整合CRISPR序列的功能上发挥着重要作用，通过与向导RNA和筛选标记结合，可快速筛选出全基因组范围内潜在的靶点基因，以期为分子生物领域研究提供重要的基因工具％
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