基金项目：国家自然科学基金(编号：81173213/H2708)；湖南省科技厅科技计划项目(编号：2014SK3242)通讯作者：陈新宇。E-mail ：*********************
JNK 信号通路抑制剂体内应用方法研究
陈新宇1，杨
浩2，蔡虎志2，卢青1，陈青扬2，陈毅君2
(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；
2.湖南中医药大学，湖南长沙410208)
【摘要】目的
探讨JNK 信号通路抑制剂(SP600125)体内长期实验的应用方法。方法
card是什么意思
将40只新西兰兔
随机分为八组：空白对照组、模型对照组、JNK 高剂量组、JNK 低剂量组、JNK 空白组、DMSO 模型组、DMSO 空白组、阳性对照组。自实验第一天开始各组给予相应处理，连续4周。4周末检测实验兔心肌组织JNK 总蛋白及蛋白磷酸化和基因表达水平。结果
世界末日 英文
经阿霉素干预后，各组实验组心肌P-JNK 表达均不同程度上调，其中以模型
cyan对照组、DMSO 模型组上调最为明显(P <0.05)。JNK 低、高剂量组和阳性对照组心肌P-JNK 表达水平上调较模型对照组缓慢(P <0.05)，其中以JNK 高剂组心肌P-JNK 水平上调最为缓慢(P <0.05)。各实验组间JNK 总蛋白、JNK mRNA 表达差异无统计学意义(P >0.05)。结论
连续4周小剂量皮下注射JNK 信号通路抑制剂可以显著下调
p-JNK 的表达，该方法能够为体内长期实验研究提供思路。
【关键词】JNK 信号通路；抑制剂；DMSO ；体内应用【中图分类号】R -332
【文献标识码】A
【文章编号】1003—6350（2015）08—1093—04
In vivo application method of JNK signal pathway inhibitor (SP600125).CHEN Xin-yu 1,YANG Hao 2,CAI Hu-zhi 2,LU Qing 1,CHEN Qing-yang 2,CHEN Yi-jun 2.1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chine Medicine,Changsha 410007,Hunan,CHINA;2.Hunan University of Traditional Chine Medicine,Changsha 410208,Hunan,CHINA
【Abstract 】Objective To explore the method for the long-term in vivo application of JNK signaling pathway in-hibitor (SP600125).Methods
Forty New Zealand rabbits were randomly divided into 8groups:blank control group,
model control group,high-do JNK group,low-do JNK group,JNK blank group,DMSO model group,DMSO blank group,positive control group.All the experimental groups received the corresponding treatment for 4weeks.After 4weeks,the myocardial tissues of experimental rabbits were parated under anesthesia,and JNK total protein and p-JNK protein were measured bn Western blot.JNK mRNA expression was measured by RT-PCR.Results After intervention of ADR,myocardial P-JNK expression in each experimental group incread to different degrees,and the increas in the model control group,DMSO model group were the most significant (P <0.05).Compared with model control group,the increas in myocardial P-JNK expression in low-dos
e JNK group,high-do JNK group and positive con-trol group were less significant (P <0.05),and the myocardial P-JNK levels in high-do JNK group incread most slowly (P <0.05).The total protein of JNK,JNK mRNA expression of the experimental groups showed no significant difference (P >0.05).Conclusion
Low-do subcutaneous injection of JNK signaling pathway inhibitor for four
weeks can significantly lower the expression of p-JNK.
【Key words 】JNK signaling pathway;Inhibitor;DMSO;In vivo application
·论
著·
JNK 信号传导通路是MAPK 信号通路家族成员
之一，它是广泛存在哺乳动物细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞外界信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者，在众多的疾病进展过程中起着重要的作用。国内外学者已经较深透的探究了该信号通路，在对于该信号通路的研究过程中，抑制剂的应用是最常见的研究思路。
JNK 信号通路抑制剂(SP600125)是丝/苏氨酸激酶广谱抑制剂，有效抑制c-Jun 氨基末端激酶(JNK)，其体外实验和体内短期实验已较为成熟，但体内长期实验如何应用SP600125来干预JNK 的通路蛋白则罕有报道。本实验旨在探索长期体内应
doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0393
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·1093
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用JNK信号通路抑制剂(SP600125)的方法，为相关研究提供理论基础。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1动物健康普通级雄性新西兰兔40只，质量(1.85±0.11)kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。动物许可证批号：SCXK(湘)2009-0012。在自由饮食、光/暗周期为12h/12h(光照时间为6:00~18:00)、背景噪音为(40±10)dB、温度(20±3)℃条件下饲养1周以适应环境。
1.1.2主要药物与试剂(1)阿霉素：深圳万乐药业有限公司生产(H44024359)；(2)乌拉坦：山东齐鲁兴华制药有限公司(H37022259)；(3)生理盐水：湖南科伦制药有限公司(H43020455)；(4)依那普利：江苏扬子江药业(H31021937)；(5)JNK抑制剂：美国SELLECK公司；(6)P-JNK抗体：美国Santa Cruz公司(sc-12882)；(7)JNK抗体：美国Santa Cruz公司(sc-572)；(8)DMSO：美国SELLECK公司。
1.2方法
1.2.1分组采用完全随机分组设计，将40只实验兔按体重从小到大排列，用记号笔在右耳内侧进行编号，查随机数字表，将实验兔随机分为8组，分别为：空白对照组、模型对照组、JNK高剂量组、JNK低剂量组、JNK空白组、DMSO模型组、DMSO空白组、阳性对照组，每组实验兔5只。
1.2.2JNK病理模型表达诱导参照文献[1-2]，将注射用盐酸阿霉素用生理盐水稀释成1.0mg/ml溶液，模型对照组、JNK高剂量组、JNK低剂量组、DMSO 模型组、阳性对照组耳缘静脉注射，每次1.0ml/kg，每周2次，连续4周。同时，空白对照组、JNK空白组、DMSO空白组中实验兔耳缘静脉注入0.9%生理盐水1ml/kg。
1.2.3给药方法将JNK抑制剂SP600125用DMSO配成1mg/ml母液，于耳缘静脉注射阿霉素的第一天开始，JNK低剂量组、JNK高剂量组、JNK空白组分别按照20μg/(kg·d)、40μg/(kg·d)、40μg/(kg·d)配以生理盐水1ml进行皮下注射。DMSO模型组、DMSO空白组按40μl/(kg·d)配以生理盐水1ml进行皮下注
射；阳性对照组按人-兔体表面积换算后依那普利按5mg/(kg·d)配以蒸馏水10ml进行灌胃[3-4]。空白对照组以等量生理盐水处理。各组连续干预4周。
1.3样本采集与检测
1.3.1心肌组织总蛋白质提取为观察及检测模型兔各项指标的的变化，将实验兔麻醉处死后迅速取左心室面心肌组织，置于干冰暂时冻存。把冻存的心肌组织转移至预先称质量的离心管中，称出样品的质量。然后按照约1:8(质量：体积)的比例加入组织裂解液混合，冰浴上机械匀浆，涡旋混匀，静置1h，18000×g、4℃离心30min，取上清即为组中的总蛋白质，按Bradford方法测定蛋白质浓度，然后分装，-70℃保存备用。
1.3.2Western-blot检测将50μg的心肌总蛋白加入2×SDS上样缓冲液(0.1mol/L Tris pH6.8，0.2mol/L DTT，4%SDS，20%甘油，0.02%溴酚兰)，100℃变性8min，上样，恒定电流，前15min16mA/gel 电泳，然后32mA/gel电泳至底部。电转印按膜面积(0.8mA/cm2)设定电流，转膜2h。然后再用含3%脱脂奶粉的TBST室温封闭2h。将膜取出，置于杂交袋中，分别加入抗JNK、P-JNK抗体，4℃过夜。TBS-Tween20漂洗10min×3次，将膜取出，置于另一杂交袋中，加入酶标二抗，室温杂交2h。TBST漂洗10min×3次。ECL曝光显像、扫描、保存并分析。
1.3.3RT-PCR分析取左心室面心肌组织，参照TRI quick Reagent说明书，采用Trizol试剂一步法提取
心肌组织的总RNA，紫外分光光度计测定RNA 的纯度并定量。然后根据Genebank中JNK基因序列进行引物设计，依照PCR反应试剂盒说明书进行JNK基因表达的RT-PCR分析。最后凝胶成像系统分析，计算光密度值。基因序列引物设计如下：JNKmRNA GenBank：AF014401.1；LEFT PRIMER 5'-CCGTCAGAATAAC-GAGACAAAAT-3'；RIGHT PRIMER5'-AAGCCAGAGTCCTTCACAGACAA-3'；PRODUCTSIZE:101；GADPH GenBank:AF261085.1；LEFTPRIMER5'-ACCTTCAACACC-CCAGCCATGT ACG-3'；RIGHTPRIMER5'-CTGATCCACATCT-GC T GGAAGGTGGCA-3'；PRODUCTSIZE:134。
1.4统计学方法所有数据资料进行正态性检验，用SPSS17.0统计分析软件包进行处理，计量资料均采用均数±标准差(x
-±s)表示，多组均数组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时采用LSD法，若方差不齐时采用Tamhane'T2法，显著性水准P=0.05。
2结果
2.1动物数量变化实验过程中，DMSO模型组、JNK高剂量组因反复腹泻，于实验结束前各死亡一只实验兔，考虑死亡原因为阿霉素推注速度过快引发急性中毒所致，正常对照组均生长良好。
··1094
2.2实验后各组间心肌JNK 的表达实验后各组实验兔的心肌JNK 表达见表1、图1。表1显示阿霉素干预后，各组心肌P-JNK 均不同程度上调，与正
常对照组比较差异具有统计学意义(P <0.05)，其中以模型对照组上调最为明显(P <0.05)。JNK 低、高剂组和阳性对照组心肌P-JNK 表达水平上调较模型对照组缓慢(P <0.05)，其中以JNK 高剂组心肌P-JNK 水平上调最为缓慢(P <0.05)。DMSO 对照组及空白组心肌P-JNK 水平分别与模型对照组、空白对照组比较差异无统计学意义(P >0.05)；各组实验兔各组间JNK 总蛋白水平和JNK mRNA 水平比较差异无统计学意义(P >0.05)。这表明模型对照组JNK 磷酸化蛋白上调，DMSO 和JNK 抑制剂对于正常心肌
JNK 磷酸化蛋白表达无影响，但经过依那普利和JNK 抑制剂干预后的各组实验兔的JNK 磷酸化蛋白均较模型对照组均有所下降，其中JNK40µg/kg 较20µg/kg 效果明显。
3讨
论
MAPK 信号通路广泛存在哺乳动物细胞内的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，其可被一系列的细胞外信号及刺激而激活，经大量的研究证实其与多种疾病的发生发展密切相关。JNK 信号通路是MAPK 信号通路的成员之一，它是细胞外界信号由细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者[5]。经国内外学者证实JNK 的基因主要有三个亚型，即JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2在组织中广泛表达，JNK3仅在脑、心和睾丸中表达[6]。大量的基础研究证实的JNK 信号通路参与了细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架构建、细胞凋亡和细胞恶变等多种生物学反应，其主要通过JNK 磷酸化蛋白的表达来调控相关反应[7-8]。国内外学者以该通路为突破口，对于许多疾病的病因开始探索，如Bogoyevitch 等证实了在慢性心衰的动物模型中JNK 的表达升高[9]；研究还证实高血压导致的心脏疾病中有p38和JNK 的激活，同时在心肌细胞中表达JNK 的上游激活因子，可以抑制心肌细胞肥大反应，延缓心力衰竭[10]；在衰竭的心肌细胞中活性氧簇(ROS)可以刺激位于JNK 和p38上游区的细胞凋亡信号激酶-l ，它的过度表达激活核因子κB (NF -κB)可导致心肌肥厚，以及促进凋亡信号激酶的激活进而导致心肌细胞凋亡[11-12]。
在细胞信号通路是实验研究中，抑制剂具有无可替代的地位。SP600125是ATP 竞争性的c-Jun 氨基末端激酶(JNK)选择性抑制剂，可显著抑制JNK 介导的MAPK 激活。同时SP600125也是一种高选择性JNK 抑制剂，可作用于JNK1，JNK2和JNK3，经证实，比作用于MKK4选择性高10倍，比作用于MKK3、MKK6、PKB 和PKC α选择性高25倍，比作用于ERK2、p38、Chk1、EGFR 等选择性高100
倍。目前现有文献报道的抑制剂的使用方法主要方法为体外的激酶实验、细胞实验以及在体动物实验。体外激酶实验和细胞实验证实SP600125可作用于多种细胞，如：Jurkat T 细胞、从人脐血或外周血分离的Th0细胞等，抑制c-Jun 磷酸化、抑制细胞活化和分
化，且抑制炎症多种因子的表达，如：COX -2、IL -2、IL -10、IFN -γ和TNF -α的表达[13-15]。相关研究显示SP600125也抑制香烃受体(AhR)Mps1，和一系列其他
表1
实验后各组间心肌JNK 的表达(x -±s )组别空白对照组模型对照组
dertJNK 低剂量组JNK 高剂量组JNK 空白组
DMSO 模型组DMSO 空白组阳性对照组
只数55
545
455
ffgJNK/Actin10.29±0.0050.28±0.002
a
0.28±0.002a 0.29±0.003a 0.29±0.001a 0.29±0.003a 0.28±0.002a 0.29±0.002
a
P-JNK/Actin20.37±0.0110.77±0.010
b
0.64±0.012bc 0.56±0.012bcef 0.28±0.011bce 0.76±0.010bde 0.38±0.012acef 0.70±0.012
bce
JNK mRNA/GADPH 0.27±0.0200.28±0.019
a
0.28±0.018a 0.27±0.020a
0.28±0.018a 0.26±0.020a 0.27±0.019a
0.27±0.018
a
allay
注：与正常对照组比较，a
望洋兴叹翻译
P >0.05，b
P <0.05；与模型对照组比较，c
P <0.05，
d
P >0.05；与JNK 低剂组比较，e P<0.05；与JNK 空白组比较，f
P <0.05
。
图1JNK 的表达
adults注：各图中条带从左向右依次为：空白对照组、模型对照组、JNK 高剂
量组、JNK 低剂量组、JNK 空白组、DMSO 模型组、DMSO 空白组、阳性对照组。
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丝/苏氨酸激酶，包括Aurora激酶A、FLT3、MELK和TRKA[16-18]。
SP600125的体内应用研究亦有部分报道，但使用方法多为大剂量静脉注入或口服后，在短时间内即处死实验动物，如：仇爱刚等[19]在SP600125对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的研究中，在术前半小时腹腔注射SP60012515mg/kg。目前尚无抑制剂长期体内小剂量应用的文献报道，因此若要长期观察慢性疾病动物模型的病理发展过程和SP600125对其的干预作用，则需要更多有价值的实验和文献来体现。本研究采用阿霉素法诱导JNK信号通路发生异常改变，摸索出SP600125在体内长期实验过程中较为合适的使用方法，能够为相关基础研究提供一定的理论依据和研究思路。
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(收稿日期：2014-11-16)
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