单细胞悬液制备⽅法汇总
⼀、外周⾎样本
（图⽚来源⽹络）
⼈外周⾎单个核细胞（Peripheralblood mononuclear cells ，PBMCs ）的分离制备：
1）医院及其⾎液中⼼采取的新鲜的肝素抗凝的2ml外周静脉⾎备⽤；
2）将肝素抗凝的静脉⾎⽤等体积的PBS稀释并充分混匀；
3）将⼈淋巴细胞分离液ficoll从 4 °C 取出，恢复⾄室温，取4ml转移⾄15ml 试管中备⽤；
4）⽤⽆菌吸管吸取稀释后的静脉⾎，沿管壁缓慢⼊⾄⼈淋巴细胞分离液液⾯上
（ficoll分离液：抗凝⾎1:1），缓缓地不要晃荡，保持界⾯的清楚；
5）将加完外周静脉⾎后的 50 ml 试管放⼊台式离⼼机中，2200 rpm ⽔平离⼼，
室温 25 min，注意离⼼机升降速都调⾄最慢，降速设置中⼀定要设置成no break，或者只有1成的制动。
6）离⼼完毕后，⼩⼼取出15 ml 试管，离⼼后管内可分为三层，在上、中层界⾯处有⼀层以单个核细胞为主的⽩⾊云雾层狭窄带，即为我们所需要的单个核细胞；
7）⽤⽆菌吸管吸取⽩⾊云雾层狭窄带的单个核细胞，并置于另⼀ 15 ml 离⼼管
中，加⼊5mlPBS，1500 rpm，室温离⼼ 5min，并充分洗涤细胞两次；
8）末次离⼼后，弃去上清，加⼊完全 RPMI 1640 培养液重悬细胞，充分混匀；
9）⽤⽩细胞计数液计数单个核细胞，根据实验所需，加⼊完全 1640培养液调整细胞浓度到所需要的浓度。
⼆、组织样本
（图⽚来源⽹络）
常见的组织类型：⼩⿏脾脏、肝脏、⼼脏、肺脏、脑组织、肿瘤组织、⼈肿瘤组织、⽪肤组织……
传统组织处理⽅法：
机械法：⽹搓法、研磨法
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适⽤样本类型：脾脏、淋巴结、胸腺
⽹搓法
1、将300 ⽬尼龙⽹扎在⽆菌的⼩烧杯上；
2、把剪碎的组织放在⽹上，以眼科镊⼦轻轻搓组织块，边搓边加⽣理盐⽔冲洗，直到将组织搓完；
3、收集细胞悬液于离⼼管中， 1500rpm离⼼5min；
4、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作⽤5min ，加等体积的PBS 中和后，1500rpm 离⼼5min ，弃上清，⽤PBS 洗涤⼀次，再⽤PBS 重悬，细胞计数后即可使⽤。
研磨法
1、先将组织剪成1-2mm ⼤⼩组织块；
2、放⼊组织研磨器中，转动研棒，研⾄匀浆；
3、加⼊10ml ⽣理盐⽔，冲洗研磨器；
grounds4、收获细胞悬液，并经200⽬尼龙⽹过滤，1500rpm 离⼼5min ；
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5、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作⽤5min ，加等体积的PBS 中和后，1500rpm 离⼼5min ，弃上清，⽤PBS 洗涤⼀次，再⽤PBS 重悬，细胞计数后即可使⽤。
酶解法：胰蛋⽩酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋⽩酶
适⽤样本类型：肝脏、肾脏、⼼脏、肺脏、脊髓、脑、肠道、⽪肤、肿瘤等；
操作步骤：
1、先将组织剪成泥状。
2 、⽤胰蛋⽩酶或胶原酶消化组织块，胰蛋⽩酶适⽤千消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上⽪、肝、肾等组织。胰蛋⽩酌⼯作浓度⼀般为 0. 1 %—0 . 5 % 。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常⽤0 . 25 %胶原酶，胶原酌对组织中胶原蛋⽩类结构消化作⽤强，它仅对细胞间质有消化作⽤⽽对上⽪细胞影响不⼤。胶原酶常⽤浓度为 0 . 1—0 . 3ug / ml ，⽤⼤于组织量30—50 倍的胰蛋⽩酶液或胶原酶液在 37°C ，摇床上消化组织，消化时间的长短依组织类型⽽定，⼀般来说，胰蛋⽩酶油作⽤ 20—60 min ，胶原酶需1—4h 左右，⼀般还会加⼊DNA 核酸内切酶。
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3、消化完毕后，将细胞悬液通过200⽬孔径尼龙⽹过滤，以除掉未充分消化的组织；
4、已过滤的细胞悬液经1500rpm 离⼼5min 后，弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作⽤5min ，加等体积的PBS 中和后，1500rpm 离⼼5min ，弃上清，⽤PBS 洗涤⼀次，再⽤PBS 重悬，细胞计数后即可使⽤。
下表整理了⼈和⼩⿏常见的不同组织处理⽅法，并附上参考⽂献，此内容来源于Worthington ：Species Cells
Enzyme(s)Reference Human 脂肪细胞2型胶原酶:0.01-0.5%Effect of Collagena
Concentration on The Isolation
of Small Adipocytes from Human
Buccal Fat Pad., J Oral Sci ,
2018
Human 脂肪细胞Collagena Type 1: 0.1%Epigenome-wide Association
Study of Body Mass Index, and
the Adver Outcomes of
Adiposity, Nature541, 81, 2017
Human 基质细胞胶原酶2型:0.075%Ultrasound-Assisted Liposuction
Provides a Source for
Functional Adipo-Derived
Stromal Cells., Cytotherapy 19,
1491-1500, 2017
Human ⾻髓基质细胞 胶原酶1型:0.075%Menchymal Stromal Cells
Protect Human Cardiomyocytes
from Amyloid Fibril Damage, Cytotherapy 19, 1426-
1437, 2017
Human
间充质⼲细胞胶原酶2型:0.2%Adipogenic Differentiation of
Menchymal Stem Cells Alters
Their Immunomodulatory
Properties in a Tissue-Specific Manner., Stem Cells 35, 1636-1646, 2017
Human脂肪源内⽪
细胞胶原酶1型:0.1%Autologous Cell Sources in
Therapeutic Vasculogenesis: In
Vitro and In Vivo Comparison of
Endothelial Colony-Forming
Cells from Peripheral Blood and
Endothelial Cells Isolated from
Adipo
Tissue., Cytotherapy 18, 242-52,
2016
Human脂肪⼲细胞胶原酶1型:0.1%High Gluco-Induced Reactive
Oxygen Species Generation
Promotes Stemness in Human
Adipo-Derived Stem
Cells,Cytotherapy 18, 371-83,
2016
Human⾻髓基质细
胞胶原酶4型:0.2%Effect of Mild Heat Stress on the
Proliferative and Differentiative
Ability of Human Menchymal
Stromal Cells., Cytotherapy17,
359-68, 2015
Human脂肪⼲细胞胶原酶2型:0.1%Expression Analysis of Human
Adipo-Derived Stem Cells
During In Vitro Differentiation to
an Adipocyte Lineage., BMC
Med Genomics 8, 41, 2015
Human脂肪基质胶原酶1
型:0.075%Therapeutic Potential of
Adipo-Derived SSEA-3-Positive Mu Cells for Treating Diabetic Skin Ulcers.,Stem Cells Transl Med 4, 146, 2015
Human脂肪组织细
胞胶原酶1型:0.1%Differential Effects of Processing
Time and Duration of
Collagena Digestion on
Human and Murine Fat
Grafts.,Plast Reconstr Surg 136,
189e-199e, 2015
Human脂肪基质⾎
管细胞中性蛋⽩酶:2.4
u/ml
胶原酶:250 u /
毫升
nutshellHuman White and Brite
Adipogenesis is Supported by
MSCA1 and is impaired by
Immune Cells., Stem Cells 33,
1277-91, 2015
Human脂肪源性间
充质⼲细胞胶原酶2型:0.1% Defined Serum-Free Media for
In Vitro Expansion of Adipo-
DerivedMenchymal Stem
canflyCells., Cytotherapy 16, 915,
2014
Human脂肪提取⼲
细胞胶原酶1
型:0.15%
Choosing the Right Type of
Serum for Different Applications
of Human Adipo Tissue-
Derived Stem Cells: Influence
on Proliferation and
Differentiation
Abilities.,Cytotherapy 16, 789,
2014
Human间充质基质胶原酶1型:0.1%Proliferative and Phenotypical
Characteristics of Human
Adipo Tissue-Derived Stem
Cells: Comparison of Ficoll
Gradient Centrifugation and Red
Blood Cell Lysis Buffer Treatment Purification Methods., Cytotherapy 16, 1220-8, 2014
Human脂肪间质⼲
细胞动物游离胶原
酶:200u /ml
Xenofree Enzymatic Products for
the Isolation of Human Adipo-
Derived Stromal/Stem
Cells., Tiss Eng 19, 473-8, 2013
Human基质⾎管成
分胶原酶1
型:0.075%
Stromal Vascular Fraction
Isolated from Lipo-Aspirates
Using an Automated Processing
System: Bench and Bed
Analysis., J Tissue Eng Regen
Med 7, 864, 2013
Human脂肪⼲细胞胶原酶1型:0.1%Platelet-Rich Plasma Greatly
Potentiates Insulin-Induced
Adipogenic Differentiation of
Human Adipo-Derived Stem
Cells Through a
Serine/Threonine Kina Akt-
dependent Mechanism and
Promotes Clinical Fat Graft
Maintenance., Stem Cells Transl
Med 1, 206-20, 2012
Human⾎管周围⼲
细胞胶原酶2型:0.1%An Abundant Perivascular
Source of Stem Cells for Bone郑州美国留学>芝加哥大学商学院
Tissue Engineering., Stem Cells
Transl Med 1, 673, 2012
Human脂肪来源的
学习商务英语要多久间质⾎管胶原酶1型:0.1%Conci Review: Adipo-
Derived Stromal Vascular
Fraction Cells and Platelet-Rich
Plasma: Basic and Clinical
Implications for
TissueEngineering Therapies in
Regenerative Surgery., Stem
Cells Transl Med 1, 230-6, 2012
Mou脂肪基质胶原酶1型:0.1% Adipo Stromal Vascular
Fraction-Mediated Improvements
at Late-Stage Dia in a
Murine Model of Multiple
Sclerosis., Stem Cells 35, 532-
544, 2017
Mou脂肪间质细
胞胶原酶2型:0.2%Adipo Menchymal Stromal
Cells Minimize and Repair
karosRadiation-Induced Oral
Mucositis.,Cytotherapy 18, 1129-
45, 2016
Mou脂肪基质胶原酶1型:0.1%Improved Mobilization of
Exogenous Menchymal Stem
Cells to Bone for Fracture
Healing and Sex
Difference., Stem Cells 34, 2587-
2600, 2016
Mou脂肪细胞胶原酶:0.1%The Effects of A Single
Developmentally-Entrained
Pul of Testosterone in Female
Neonatal Mice On Reproductive
and Metabolic Functions in Adult
Life., Endocrinology 156, 3737,
2015
Mou间质⾎管细胶原酶2型:0.2%Natural Killer T Cells in Adipo
胞 Tissue are Activated in Lean
Mice., Exp Anim 62, 319, 2013
Mou脂肪⼲细胞胶原酶2型:0.1%Biological and Clinical
Availability of Adipo-Derived
Stem Cells for Pelvic Dead
Space Repair., Stem Cells
Transl Med 1, 803, 2012
三、贴壁细胞
（图⽚来源⽹络）
贴壁细胞（adherent cells）：活体体内细胞当离体置于体外培养时⼤多数以贴壁⽅式⽣长，主要包括正常细胞（例如：成纤维细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞、⼼肌细胞以及肝、肺、肾、乳腺、⽪肤细胞等）和肿瘤细胞。
胰蛋⽩酶消化
胰蛋⽩酶：最常⽤，浓度⼀般0.25%-5%，37℃消化时间⼀般1-5min，⽤⾎清终⽌；
四、脱落细胞
（图⽚来源⽹络）
临床上常见的脱落细胞经过简单处理就能制备成单细胞悬液，⽤于后续实验，具体操作：
1、⾷管拉⽹细胞的单细胞悬液的制备：
（1）将⾷管拉⽹器上的细胞洗脱到10ml PBS液中， 1500rpm，5min离⼼后，再⽤PBS液洗2次，800rpm，离⼼2min，弃上清；
（2）再加⼊PBS液5ml，以300⽬尼龙滤⽹过滤，离⼼沉淀去上清；
（3）加少许PBS液混匀沉淀细胞，备⽤。
2、胸、腹⽔脱落细胞的制备
（1）抽取胸、腹⽔50ml，加⼊1000U/ml肝素液1ml，放盐⽔瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；
（2）将底部10~20ml⽤长吸管移⼊试管中，⽤PBS液洗3次，以1500r/min离⼼沉淀5min；
（3）再加5ml PBS液混匀，⽤300⽬尼龙滤⽹过滤，离⼼沉淀去上清；
（4）加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备⽤。
3、冲洗液细胞样品的制备
（1）⽤300~500ml⽣理盐⽔冲洗膀胱，冲洗⼀定时间后，吸出冲洗液放⼊容器中于冰箱内置6~12h；
（2）取沉淀液20~40ml，离⼼沉淀并以⽣理盐⽔洗2次，吸上清；
（3）加10ml PBS液，混匀，以300⽬尼龙滤⽹过滤，离⼼沉淀去上清；
（4）过滤后1000rpm/min，10min，离⼼沉淀，去上清；加固定液或低温保存备⽤。
